李曉慶，閆思遠(yuǎn)，顧沛雯

（寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院，寧夏銀川 750021）

寧夏賀蘭山東麓地區(qū)是我國(guó)最大的葡萄酒地理標(biāo)志保護(hù)產(chǎn)區(qū)，隨著葡萄種植面積不斷擴(kuò)大，由葡萄灰葡萄孢（Botrytis cinerea）引起的葡萄灰霉病已成為寧夏賀蘭山東麓葡萄產(chǎn)業(yè)重大病害之一[1]。據(jù)調(diào)查，不同年份造成的葡萄產(chǎn)量損失在20%～50%[2]?；移咸焰呖梢郧秩酒咸训娜~片、花穗、果實(shí)和穗軸等，環(huán)境適宜時(shí)會(huì)在病斑表面產(chǎn)生鼠灰色霉層，直接影響葡萄的產(chǎn)量和品質(zhì)[3-4]。

葡萄灰葡萄孢屬于復(fù)合種，由于繁殖快、遺傳變異大和適合度高的特點(diǎn)[5]，導(dǎo)致其產(chǎn)生很多類群。不同類群菌株之間致病性和抗藥性均存在較大差異，這給葡萄灰霉病的有效防治帶來(lái)了巨大的挑戰(zhàn)，因此對(duì)灰葡萄孢進(jìn)行類群劃分十分重要。蔣忠洪[6]根據(jù)生長(zhǎng)特征將來(lái)自湖南不同地區(qū)的223株灰霉病菌株劃分為菌絲型、菌核型、孢子型3種類型。張艷杰等[3]對(duì)來(lái)自全國(guó)不同地區(qū)的143個(gè)灰葡萄孢菌株進(jìn)行形態(tài)學(xué)劃分，其中40.56%為菌絲型、59.44%為菌核型，根據(jù)其生長(zhǎng)速率可分為高、中、低3個(gè)等級(jí)，形態(tài)學(xué)分布與采集地地理距離無(wú)明顯相關(guān)性。馮曉菲[7]通過(guò)菌落類型、生長(zhǎng)速率和離體草莓葉片致病力對(duì)來(lái)自四川195株草莓灰霉病菌株進(jìn)行分析，表明不同菌株之間存在差異。馮寶珍[8]從運(yùn)城保護(hù)地茄子病株中分離純化出15個(gè)灰葡萄孢菌株，依據(jù)菌株的生長(zhǎng)速率、菌核的大小、形狀，將其劃分為4個(gè)類群，分別為菌絲型、孢子型、細(xì)小菌核型和大菌核型。

近年來(lái)，隨著寧夏賀蘭山東麓產(chǎn)區(qū)葡萄種植面積擴(kuò)大，葡萄灰霉病的危害也越來(lái)越嚴(yán)重，但賀蘭山東麓灰霉病菌的類群劃分研究較少，對(duì)灰霉病類群進(jìn)行系統(tǒng)劃分顯得尤為重要。本研究以從寧夏賀蘭山東麓地區(qū)不同葡萄品種病果中分離的13株葡萄灰霉病菌為研究對(duì)象，對(duì)比其分別在馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）、改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基和燕麥培養(yǎng)基上的形態(tài)和生長(zhǎng)速率、產(chǎn)孢量、微菌核以及致病性差異，并通過(guò)分子生物學(xué)的方法，對(duì)其進(jìn)行類群劃分，以期摸清該地區(qū)灰霉病菌的種群結(jié)構(gòu)，為寧夏賀蘭山東麓葡萄灰霉病的有效防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

葡萄灰霉病病果采集：2021年6—9月，在寧夏賀蘭山東麓葡萄6個(gè)酒莊共采集葡萄灰霉病果30份，用自封袋密封后立即帶回實(shí)驗(yàn)室，采用組織分離法分離病原菌[9]，共獲得13株葡萄灰霉病菌（B. cinerea）見(jiàn)表1，使用PDA培養(yǎng)基和凍干濾紙進(jìn)行短期和長(zhǎng)期保存。

表1 13株葡萄灰霉病菌的采集信息Table 1 Collection information of 13 strains of B. cinerea

2021年8月購(gòu)買無(wú)病斑、果粒大小均等、著色一致的‘紅地球’葡萄果穗，用于致病性測(cè)定。

依據(jù)13株葡萄灰霉病菌的形態(tài)學(xué)分析和致病性測(cè)定結(jié)果，使用SPSS 25進(jìn)行聚類分析，以歐式距離為10作為聚類分割點(diǎn)，對(duì)其進(jìn)行類群劃分。依據(jù)在PDA培養(yǎng)基上的菌落表現(xiàn)及生長(zhǎng)速率[14]（圖3A）可分為2類，其中菌株BC3、BC6、BC7、BC8、BC9、BC10、BC11和BC12為第一大類，菌株BC1、BC2、BC4、BC5和BC13為第二大類。依據(jù)在燕麥培養(yǎng)基上的菌落表現(xiàn)及生長(zhǎng)速率（圖3B），可分為3類，其中菌株BC2、BC3、BC5、BC11和BC12為第1類，菌株BC6、BC7、BC8、BC9和BC10為第2類，菌株BC1、BC4和BC13為第3類。依據(jù)在改良馬丁培養(yǎng)基上的菌落表現(xiàn)及生長(zhǎng)速率（圖3C），可分為3類，其中菌株BC1、BC2、BC3、BC5、BC6、BC8、BC9、BC10、BC11、BC12和BC13為第1類，菌株BC4為第2類，菌株BC7為第3類。依據(jù)13株葡萄灰霉病菌產(chǎn)孢量（圖3D），可分為2類，其中菌株BC1、BC2、BC3、BC4、BC5、BC6、BC7、BC8、BC9、BC10、BC11和BC13為第1類，菌株BC12為第2類。依據(jù)13株葡萄灰霉病菌產(chǎn)菌核情況（如圖3E），可分為2類，其中菌株BC1、BC2、BC3、BC4、BC5、BC6、BC7、BC9、BC10、BC11、BC12和BC13為第1類，菌株BC8為第2類。依據(jù)13株葡萄灰霉病菌致病性（圖3F），可劃分為2類，其中菌株BC1、BC2、BC3、BC4、BC5、BC8和BC13為第1類，菌株BC6、BC7、BC9、BC10、BC11和BC12為第2類。

1.2 供試儀器、試劑、培養(yǎng)基

1.3.3 病菌菌核形體比較

光學(xué)顯微鏡（OLYMPUS BX53，Japan）；凝膠成像系統(tǒng)（Azure Biosystems c200，USA）；Sigma 3K 15通用臺(tái)式冷凍離心機(jī)（Sigma公司，USA）；PCR儀（T100TMThermal Cycler，Singapore）。Biospin?真菌DNA提取試劑盒（BioFlux公司，日本）；2×Easy Taq PCR Super Mix、RNase A、DNA marker、Agarose和GelStain染液購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；50×TAE緩沖液、DNase/RNase-Free Water購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司。

上述區(qū)域內(nèi)的流速場(chǎng)會(huì)對(duì)物體漂移速度產(chǎn)生影響，因此首先將該區(qū)域內(nèi)所有流場(chǎng)數(shù)據(jù)提取出來(lái)，假設(shè)該區(qū)域流速場(chǎng)用以下兩個(gè)矩陣表示為

1.2.2 供試培養(yǎng)基

馬鈴薯葡萄糖（PDB）培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20.0 g，定容至1.0 L。馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20.0 g，瓊脂粉15.0 g，定容至1.0 L。改良馬丁瓊脂（GM）培養(yǎng)基：蛋白胨5.0 g，磷酸氫二鉀1.0 g，硫酸鎂0.5 g，酵母浸出粉2.0 g，葡萄糖20.0 g，瓊脂粉15.0 g，定容至1.0 L。燕麥瓊脂（YM）培養(yǎng)基：燕麥片30.0 g制備浸出液，瓊脂粉15.0 g，定容至1.0 L。以上各培養(yǎng)基121℃，20 min高壓蒸汽滅菌后，備用。

丹江口大壩加高工程溢流堰面加高疊梁封堵施工技術(shù)……………………………………………… 周利明，丁新中(2.8)

1.3 形態(tài)學(xué)分析

1.3.1 不同培養(yǎng)基上的培養(yǎng)性狀比較

接種前5 d在PDA培養(yǎng)基上活化培養(yǎng)，使用滅菌打孔器在活化后的菌落邊緣打取直徑為5 mm的葡萄灰霉病菌餅，分別接于PDA培養(yǎng)基、YM培養(yǎng)基和GM培養(yǎng)基中，25 ℃黑暗培養(yǎng)5 d，測(cè)定菌落直徑，并記錄其菌落形態(tài)，各處理重復(fù)3次。

1.3.2 產(chǎn)孢量測(cè)定

接種前5 d在PDA培養(yǎng)基上活化培養(yǎng)，使用滅菌打孔器在活化后的菌落邊緣打取直徑為5 mm的葡萄灰霉病菌餅接種于PDB培養(yǎng)基中，180 r·min-1，26±2 ℃下振蕩培養(yǎng)5 d過(guò)濾制成孢子懸浮液，血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，各處理重復(fù)3次。

1.2.1 主要儀器和試劑

回到家里，紫云拿出那個(gè)黑色公文包，里面有一張調(diào)令文書。所有的手續(xù)都辦好了，新的工作單位是華夏出版社。她把房子賣了，帶著兒子，到上海去了。

水平三角形的第（4）浪之后，進(jìn)入一氣呵成的第（5）浪，至2015年6月7559點(diǎn)結(jié)束。當(dāng)初將2013年6月底的低點(diǎn)劃分作第（4）浪終點(diǎn)，將（4）浪D看作（5）浪1——這是常見(jiàn)的錯(cuò)誤——因此才有后來(lái)的（5）浪5預(yù)期。7559點(diǎn)結(jié)束第（5）浪，這是循環(huán)浪III的頂點(diǎn)，因此后面的調(diào)整屬于循環(huán)浪IV。其中，第一個(gè)浪A可能會(huì)于2019年結(jié)束，特別是當(dāng)國(guó)證A指跌至上升通道的下軌時(shí)，配合波浪理論，將成為循環(huán)浪IV第一個(gè)買點(diǎn)。

1.4 葡萄灰霉病菌致病性測(cè)定

將‘紅地球’果粒用自來(lái)水沖洗表面灰塵后，放入75%（Vol）乙醇浸泡3 min消除氣泡，用5%（Vol）次氯酸鈉溶液浸泡5 min，無(wú)菌水沖洗4次，置于無(wú)菌濾紙晾干果粒表面的水分備用。用無(wú)菌接種針刺傷葡萄果粒表面，挑取直徑5 mm的灰霉菌餅接于葡萄果粒傷口處，置于25 ℃、濕度85%的保濕培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每菌株處理21粒，無(wú)菌水為對(duì)照，分別于第5天、第7天觀察并統(tǒng)計(jì)發(fā)病情況，并計(jì)算發(fā)病率及病情指數(shù)。

病害分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)[10]如下：

使用Biospin?真菌DNA提取試劑盒提取真菌DNA。PCR反應(yīng)體系（25 μL）：2×Eco Taq?PCR Super Mix 12.5 μL，正、反向引物（10 μmol·L-1）各1 μL（表2），DNA模板1 μL，ddH2O補(bǔ)足。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，58～64 ℃退火40 s，72 ℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，凝膠成像系統(tǒng)分析結(jié)果。將所得PCR原液送至生工生物工程（上海）有限公司進(jìn)行測(cè)序，并將測(cè)序結(jié)果在NCBI進(jìn)行BLAST比對(duì)。依據(jù)測(cè)序結(jié)果合并序列相同的菌株，確定菌株的分類地位。

由表5可知，13株葡萄灰霉病菌單孢菌株在接種后第5天發(fā)病率均達(dá)90.00%以上。其中菌株BC9致病力顯著高于其它菌株，在接種后第5天，發(fā)病率為99.04%，病情指數(shù)為88.24，產(chǎn)生大量的菌絲將離體果粒迅速包裹，造成果粒腐爛；其次是菌株BC7，在接種第5天時(shí)，發(fā)病率為99.01%，病情指數(shù)為68.63，癥狀表現(xiàn)為產(chǎn)生了少量灰黑色菌絲附著在離體果粒表面，造成果粒部分干枯和果皮凹陷；菌株BC3致病力較弱，在接種后第5天時(shí)，發(fā)病率為93.07%，病情指數(shù)為9.80，發(fā)病癥狀為只產(chǎn)生少量菌絲附著于果粒表面，沒(méi)有造成任何果粒損傷。

開(kāi)孔鋼板連接件(perfobond strip connector，也稱為PBL連接件)是1987年，德國(guó)學(xué)者Leonhardt在解決委內(nèi)瑞拉的卡羅尼第三大橋組合結(jié)構(gòu)剪力連接件的疲勞問(wèn)題時(shí)提出的一種新型剪力連接件[2].PBL連接件是通過(guò)開(kāi)孔鋼板在混凝土板中形成的一系列混凝土榫、開(kāi)孔鋼板和貫穿鋼筋共同承擔(dān)剪力.

1.5 葡萄灰霉病菌產(chǎn)孢類群的系統(tǒng)發(fā)育分析

0級(jí)：果實(shí)無(wú)??；1級(jí)：病果（病斑）面積占整個(gè)果穗（果粒）面積的5%以下；3級(jí)：病果（病斑）面積占整個(gè)果穗（果粒）面積6%～15%；5級(jí)：病果（病斑）面積占整個(gè)果穗（果粒）面積16%～25%；7級(jí)：病果（病斑）面積占整個(gè)果穗（果粒）面積26%～50%；9級(jí)：病果（病斑）面積占整個(gè)果穗（果粒）面積50%以上。

1.2.3 觀察指標(biāo)：術(shù)前及術(shù)后DASH評(píng)分、住院天數(shù)、肌電圖、術(shù)后當(dāng)日疼痛VAS評(píng)分。DASH評(píng)分是一種問(wèn)卷式的評(píng)分方式，旨在調(diào)查上肢的癥狀及從事日?；顒?dòng)的能力[17]。VAS疼痛評(píng)分法[18](0分～10分)：0分:無(wú)痛；3分以下:有輕微的疼痛，能忍受；4分～6分:患者疼痛并影響睡眠，尚能忍受；7分～10分:患者有漸強(qiáng)烈的疼痛，疼痛難忍，影響食欲，影響睡眠[19]。剪切波彈性成像，通過(guò)發(fā)射高頻超聲來(lái)激發(fā)組織產(chǎn)生剪切波，根據(jù)其波速結(jié)合彈性測(cè)量公式就可以計(jì)算出正中神經(jīng)的實(shí)際彈性值從而反映組織的受壓情況[20-21]。

表2 所用引物Table 2 Primers used

1.6 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel 2019對(duì)灰霉病樣進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，使用IBM SPSS Statistics 25進(jìn)行單因素方差分析及聚類分析。使用MEGA 6.0軟件采用鄰接（Neighbor-Joining）法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。應(yīng)用SDTv.1.2軟件分析基因序列間核酸的一致性。

2 結(jié)果與分析

2.1 灰葡萄孢在不同培養(yǎng)基上的形態(tài)差異

圖1、表3分別為13株葡萄灰霉病菌株在3種培養(yǎng)基上5 d時(shí)的菌落形態(tài)和平均生長(zhǎng)速率。在PDA培養(yǎng)基上，菌株BC1、BC2、BC4、BC5和BC13菌絲生長(zhǎng)速率較快，均大于0.53 cm·d-1，菌絲濃密；菌株BC6、BC7、BC8、BC9和BC12菌絲生長(zhǎng)速率其次，平均速率為0.36～0.39 cm·d-1；而菌株BC3、BC10和BC11的菌絲生長(zhǎng)速率較慢，平均生長(zhǎng)速率為0.30～0.33 cm·d-1，菌株BC9的生長(zhǎng)速率顯著高于菌株BC3、BC10，菌絲稀疏。在燕麥培養(yǎng)基上，菌株BC7、BC9和BC10菌絲生長(zhǎng)速率較快，平均生長(zhǎng)速率均大于0.49 cm·d-1，菌絲濃密；菌株BC3、BC5、BC6、BC8、BC11和BC12生長(zhǎng)速率較慢，平均生長(zhǎng)速率為0.35～0.45 cm·d-1。在改良馬丁培養(yǎng)基上，菌株BC3、BC4、BC5和BC10菌絲生長(zhǎng)速率較快，平均生長(zhǎng)速率均大于0.6 cm·d-1，菌絲濃密；菌株BC1、BC2、BC9和BC12生長(zhǎng)速率較慢，平均生長(zhǎng)速率為0.52～0.56 cm·d-1。

圖1 13株葡萄灰霉病菌菌株在不同培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)Figure 1 Colony morphology of 13 Botrytis cinerea strains on different media

表3 13株葡萄灰霉病菌生長(zhǎng)速率Table 3 Growth rate of 13 Botrytis cinerea strains cm·d-1

2.2 葡萄灰霉病的產(chǎn)孢量差異

在表4中，除BC13外，其他12株菌株均能產(chǎn)生分生孢子，其分生孢子形狀為卵圓或橢圓形。其中菌株BC12的產(chǎn)孢量最多，為6.32×107cfu·mL-1。

打取直徑為5 mm的葡萄灰霉病菌餅接種于PDA培養(yǎng)基中，25 ℃黑暗培養(yǎng)30 d后測(cè)定菌核數(shù)量和大小，各處理重復(fù)3次。

表4 13株葡萄灰霉病菌的產(chǎn)孢量和微菌核Table 4 Spore production of 13 Botrytis cinerea strains

2.3 葡萄灰霉病菌微菌核形態(tài)差異

由表4和圖2可知，13株葡萄灰霉病菌單孢菌株中，只有菌株BC7和BC13不產(chǎn)生菌核，其余11株都可產(chǎn)生微菌核。菌株BC8產(chǎn)生的菌核數(shù)最多，顏色為灰黑色、每皿菌核數(shù)量387個(gè)，直徑為1～2.8 mm。其次是菌株BC11產(chǎn)生的菌核顏色為黑色、每皿菌核數(shù)量109個(gè)，直徑為2～5 mm。菌株BC9和菌株BC12產(chǎn)生的菌核數(shù)較少，顏色均為黑色，菌株BC9每皿菌核數(shù)量2個(gè)，直徑為1～1.7 mm，菌株BC12每皿菌核數(shù)量2個(gè)，大小為1～4 mm。

圖2 13種葡萄灰霉病菌微菌核產(chǎn)生情況Figure 2 Microsclerotia production of 13 species of Botrytis cinerea

2.4 不同葡萄灰霉病菌的致病力差異

病情指數(shù)=(∑各級(jí)病果穗或果粒數(shù)×病害級(jí)別數(shù))/(調(diào)查總果穗或果粒數(shù)×9)×100

表5 13株葡萄灰霉病菌致病性測(cè)定Table 5 Pathogenicity determination of 13 strains of Botrytis cinerea on the 5th day and 7th day

2.5 類群分析

3、棚溫控制：下種后棚溫白天保持在30～35℃之間，夜間保持在15℃以上，注意下種后棚內(nèi)溫度不能超過(guò)38℃以上，因?yàn)檫_(dá)到40℃高溫時(shí)，種子不利于發(fā)芽。根據(jù)實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)，幼苗出土后，如果溫度超過(guò)26℃時(shí)，下胚軸會(huì)急速伸長(zhǎng)，而形成高腳苗，所以幼苗拱土后，白天棚內(nèi)溫度降到25～22℃之間，特別要注意的是此時(shí)晚間棚內(nèi)溫度不能超過(guò)10℃以上，不能低于5℃，控制夜間苗不生長(zhǎng)，棚內(nèi)高溫、高濕會(huì)導(dǎo)致幼苗徒長(zhǎng)。第一片真葉見(jiàn)長(zhǎng)后白天要適當(dāng)加大棚內(nèi)溫度，溫度白天保持在28～33℃之間，夜間5～10℃之間。真葉見(jiàn)長(zhǎng)后噴一次“金元寶”液肥，可增加植株葉綠素含量及生根量，使幼苗生長(zhǎng)旺盛健壯，提高幼苗抗寒能力。

圖3 13株葡萄灰霉菌聚類分析圖Figure 3 Cluster analysis of 13 strains of Botrytis cinerea

依據(jù)13株葡萄灰霉病菌在3種培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)速率和形態(tài)、產(chǎn)孢量、產(chǎn)微菌核情況、致病性差異將13株葡萄灰霉病菌單孢菌株劃分為8個(gè)類群。其中菌株BC6、BC9、BC10和BC11歸為Ⅰ類群，菌落表現(xiàn)為菌絲生長(zhǎng)速率較快，菌絲濃密，既可以產(chǎn)生分生孢子又可產(chǎn)生菌核，其菌絲呈現(xiàn)灰白色的灰霉病菌類群。菌株BC2、BC5歸為Ⅱ類群，菌落表現(xiàn)為菌絲生長(zhǎng)速率較快，菌絲呈現(xiàn)灰白色，即產(chǎn)生分生孢子又產(chǎn)生菌核的灰霉病菌類群。菌株BC1和BC13歸為Ⅲ類群，菌落表現(xiàn)為菌絲生長(zhǎng)速率中等，菌絲較稀疏，菌絲顏色呈現(xiàn)灰白色的灰霉病菌類群，菌株BC1產(chǎn)生分生孢子量最低，BC13既不產(chǎn)生分生孢子也不產(chǎn)生菌核。菌株BC3歸為Ⅳ類群，菌落表現(xiàn)為菌絲生長(zhǎng)速率較慢，菌絲較稀疏，菌絲顏色呈現(xiàn)灰白色的灰霉病菌，即可產(chǎn)生分生孢子也可產(chǎn)生菌核。菌株BC4歸為Ⅴ類群，菌落表現(xiàn)為菌絲生長(zhǎng)速率較快，且菌絲稀疏，菌落顏色呈現(xiàn)灰白色的灰霉病菌類群，即可產(chǎn)生分生孢子也可產(chǎn)生菌核。菌株BC7歸為Ⅵ類群。菌株BC8歸為Ⅶ類群。BC7和BC8菌落表現(xiàn)均為菌絲生長(zhǎng)速率較慢，且菌絲稀疏。在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)30 d后BC7不產(chǎn)生菌核，BC4在培養(yǎng)28 d后產(chǎn)生菌核，BC8在培養(yǎng)29 d后產(chǎn)生菌核。菌株BC12歸為Ⅸ類群，菌落表現(xiàn)為菌絲生長(zhǎng)速率較快，且菌絲濃密，菌落顏色呈現(xiàn)灰白色的灰霉病菌類群，即可產(chǎn)生分生孢子也可產(chǎn)生菌核，產(chǎn)孢量最高。

巴志鵬認(rèn)為，中國(guó)共產(chǎn)黨的生態(tài)文明建設(shè)思想是對(duì)中國(guó)古代樸素的人與自然和諧觀“天人合一”及樸素的自然倫理“仁民愛(ài)物”論等傳統(tǒng)生態(tài)文化的揚(yáng)棄和對(duì)馬克思恩格斯的人與自然協(xié)調(diào)發(fā)展觀的傳承［19］。而榮開(kāi)明則認(rèn)為，生態(tài)文明建設(shè)思想的主要淵源，包括馬克思主義生態(tài)文明理論，黨的三代領(lǐng)導(dǎo)集體探索中國(guó)社會(huì)主義建設(shè)的論述和前期經(jīng)驗(yàn)，國(guó)外有關(guān)生態(tài)文明建設(shè)的理念和經(jīng)驗(yàn)，中華文明中的生態(tài)文明智慧［20］。

2.6 葡萄灰霉病菌的分子鑒定

通過(guò)對(duì)8 株代表性葡萄灰霉病菌的B C7 2 9、BChch、Rpb2和G3pdh進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果都能夠擴(kuò)增出目的基因片段。由圖4可知，分別將8株葡萄灰霉病菌代表菌株依據(jù)BC729、BChch、Rpb2和G3pdh四組基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。通過(guò)4組基因鑒定，證明其均為灰葡萄孢B. cinerea，但是8株葡萄灰霉病菌的基因堿基序列均有差異，與形態(tài)學(xué)類群劃分結(jié)果一致。

圖4 8株葡萄灰霉病菌菌株基因間的相關(guān)性熱圖及構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Figure 4 Correlation heat map and phylogenetic tree of eight strains of Botrytis cinerea

應(yīng)用SDTv.1.2軟件分析了8株代表性菌株與灰霉病菌株的BC729、BChch、Rpb2和G3pdh基因拼接序列間核酸的一致性。由圖4可知，菌株BC9與其他灰霉病菌株之間的一致性為99.40%；菌株BC7與其他灰霉病菌株之間的一致性為99.50%～99.70%；菌株BC12與其他灰霉病菌株之間的一致性為99.20%～99.50%；菌株B C 1 3 與其他灰霉病菌株之間的一致性為99.40%～99.70%；菌株BC2與其他灰霉病菌株之間的一致性為98.90%～99.30%；菌株BC3與其他灰霉病菌株之間的一致性為99.0%～99.40%；菌株BC4與其他灰霉病菌株之間的一致性為99.10%～99.60%。

剛走到大街上，就看見(jiàn)村東邊燃放了一個(gè)鉆天猴，這個(gè)鉆天猴鉆得真叫一個(gè)高，搖頭擺尾像火箭一樣直沖上天去了，到了最高處還叭地響了一下。我心里就踏實(shí)了。這是我跟劉鐵頭約定的暗號(hào)，這說(shuō)明他已經(jīng)得手了，他和李金枝已經(jīng)像鉆天猴一樣鉆上天了。

3 討論

灰葡萄孢（B. cinerea）可通過(guò)侵染葡萄植株的葉片、枝干、花和果實(shí)導(dǎo)致葡萄灰霉病的發(fā)生[15]。其侵染植株后，引起植株體細(xì)胞程序性死亡，從而破壞組織正常生長(zhǎng)，屬于植物致病的死體營(yíng)養(yǎng)型病原真菌類型[16]。目前，噴施化學(xué)農(nóng)藥是防治灰霉病的主要方法[17]，但是灰葡萄孢為復(fù)合種，其種內(nèi)不同類群之間的致病性和抗藥性都存在很大的差異[18]，因此研究其類群劃分對(duì)于灰霉病的有效防治非常重要。

目前常利用形態(tài)學(xué)和致病性鑒定對(duì)病原菌進(jìn)行類群劃分[19]。黃燕等[20]對(duì)來(lái)源于中國(guó)6個(gè)不同地區(qū)的100株蠶豆灰葡萄孢B. fabae進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定，根據(jù)菌落形態(tài)可分為菌核型、菌絲型和分生孢子型，其中76個(gè)分離物為菌核型。周梓良[21]對(duì)湖北省17個(gè)地區(qū)采集的灰霉病樣品進(jìn)行離體葉片測(cè)定，將942株灰霉病菌的致病力分為強(qiáng)致病力和弱致病力兩類，其中強(qiáng)致病力（病斑直徑＞10 mm）灰霉病菌的比例高達(dá)93.94%，而弱致病力菌株（病斑直徑≤10 mm）的比例約為6.06%。王賀[22]通過(guò)致病性劃分將54個(gè)水稻稈腐菌核病菌Helminthosporium sigmoideum劃分為4個(gè)致病類群，并發(fā)現(xiàn)鹽堿地區(qū)水稻稈腐菌核病病原菌致病性高于非鹽堿地區(qū)。本研究以從寧夏賀蘭山東麓地區(qū)不同葡萄品種葡萄灰霉病病果上分離的13株葡萄灰霉病菌，通過(guò)對(duì)比其在馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基、燕麥瓊脂培養(yǎng)基、改良馬丁培養(yǎng)基三種不同培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)速率和形態(tài)、產(chǎn)孢量、微菌核和致病性差異劃分為8個(gè)類群，比王忠興[23]的劃分更精確和細(xì)致。

單基因鑒定對(duì)于一些親緣關(guān)系較近的種仍不能進(jìn)行有效區(qū)分，因此普遍采用多基因分子鑒定[24]。Yan等[25]從我國(guó)6個(gè)省的葡萄園中分離得到34個(gè)菌株，通過(guò)多基因（ACT、ITS、GAPDH、TUB2和CHS）分析結(jié)合形態(tài)學(xué)分析表明，黑刺盤孢（Colletotrichum aenigma）、河北刺盤孢（C. hebeiensis sp. nov.）和炭疽菌屬（C. viniferum）與我國(guó)葡萄炭疽病有一定關(guān)聯(lián)。張佳等[26]根據(jù)草莓灰霉病菌（B. cinerea）的RPB2、G3PDH和HSP60的單基因和多基因系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，我國(guó)草莓灰霉病的病原菌至少包括3個(gè)系統(tǒng)發(fā)育種。侯圣凡等[27]對(duì)來(lái)自全國(guó)12個(gè)草莓產(chǎn)區(qū)的109株草莓根腐病樣品通過(guò)分子鑒定、多基因序列（ITS-ACT-GAPDH-CALTUB2-CHS）聯(lián)合鑒定發(fā)現(xiàn)，有27.5%的樣品是由草莓炭疽根腐病病原菌膠孢炭疽菌復(fù)合種（Colletotrichum gloeosporioides complex）引起。本研究通過(guò)對(duì)8株代表性葡萄灰霉病菌的BC729、BChch、Rpb2和G3pdh進(jìn)行擴(kuò)增，表明都為灰葡萄孢，但是基因序列略有差異，驗(yàn)證了形態(tài)學(xué)劃分的結(jié)果。

本研究對(duì)分離自寧夏賀蘭山東麓不同葡萄品種的13株葡萄灰霉病菌通過(guò)形態(tài)學(xué)方法對(duì)其類群進(jìn)行劃分為8大類群，并通過(guò)分析BC729、BChch、Rbp2和G3pdh4個(gè)基因序列，對(duì)其進(jìn)行多基因分子鑒定，顯示這些菌株均為灰葡萄孢，但是堿基序列有差異，與形態(tài)學(xué)類群劃分結(jié)果一致。本研究通過(guò)形態(tài)學(xué)觀察和分子鑒定手法，明確賀蘭山東麓地區(qū)灰霉病菌的種群結(jié)構(gòu)，為該地區(qū)葡萄灰霉病的有效防治提供理論依據(jù)。