吳天斌 林桂涵 陳春妙 程楓 毛衛(wèi)波 紀(jì)建松

甲狀腺乳頭狀癌（papillary thyroid carcinoma，PTC）是最常見的甲狀腺癌亞型，其發(fā)病率在全球范圍內(nèi)已呈快速增長趨勢(shì)[1]。盡管總體預(yù)后良好且5年生存率高達(dá)95%以上，但仍有10%～20%患者在10年隨訪過程中表現(xiàn)出侵襲性臨床行為且不遵循惰性病程，如碘難治性、復(fù)發(fā)、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，甚至死亡[2]。隨著分子遺傳學(xué)的進(jìn)步，各種基因改變被揭示可用于輔助診斷和預(yù)測(cè)患者預(yù)后。BRAFV600E基因突變是甲狀腺癌中最常見的基因突變類型，也是PTC 中腫瘤侵襲性和預(yù)后的重要分子標(biāo)志物[3]。目前，臨床上對(duì)于BRAFV600E基因突變狀態(tài)的檢測(cè)主要是基于穿刺活檢或術(shù)后獲取的腫瘤組織樣本，存在一定的創(chuàng)傷性和滯后性[4]。雙能量CT檢查可在顯示常規(guī)形態(tài)學(xué)特征的同時(shí)，量化反映不同組織在能量學(xué)范疇的差異，提供諸多反映生物學(xué)特性的定量參數(shù)[5]。本研究旨在探討雙能量CT 檢查在術(shù)前預(yù)測(cè)PTC 患者BRAFV600E基因突變的可行性，并分析不同參數(shù)及聯(lián)合模型的診斷效能，從而為臨床實(shí)踐提供有價(jià)值的參考依據(jù)。

1 對(duì)象和方法

1.1 對(duì)象 回顧2017年5月至2021年10月麗水市中心醫(yī)院經(jīng)手術(shù)病理檢查證實(shí)的甲狀腺癌患者213 例，男69 例，女144 例，年齡22～75（41.25±13.32）歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）經(jīng)術(shù)后病理檢查證實(shí)為PTC；（2）術(shù)后組織標(biāo)本均行BRAFV600E基因突變狀態(tài)分析且有明確的結(jié)果；（3）術(shù)前2 周內(nèi)接受雙能量CT 檢查。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）臨床病理數(shù)據(jù)不完整；（2）其他病理類型的甲狀腺惡性腫瘤；（3）圖像偽影明顯，無法獲取雙能量數(shù)據(jù)。本研究經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（2022-318 號(hào)）。

1.2 方法 所有患者均采用第三代雙源CT（德國西門子公司，SOMATOM FORCE）行雙能量CT 檢查，患者取仰臥位，行頭足方向掃描，范圍從顱底到主動(dòng)脈弓，先行常規(guī)平掃，掃描參數(shù)：管電壓為120 kVp，管電流為180 mAs，層厚1.5 mm，間距1.5 mm，開啟Care Dose 4D 技術(shù)。增強(qiáng)掃描采用高壓注射器（德國歐利奇公司，XD2001）以2.5～3.0 ml/s 的流速注射對(duì)比劑碘克沙醇（江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，國藥準(zhǔn)字：H20103675，規(guī)格：320 mgI/ml），總量按1.5 ml/kg 計(jì)算；動(dòng)脈期和靜脈期的掃描延遲時(shí)間分別為25 s和50 s。掃描參數(shù)：A 球管采用管電壓為80 kVp，管電流為118 mAs，B 球管采用管電壓為Sn150 kVp，管電流為69 mAs，準(zhǔn)直器128×0.6 mm，螺距為0.8，轉(zhuǎn)速0.5 s/r，層厚1.5 mm，間距0.7 mm。增強(qiáng)CT 檢查后每個(gè)期相可獲得了3 個(gè)不同的序列，分別為80 kVp、Sn150 kVp 和平均加權(quán)120 kVp（融合系數(shù)0.5）。

1.3 圖像分析與處理 所有數(shù)據(jù)上傳至Syngo.via 后處理工作站，雙能量CT 定量參數(shù)由2 位具有5年和16年頭頸部影像診斷經(jīng)驗(yàn)的主治醫(yī)師和副主任醫(yī)師進(jìn)行測(cè)量，取平均值作為最終結(jié)果。在碘圖上測(cè)量最大徑，并評(píng)估常規(guī)CT 特征如位置、鈣化、腺外侵犯等。在碘圖和有效原子序數(shù)圖中獲取病灶的碘濃度（iodine concentration，IC）、標(biāo)準(zhǔn)化碘濃度（normalized iodine concentration，NIC）和標(biāo)準(zhǔn)化有效原子序數(shù)（normalized effective atomic number，nZeff），公式如下：NIC=IC病灶/IC同層面主動(dòng)脈；nZeff=Zeff病灶/Zeff同層面主動(dòng)脈；在“Mono+”模式下生成病灶的能譜曲線，并計(jì)算能譜曲線斜率（the slope of the spectral Hounsfield unit curve，λHu），具體計(jì)算公式如下：λHu=（CT40kev-CT100kev）/（100-40）。勾畫感興趣區(qū)時(shí)應(yīng)盡量避開壞死、鈣化及血管等區(qū)域，所有指標(biāo)均測(cè)量3 次取平均值。

1.4 BRAFV600E基因突變分析 所有患者手術(shù)切除標(biāo)本均經(jīng)固定、脫水、取材、包埋切片、HE 染色，并在顯微鏡下剔除壞死及非腫瘤組織。使用廈門艾德生物技術(shù)有限公司的BRAFV600E基因突變檢測(cè)試劑盒（ADx-BR01），操作步驟如下：首先將樣品切成5 μm，取5～10片，加入二甲苯離心去蠟，用無水乙醇洗去二甲苯，加Buffer ATL 和蛋白酶K 于56 ℃消化，直至組織完全消化，加入Bufer AL和無水乙醇，上柱離心，用Buffer AW1和Buffer AW2 洗去雜質(zhì)，最后用Buffer ATE 洗脫DNA。采用RT-PCR 分析儀檢測(cè)BRAFV600E基因突變狀態(tài)。正義引物序列為5'-TCATAATGCTTGCTCTGATAGGA-3'，反義引物序列為5'-GGCCAAAAATTTAATCAGTGGA-3'。PCR 參數(shù)如下：第一階段，95 ℃5 min，1 個(gè)循環(huán)；第二階段，95 ℃25 s、64 ℃20 s、72℃20 s，15 個(gè)循環(huán)；第三階段，93 ℃25 s、60 ℃35 s、72 ℃20 s，31 個(gè)循環(huán)；在第三階段60 ℃時(shí)收集FAM 和HEX 信號(hào)，執(zhí)行實(shí)時(shí)PCR，保存文件。結(jié)果判讀標(biāo)準(zhǔn)：若FAM 有明顯的擴(kuò)增曲線，且Ct 值＜30，即可判斷樣本為BRAFV600E突變型；但若FAM 信號(hào)無明顯擴(kuò)增曲線或Ct 值≥30，則說明樣本為BRAFV600E野生型。

1.5 分組及觀察指標(biāo)的比較 BRAFV600E基因突變分析顯示，148 例（69.5%）PTC 患者為BRAFV600E突變型，65 例（30.5%）PTC 患者為BRAFV600E野生型。比較兩組患者臨床特征及雙能量CT 定量參數(shù)的差異。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 26.0 和Medcalc 19.0 統(tǒng)計(jì)軟件。正態(tài)分布的計(jì)量資料以表示，組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以例表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。使用組內(nèi)相關(guān)系數(shù)（intraclass correlation efficient，ICC）評(píng)估2 位閱片者測(cè)量結(jié)果的一致性，ICC＞0.75 為一致性較好。納入差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的臨床特征和雙能量CT 參數(shù)，采用向前逐步回歸法進(jìn)行多因素logistic 回歸，構(gòu)建聯(lián)合預(yù)測(cè)模型。采用ROC 曲線分析各項(xiàng)指標(biāo)的最佳截?cái)嘀?，并?jì)算AUC、靈敏度、特異度、陽性預(yù)測(cè)值、陰性預(yù)測(cè)值及準(zhǔn)確度。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 BRAFV600E突變型與BRAFV600E野生型患者臨床特征比較 BRAFV600E突變型病灶最大徑小于BRAFV600E野生型，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而兩組患者年齡、性別、位置、是否鈣化及是否腺外侵犯的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05），見表1。

表1 BRAFV600E突變型與BRAFV600E野生型患者臨床特征的比較

2.2 雙能量CT 定量參數(shù)比較 2 位觀察者對(duì)所有雙能量CT 參數(shù)測(cè)量的一致性均良好，均ICC＞0.75，見表2；BRAFV600E突變型病灶動(dòng)脈期IC、NIC、λHu和nZeff，以及靜脈期NIC 和λHu均高于BRAFV600E野生型，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；而靜脈期IC 和nZeff 在兩組間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05），見表3，典型病例見圖1、2（插頁）。

圖1 BRAFV600E突變組患者的雙能量CT 圖及基因檢測(cè)圖[A：碘圖，顯示病灶最大徑為1.35 cm，位于甲狀腺右葉，未見鈣化，存在腺外侵犯，同時(shí)測(cè)得病灶動(dòng)脈期IC 和NIC 分別為4.21 和0.35；B：有效原子序數(shù)圖，測(cè)得病灶動(dòng)脈期nZeff 為0.79；C：能譜曲線圖，測(cè)得動(dòng)脈期λHu為4.92；D：基因檢測(cè)圖，提示該患者為BRAFV600E突變型]

圖2 BRAFV600E野生組患者的雙能量CT 圖及基因檢測(cè)圖[A：碘圖，顯示病灶最大徑為1.67 cm，位于甲狀腺右葉，未見鈣化和腺外侵犯，同時(shí)測(cè)得病灶動(dòng)脈期IC 和NIC 分別為2.67 和0.19；B：有效原子序數(shù)圖，測(cè)得病灶動(dòng)脈期nZeff 為0.73；C：能譜曲線圖，測(cè)得動(dòng)脈期λHu 為3.13；D：基因檢測(cè)圖，提示該患者為BRAFV600E野生型]

表2 2 位觀察者測(cè)量雙能量CT 參數(shù)的一致性分析

表3 BRAFV600E突變型與BRAFV600E野生型雙能量CT 定量參數(shù)比較

2.3 雙能量CT 定量參數(shù)及聯(lián)合模型診斷BRAFV600E基因突變的效能 多因素logistic 回歸分析顯示，動(dòng)脈期NIC、nZeff、λHu，以及靜脈期NIC 和最大徑均是BRAFV600E基因突變的獨(dú)立預(yù)測(cè)因素，見表4，以此構(gòu)建的聯(lián)合預(yù)測(cè)模型如下：Logit（P）= 12.33×NIC（動(dòng)脈期）+21.51×nZeff（動(dòng)脈期）+0.82×λHu（動(dòng)脈期）+6.34×NIC（靜脈期）-1.04×最大徑-27.55，聯(lián)合模型的AUC、靈敏度、特異度、陽性預(yù)測(cè)值、陰性預(yù)測(cè)值和準(zhǔn)確度分別為0.877、0.865、0.800、0.901、0.738、0.844，病灶最大徑及不同雙能量CT 單一參數(shù)的預(yù)測(cè)效能見表5，ROC曲線見圖3。

圖3 雙能量CT 定量參數(shù)及聯(lián)合模型參數(shù)BRAFV600E 突變的ROC 曲線

表4 多因素logistic 回歸分析結(jié)果

表5 雙能量CT 單一參數(shù)及聯(lián)合模型預(yù)測(cè)BRAFV600E基因突變的效能分析

3 討論

BRAFV600E基因突變狀態(tài)的準(zhǔn)確識(shí)別對(duì)于PTC 患者風(fēng)險(xiǎn)分層與預(yù)后評(píng)估具有極其重要的參考價(jià)值，并直接關(guān)系到臨床治療方案的決策、隨訪計(jì)劃的制定及生存期的預(yù)測(cè)等[6-7]。此前一項(xiàng)臨床薈萃研究顯示，在發(fā)生BRAFV600E基因突變的患者中，PTC 復(fù)發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)比增加了1.93，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)比增加了1.32，甲狀腺外擴(kuò)展的風(fēng)險(xiǎn)比增加了1.71，局部晚期的風(fēng)險(xiǎn)比增加了1.70[8]。目前，雙能量CT 檢查已廣泛應(yīng)用于PTC 的良惡性結(jié)節(jié)鑒別[9]、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移預(yù)測(cè)[10]、預(yù)后評(píng)估[11]等。然而，將雙能量CT 檢查與甲狀腺癌的分子特征相關(guān)聯(lián)的研究較少。因此，本研究基于雙能量CT 檢查構(gòu)建模型實(shí)現(xiàn)術(shù)前預(yù)測(cè)PTC 患者BRAFV600E基因突變的發(fā)生概率。結(jié)果表明，結(jié)合病灶最大徑和雙能量CT 參數(shù)構(gòu)建的聯(lián)合預(yù)測(cè)模型在診斷效能方面顯著優(yōu)于單一參數(shù)。

本研究中PTC 患者中BRAFV600E突變的患病率為69.5%，這與既往研究結(jié)果基本一致[12]。然而，考慮到這種突變的患病率因PTC 亞型而異[13]，筆者并未對(duì)此進(jìn)一步評(píng)估。BRAFV600E基因突變狀態(tài)被認(rèn)為與PTC 更具侵襲性的生物學(xué)行為和晚期腫瘤階段有關(guān)[14]。本研究中筆者同樣發(fā)現(xiàn)與BRAFV600E野生型患者（15/65，23.1%）相比，BRAFV600E突變型患者中（53/148，35.8%）更易觀察到腺外侵犯，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），這與此前報(bào)道相似[15]。而病灶最長徑在BRAFV600E野生型和BRAFV600E突變型PTC 患者中差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），這與Yoon 等[4]研究一致。一種可能的解釋是，在BRAFV600E野生型的患者中以乳頭狀生長模式腫瘤較少，而以實(shí)體生長模式的居多[16]。然而，本研究結(jié)果顯示以病灶最大徑預(yù)測(cè)突變狀態(tài)的效能較低，AUC 僅為0.648，這表明僅常規(guī)CT 特征不足以在臨床實(shí)踐中準(zhǔn)確評(píng)估PTC 患者的BRAFV600E基因突變狀態(tài)。

雙能量CT 檢查的快速發(fā)展，為無創(chuàng)、定量及準(zhǔn)確評(píng)估BRAFV600E基因突變提供了一種嶄新的視角。在本研究中，筆者發(fā)現(xiàn)與BRAFV600E野生型的PTC 患者相比，BRAFV600E突變型患者的雙能量CT 參數(shù)如IC、NIC、λHu和nZeff 更高，推測(cè)可能是因?yàn)檫@些參數(shù)在惡性腫瘤中的生物學(xué)和病理生理變化相似，即BRAFV600E基因突變的PTC 具有較大的微血管密度，導(dǎo)致這些腫瘤中碘堆積。IC 可用于定量評(píng)估腫瘤中的血管化程度[17-18]。既往研究表明，發(fā)生BRAFV600E突變的腫瘤與更高的血管生成相關(guān)[19]。為了使患者之間的個(gè)體循環(huán)差異正?；?，筆者計(jì)算了NIC，結(jié)果顯示BRAFV600E突變型PTC 患者的NIC 在動(dòng)脈期和靜脈期均顯著高于BRAFV600E野生型，這表明當(dāng)PTC 發(fā)生BRAFV600E基因突變后淋巴血管內(nèi)皮細(xì)胞的大量增殖以及淋巴血管的生成，對(duì)腫瘤血管生長起到了促進(jìn)作用。此外，筆者比較了IC 和NIC 用于診斷BRAFV600E基因突變的效能。結(jié)果顯示，NIC 的診斷效能優(yōu)于IC，這表明NIC 是一個(gè)更穩(wěn)定的指標(biāo)，這與此前的研究結(jié)果一致[20]。在動(dòng)、靜脈期NIC 參數(shù)診斷效能的比較中，筆者發(fā)現(xiàn)動(dòng)脈期NIC 的診斷效能較高（AUC=0.757），而靜脈期NIC 的診斷效能較低（AUC=0.690），這一結(jié)果可能是由于甲狀腺腫瘤在不同期相中IC 動(dòng)態(tài)變化的差異所致[21]。不同的組織可以有不同的能譜衰減曲線，基于該曲線建立的λHu可以用作組織表征的重要指標(biāo)，從而更有助于直接地反映組織之間的差異[22]。在本研究中，BRAFV600E突變型PTC 患者的λHu在動(dòng)脈期和靜脈期均高于BRAFV600E野生型，這與Cao 等[23]研究相仿。推測(cè)原因可能是由于具有BRAFV600E突變的惡性腫瘤具有更多的碘積累，導(dǎo)致測(cè)量的λHu更高。

Zeff 反映組織的密度，且與組織的密度呈正相關(guān)。本研究中，筆者在BRAFV600E突變型患者中觀察到的較高nZeff，表明該部分患者的腫瘤細(xì)胞密度較大，結(jié)構(gòu)相對(duì)緊湊。此前研究表明，共基因上BRAFV600E基因突變可能導(dǎo)致G 蛋白信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的組成性激活，這與彌漫性增殖和細(xì)胞凋亡減少有關(guān)[24]。而Huang等[25]研究顯示發(fā)生BRAFV600E基因突變PTC 中的最大（Max）表現(xiàn)彌散系數(shù)（apparent diffusion coeffecient，ADC）、Mean-ADC 和D 值低于BRAFV600E野生型，ADC和D 值通常被認(rèn)為與組織中的細(xì)胞密度呈負(fù)相關(guān)。這些結(jié)論也進(jìn)一步驗(yàn)證了本研究的結(jié)果。最后，本研究經(jīng)多因素分析確定病灶最大徑、靜脈期NIC 及動(dòng)脈期NIC、λHu、nZeff 是BRAFV600E基因突變的獨(dú)立預(yù)測(cè)因素?；谏鲜鰠?shù)構(gòu)建的聯(lián)合預(yù)測(cè)模型的AUC、靈敏度、特異度和準(zhǔn)確度分別為0.877、0.865、0.800、0.844，預(yù)測(cè)效能顯著優(yōu)于單一參數(shù)。

本研究存在一些局限性。首先，這是一項(xiàng)回顧性研究，存在一定程度上的選擇偏倚；其次，無法將病灶內(nèi)各參數(shù)測(cè)量的感興趣區(qū)與病理組織標(biāo)本完全逐點(diǎn)關(guān)聯(lián)，這可能會(huì)對(duì)結(jié)果造成一定影響；最后，本研究僅納入甲狀腺乳頭狀癌這單一病理類型，且野生型病例數(shù)相對(duì)較少，未來需要進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量和病理類型進(jìn)一步深入研究。

綜上所述，由雙能量CT 衍生多個(gè)參數(shù)有助于術(shù)前預(yù)測(cè)PTC 患者的BRAFV600E基因突變，基于雙能量CT 參數(shù)和臨床特征構(gòu)建的聯(lián)合模型有助于實(shí)現(xiàn)個(gè)體化預(yù)測(cè)，這對(duì)于優(yōu)化治療策略具有重要意義。