張國(guó)亮，余歡歡，陳棟杰，王漢波，王 瑛,3，徐 靖,4，李明焱,3,4，李振皓,,4*

（1.浙江壽仙谷植物藥研究院有限公司，浙江 杭州 311100；2.浙江壽仙谷醫(yī)藥股份有限公司，浙江金華 321200；3.壽仙谷珍稀藥材產(chǎn)品省級(jí)重點(diǎn)農(nóng)業(yè)企業(yè)研究院，浙江 金華 321200；4.浙江省珍稀植物藥工程技術(shù)研究中心，浙江 金華 321200）

白術(shù)為菊科蒼術(shù)屬白術(shù)Atractylodes macrocephalaKoidz.的根莖，具有健脾益氣、燥濕利水的功效[1]，主要分布在浙江、安徽、湖南、江西、河北等地[2]。浙江是白術(shù)的道地產(chǎn)區(qū)，但近年來(lái)浙白術(shù)出現(xiàn)了品種混亂、產(chǎn)地變遷等情況，影響浙白術(shù)的合理應(yīng)用[3]。

目前，白術(shù)的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)大多數(shù)僅對(duì)醇溶性浸出物、揮發(fā)油等指標(biāo)進(jìn)行了規(guī)定，只有《香港中藥材標(biāo)準(zhǔn)》對(duì)白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ的含量進(jìn)行了規(guī)定。白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ、白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ、白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ和蒼術(shù)酮是白術(shù)中重要的生物活性物質(zhì)，均能發(fā)揮抗腫瘤、抗炎以及抗氧化等藥理作用[4-5]，對(duì)白術(shù)的臨床療效起到了重要的作用。為了更好地評(píng)價(jià)市場(chǎng)上白術(shù)藥材的品質(zhì)，本研究基于一測(cè)多評(píng)法測(cè)定3 個(gè)不同產(chǎn)地的白術(shù)藥材中白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ、白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ、白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ和蒼術(shù)酮的含量，并對(duì)揮發(fā)油和醇溶性浸出物進(jìn)行測(cè)定，為白術(shù)藥材的質(zhì)量評(píng)價(jià)提供更全面的方法。

1 材料

1.1 藥物與試劑

白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ（批號(hào)：PS010512，純度：99.50%）、白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ（批號(hào)：PS010511，純度：99.38%）、白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ（批號(hào)：PS010510，純度：99.97%）、蒼術(shù)酮（批號(hào)：PS011118，純度：99.76%），以上對(duì)照品均購(gòu)于成都普思生物科技股份有限公司。乙腈（色譜純，美國(guó)Merck 公司），其余試劑均為分析純。

25 批白術(shù)藥材分別采購(gòu)于安徽、河北、浙江3個(gè)不同產(chǎn)地，經(jīng)朱衛(wèi)東高級(jí)農(nóng)藝師鑒定為菊科蒼術(shù)屬白術(shù)Atractylodes macrocephalaKoidz.的根莖，詳細(xì)信息見(jiàn)表1。

表1 25 批白術(shù)藥材編號(hào)及產(chǎn)地信息Tab.1 25 batches of Atractylodis macrocephalae rhizome number and origin information

1.2 主要儀器

ACQUITY Arc 型高效液相色譜儀（美國(guó)Waters 公司）；Waters SunFire C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），Waters XBridge C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），Welch Ultimate LP C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；XS205 型十萬(wàn)分之一天平［梅特勒-托利多科技（中國(guó)）有限公司］；Centrifuge 5430R 型高速冷凍離心機(jī)（德國(guó)艾本德股份公司）；小型高速離心機(jī)（德國(guó)艾本德股份公司）；KQ52000E 型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 一測(cè)多評(píng)法的建立

2.1.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ6.30 mg、白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ 5.75 mg、白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ 5.96 mg和蒼術(shù)酮15.60 mg，分別置于5 mL 容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，分別精密量取各對(duì)照品貯備液1 mL，置于10 mL 容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，配成濃度為126.0 μg/mL、115.0 μg/mL、119.2 μg/mL、312.0 μg/mL 的混合對(duì)照品溶液。

2.1.2 供試品溶液的制備 稱取本品粉末約2.0 g，精密稱定。置于50 mL 離心管中，加10 mL 甲醇，靜置2 h 后，超聲30 min，6 000 r/min 離心20 min（離心半徑7.5 cm），取上清液轉(zhuǎn)移至50 mL 容量瓶中，重復(fù)提取2 次，合并提取液，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，0.45 μm 微孔濾膜濾過(guò)，得供試品溶液，備用。

2.1.3 色譜條件 Waters Sunfire C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動(dòng)相A 為乙腈，B 為水，梯度洗脫（0 ～ 5 min，20%A；5 ～ 10 min，20% → 60%A；10 ～ 25 min，60% → 90%A；25 ～ 30 min，90%A；30 ～ 32 min，90% → 100%A；32 ～ 40 min，100%A），柱溫：25℃，檢測(cè)波長(zhǎng)：220 nm（白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ、白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ和蒼術(shù)酮）和276 nm（白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ）；流速：1.0 mL/min；進(jìn)樣量：5 μL。該條件下，各色譜峰分離度大于1.5，理論塔板數(shù)均大于5 000，見(jiàn)圖1。

圖1 高效液相色譜圖Fig.1 High performance liquid chromatogram

2.1.4 方法學(xué)考察 （1）線性關(guān)系考察 精密量取“2.1.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液1 mL、2 mL、4 mL、6 mL、8 mL、10 mL 置于10 mL 容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，注入色譜儀，按“2.1.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定。以對(duì)照品質(zhì)量濃度（X，μg/mL）為橫坐標(biāo)，峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。由表2 可知，白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ、白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ、白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ和蒼術(shù)酮在相應(yīng)的濃度范圍內(nèi)均有良好的線性關(guān)系。

表2 線性關(guān)系考察結(jié)果Tab.2 Results of linear relationship examination

（2）精密度試驗(yàn) 取“2.1.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液，按“2.1.3”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6 次，測(cè)得結(jié)果顯示白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ、白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ、白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ和蒼術(shù)酮的峰面積RSD 分別為0.62%、0.39%、0.87%和0.59%，表明儀器精密度良好。

（3）重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批白術(shù)藥材，精密稱定6 份，按“2.1.2”項(xiàng)下制備供試品溶液，“2.1.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行進(jìn)樣分析，結(jié)果得樣品中白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ、白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ、白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ和蒼術(shù)酮含量的RSD分別為1.24%、1.56%、0.96%和1.33%，表明該方法重復(fù)性良好。

（4）穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一份供試品溶液，于0、2、4、8、12、24 h 時(shí)，按“2.1.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，結(jié)果顯示白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ、白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ、白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ和蒼術(shù)酮峰面積的RSD分別為1.21%、1.22%、1.84%和0.98%，表明該供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性較好。

（5）加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取已知含量的白術(shù)藥材粉末1.0 g，共6 份，精密加入“2.1.1”項(xiàng)下對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，按“2.1.2”項(xiàng)下制備供試品溶液，“2.1.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算回收率，結(jié)果顯示白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ、白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ、白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ和蒼術(shù)酮的平均加樣回收率為101.2%、100.8%、99.2%和102.8%，RSD 分別為0.84%、0.87%、0.64%和1.02%，表明該測(cè)定方法準(zhǔn)確可靠。

（6）樣品的含量測(cè)定 分別取25 批白術(shù)樣品適量，按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，“2.1.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算樣品中4種成分的含量。

2.1.5 相對(duì)校正因子的確定 按“2.1.1”項(xiàng)下制備不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，依法測(cè)定峰面積，以白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ為內(nèi)參物，采用多點(diǎn)法計(jì)算白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ、白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ和蒼術(shù)酮相對(duì)于白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ的f白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ/白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ、f白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ/白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ、f蒼術(shù)酮/白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 多點(diǎn)法計(jì)算相對(duì)校正因子Tab.3 Multi-point method to calculate relative correction factors

結(jié)果顯示，采用多點(diǎn)法計(jì)算的f白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ/白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ為0.659，f白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ/白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ為0.511，f蒼術(shù)酮/白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ為1.54。

2.1.6 耐用性考察 （1）不同色譜柱對(duì)相對(duì)校正因子的影響 使用XBridge、SunFire以及Ultimate C183 種不同的色譜柱，分別測(cè)定并計(jì)算f白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ/白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ、f白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ/白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ、f蒼術(shù)酮/白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ，結(jié)果顯示，3 種不同色譜柱的相對(duì)校正因子的RSD 均小于2%，表明白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ、白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ、白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ和蒼術(shù)酮在不同色譜柱上的耐用性較好，見(jiàn)表4。

表4 不同色譜柱對(duì)相對(duì)校正因子的影響Tab.4 Effect of different columns on the relative correction factors

（2）不同流速對(duì)相對(duì)校正因子的影響 采用SunFire 色譜柱，分別測(cè)定不同流速下（0.8、1.0、1.2 mL/min）的f白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ/白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ、f白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ/白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ、f蒼術(shù)酮/白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ，結(jié)果顯示，不同流速下的相對(duì)校正因子RSD 均小于1%，表明相對(duì)校正因子在流速0.8 ～1.2 mL/min 的耐用性較好，見(jiàn)表5。

表5 不同流速對(duì)相對(duì)校正因子的影響Tab.5 Effect of different flow rates on relative correction factors

（3）不同柱溫對(duì)相對(duì)校正因子的影響 采用SunFire 色譜柱，分別測(cè)定不同柱溫下（20℃、25℃、30℃）的f白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ/白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ、f白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ/白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ、f蒼術(shù)酮/白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ，結(jié)果顯示，不同柱溫下的相對(duì)校正因子RSD 均小于1%，表明相對(duì)校正因子在柱溫20 ～30℃的耐用性較好，見(jiàn)表6。

表6 不同柱溫對(duì)相對(duì)校正因子的影響Tab.6 Effect of different column temperatures on the relative correction factors

（4）不同進(jìn)樣體積對(duì)相對(duì)校正因子的影響

采用SunFire 色譜柱，分別測(cè)定不同進(jìn)樣體積下（5、7、10μL）的f白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ/白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ、f白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ/白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ、f蒼術(shù)酮/白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ，結(jié)果顯示，不同進(jìn)樣體積下的相對(duì)校正因子RSD 均小于2%，表明相對(duì)校正因子在進(jìn)樣體積5 ～ 10 μL 下的耐用性較好，見(jiàn)表7。

表7 不同進(jìn)樣體積對(duì)相對(duì)校正因子的影響Tab.7 Effect of different injection volumes on the relative correction factors

2.1.7 待測(cè)成分色譜峰的定位 中藥化學(xué)成分復(fù)雜，色譜圖中除了待測(cè)成分峰外存在其它色譜峰，因此待測(cè)成分色譜峰的準(zhǔn)確定位是實(shí)現(xiàn)一測(cè)多評(píng)的前提?？疾觳煌V柱對(duì)相對(duì)保留時(shí)間的影響，結(jié)果顯示，R白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ/白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ、R白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ/白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ、R蒼術(shù)酮/白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ的相對(duì)保留時(shí)間RSD 分別為1.40%、1.42%、3.89%，表明用待測(cè)組分與內(nèi)參物相對(duì)保留時(shí)值來(lái)定位具有可行性，見(jiàn)表8。

表8 待測(cè)成分色譜峰的定位Tab.8 Localization of the peaks of the components

2.1.8 樣品含量測(cè)定及一測(cè)多評(píng)法的驗(yàn)證 按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備25 批不同產(chǎn)地白術(shù)的供試品溶液，“2.1.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行分析，使用外標(biāo)法和一測(cè)多評(píng)法分別計(jì)算各批次樣品的含量，并以t檢驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證一測(cè)多評(píng)法的準(zhǔn)確性，結(jié)果見(jiàn)表9。結(jié)果表明，一測(cè)多評(píng)法檢測(cè)的含量結(jié)果較為準(zhǔn)確。

表9 外標(biāo)法與一測(cè)多評(píng)法的比較（%，n = 2）Tab.9 Comparison of external standard method and QAMS（%，n = 2）

2.2 揮發(fā)油和醇溶性浸出物含量測(cè)定

參照2020 年版《中國(guó)藥典》對(duì)25 批白術(shù)樣品中揮發(fā)油和醇溶性浸出物進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)表10。

表10 25 批不同產(chǎn)地白術(shù)樣品中揮發(fā)油和醇溶性浸出物含量測(cè)定結(jié)果（%，n = 2）Tab.10 Determination of essential oil and alcohol-soluble extracts in 25 batches of Atractylodis macrocephalae rhizome from different origins（%，n = 2）

表11 白術(shù)主要成分之間的相關(guān)性分析Tab.11 Correlation analysis between the main components of Atractylodis macrocephalae rhizome

2.3 結(jié)果分析

25 批不同產(chǎn)地白術(shù)藥材中白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ、白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ、白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ和蒼術(shù)酮含量結(jié)果見(jiàn)圖2，醇溶性浸出物和揮發(fā)油含量結(jié)果見(jiàn)圖3。結(jié)果顯示，浙產(chǎn)白術(shù)蒼術(shù)酮含量和揮發(fā)油含量明顯高于其它2 個(gè)產(chǎn)地。

圖3 25 批不同產(chǎn)地白術(shù)藥材中揮發(fā)油和醇溶性浸出物含量結(jié)果Fig.3 Results of essential oil and alcohol-soluble extracts in 25 batches of Atractylodis macrocephalae rhizome from different origins

2.4 相關(guān)性分析

利用SPSS 19.0 作不同成分含量及藥材性狀間的相關(guān)性分析，結(jié)果顯示，白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ、白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ、白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ之間存在顯著正相關(guān)（P＜0.01），蒼術(shù)酮與揮發(fā)油之間也存在顯著正相關(guān)（P＜0.01）。

3 討論

一測(cè)多評(píng)法能顯著降低檢測(cè)成本，具有方便、廉價(jià)、穩(wěn)定的特點(diǎn)，在中藥材的質(zhì)量控制中得到了廣泛的應(yīng)用，如鐵皮石斛[6]、黃芩[7]、白芍[8]等。伍蕊嗣等[9]采用高效液相色譜法建立了白術(shù)飲片中白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ、白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ和蒼術(shù)酮的一測(cè)多評(píng)法，但其檢測(cè)波長(zhǎng)與本實(shí)驗(yàn)不一致，白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ在220 nm 波長(zhǎng)下無(wú)吸收。趙玉嬌等[10]采用超高效液相色譜法建立了白術(shù)藥材中白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ、白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ、白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ的一測(cè)多評(píng)法，但超高效液相色譜儀在大部分實(shí)驗(yàn)室中并不普遍，檢測(cè)成本也相對(duì)較高。

因此本實(shí)驗(yàn)在前期研究的基礎(chǔ)上改善了白術(shù)一測(cè)多評(píng)法，利用白術(shù)中主要成分結(jié)構(gòu)的相似性，建立了白術(shù)藥材中白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ、白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ、白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ和蒼術(shù)酮的一測(cè)多評(píng)法，結(jié)果顯示該方法有效可靠，可為今后白術(shù)藥材的質(zhì)量評(píng)價(jià)提供參考。

中藥揮發(fā)油多以油滴形態(tài)存在于植物表皮的腺毛、油室、油細(xì)胞或油管中[11]，本實(shí)驗(yàn)在測(cè)定25 批不同產(chǎn)地白術(shù)藥材中的主要成分含量中發(fā)現(xiàn)浙江產(chǎn)的白術(shù)具有明顯優(yōu)勢(shì)。通過(guò)觀察這些產(chǎn)地白術(shù)的性狀特征發(fā)現(xiàn)，浙江產(chǎn)地白術(shù)與其他產(chǎn)地相比具有明顯的油室，進(jìn)一步檢測(cè)其醇溶性浸出物和揮發(fā)油含量，發(fā)現(xiàn)其蒼術(shù)酮含量與揮發(fā)油具有較好的相關(guān)性，這是因?yàn)樯n術(shù)酮為揮發(fā)油的主要成分[12]。有研究表明白術(shù)揮發(fā)油對(duì)腫瘤細(xì)胞的活性具有明顯的抑制作用[13]，并對(duì)急性肝損傷具有緩解作用[14]。蒼術(shù)酮可抑制結(jié)直腸癌HT29 細(xì)胞的增殖并能介導(dǎo)凋亡[15]，對(duì)急性肺損傷也具有保護(hù)作用[16]。因此，不同產(chǎn)地造成的化學(xué)成分差異可能會(huì)影響其藥效作用，值得進(jìn)一步結(jié)合藥效試驗(yàn)進(jìn)行評(píng)價(jià)。

4 結(jié)論

本研究測(cè)定了25 批不同產(chǎn)地白術(shù)藥材中白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ、Ⅱ、Ⅰ和蒼術(shù)酮以及揮發(fā)油和醇溶性浸出物的含量，并將含量結(jié)果進(jìn)行數(shù)據(jù)可視化分析，結(jié)果表明浙江產(chǎn)地的白術(shù)藥材中蒼術(shù)酮和揮發(fā)油含量相比較其他產(chǎn)地具有明顯優(yōu)勢(shì)，提示蒼術(shù)酮和揮發(fā)油可作為浙產(chǎn)白術(shù)的道地性標(biāo)志物，為今后建立浙產(chǎn)白術(shù)的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供依據(jù)。