蘇 芳, 石志浩, 趙 靜, 陳 萍, 李 堅(jiān)

(江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院, 1. 呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科, 2. 老年醫(yī)學(xué)科, 江蘇 鎮(zhèn)江, 212001)

肺癌是常見的腫瘤之一,發(fā)病率及病死率均位居高位[1]。在中國,根據(jù)2022年國家癌癥中心發(fā)布的全國癌癥數(shù)據(jù)結(jié)果,每年80多萬人被診斷為肺癌,近85%肺癌患者為非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)[2]。高發(fā)病率、進(jìn)展快、高病死率、預(yù)后差是NSCLC的主要流行病學(xué)特點(diǎn)[3]。臨床上,少部分NSCLC患者可在早期(Ⅰ期或Ⅱ期)被明確診斷[4], 超過60%的肺癌患者因局部晚期或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等表現(xiàn)診斷癌癥晚期(Ⅲ期或Ⅳ期)[5], 侵襲、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)是NSCLC的重要特點(diǎn),與預(yù)后不良密切相關(guān)[6]。早期發(fā)現(xiàn)、診斷并干預(yù)腫瘤生長,有助于降低病死率,改善預(yù)后,延長生存期。因此,尋找診斷NSCLC的高特異性、高敏感的生物標(biāo)志物仍是防治肺癌的熱點(diǎn)。

長鏈非編碼RNA(lncRNA)具有組織特異性表達(dá),影響細(xì)胞增殖、凋亡和分化,其可用于癌癥的診斷、預(yù)后和治療[7]。研究[8]表明, lncRNA小核仁宿主基因20(lncRNA-SNHG20)在NSCLC腫瘤組織中表達(dá)上調(diào),促進(jìn)NSCLC細(xì)胞的增殖和遷移,進(jìn)而影響預(yù)后。lncRNA轉(zhuǎn)錄因子7(lncRNA-TCF7)在NSCLC腫瘤組織中表達(dá)上調(diào),增強(qiáng)NSCLC細(xì)胞侵襲性和自我更新能力[9]。但目前關(guān)于NSCLC患者血漿lncRNA-SNHG20和lncRNA-TCF7相對(duì)表達(dá)的研究較少。本研究選取120例NSCLC患者和120例良性肺病患者作為研究對(duì)象,采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)檢測(cè)血漿中l(wèi)ncRNA-SNHG20和lncRNA-TCF7的相對(duì)表達(dá)量,分析其與臨床病理特征的相關(guān)性,并探討SNHG20、TCF7診斷NSCLC的臨床價(jià)值。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

分別選擇2020年12月—2022年6月江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院收治的120例NSCLC患者(NSCLC組)和良性肺病患者(良性肺病組)。NSCLC組: ① 經(jīng)細(xì)胞學(xué)或組織病理學(xué)確診者; ② 首次確診,且原發(fā)病灶來源于肺部,未接受過手術(shù)、化療、放療等腫瘤干預(yù)措施者。NSCLC組中男68例,女52例; 年齡36～78歲; 病理組織分型為腺癌93例,鱗癌27例。根據(jù)UICC肺癌TNM分期(第8版)標(biāo)準(zhǔn),臨床分期為Ⅰ～Ⅱ期20例, Ⅲ～Ⅳ期90例,未明確分期10例。良性肺病組男65例,女55例; 年齡25～80歲; 疾病類型包括慢性阻塞性肺疾病48例,哮喘8例,支氣管擴(kuò)張14例,肺炎50例。為保證檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確性,采集20例健康成人受試者血漿樣本用于lncRNA檢測(cè)結(jié)果校對(duì)。本研究已獲得醫(yī)院人文倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(批件號(hào)KY2022K0121)。

1.2 血漿標(biāo)本采集及預(yù)處理

抽取研究對(duì)象5 mL外周靜脈血于EDTA抗凝管, 30 min內(nèi)利用低速離心機(jī)留取上層血漿,置于-80 ℃冰箱凍存留用。同時(shí)送檢參與者血液標(biāo)本至核醫(yī)學(xué)科檢測(cè)癌胚抗原(CEA)及細(xì)胞角蛋白19(Cyfra21-1, 參照試劑和說明書,正常參考值上限分別為5、7 ng/mL)。

1.3 RNA提取及逆轉(zhuǎn)錄

利用Trizols法提取上述標(biāo)本血漿總RNA, 總RNA的濃度及純度用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)。吸取固定體積的總RNA, 根據(jù)試劑盒說明書嚴(yán)格進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄,逆轉(zhuǎn)錄結(jié)束標(biāo)本可直接進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR, 也可凍存于-20 ℃冰箱待用。

1.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

吸取2 μL上述逆轉(zhuǎn)錄所得的cDNA作為模板,嚴(yán)格遵循TB Green Premix Ex TaqTM試劑操作步驟執(zhí)行,根據(jù)說明書配置反應(yīng)體系后,應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀進(jìn)行兩步法PCR擴(kuò)增。反應(yīng)條件為預(yù)變性1個(gè)循環(huán), 95 ℃, 30 s; PCR反應(yīng)40個(gè)循環(huán), 95 ℃ 5 s, 60 ℃ 30 s。任一樣本的任一基因檢測(cè)皆設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。內(nèi)參基因?yàn)镚APDH, 利用2-△△CT法計(jì)算上述2種lncRNAs的相對(duì)表達(dá)量。引物序列:GAPDH上游引物為5′-CAGGAGGCATTGCTGATGAT-3′, 下游引物為5′-GAAGGCTGGGGCTCATTT-3′; lncRNA-SNHG20上游引物為5′-ATGGCTATAAATAGATAGATACACG-3′, 下游引物為5′-GGTACAAACAGGGAGGGA-3′; lncRNA-TCF7上游引物為5′-AGGAGTCCTTGGACCTGAGC-3′, 下游引物為5′-AGTGGCTGGCATATAACCAACA-3′。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 血漿中l(wèi)ncRNA-SNHG20和lncRNA-TCF7的表達(dá)水平

NSCLC組、良性肺病組血漿中l(wèi)ncRNA-TCF7的相對(duì)表達(dá)量分別為(3.327±0.232)、(3.124±0.135), lncRNA-SNHG20的相對(duì)表達(dá)量分別為(2.655±0.139)、(2.591±0.121)。與良性肺病組相比, NSCLC患者血漿中l(wèi)ncRNA-SNHG20和lncRNA-TCF7表達(dá)水平上調(diào),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖1。

2.2 NSCLC患者血漿中l(wèi)ncRNA-SNHG20和lncRNA-TCF7的相對(duì)表達(dá)水平與臨床病理參數(shù)的關(guān)系

NSCLC患者血漿中l(wèi)ncRNA-SNHG20和lncRNA-TCF7的相對(duì)表達(dá)水平與性別、年齡、吸煙史、病理分型及臨床TNM分期無關(guān)(P>0.05), 見表1。

表1 NSCLC組血漿中l(wèi)ncRNA-SNHG20和lncRNA-TCF7的表達(dá)水平與臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系

2.3 血漿中l(wèi)ncRNA-SNHG20、lncRNA-TCF7、CEA和Cyfra21-1 對(duì)NCSLC的診斷效能

ROC曲線分析結(jié)果顯示, lncRNA-SNHG20、lncRNA-TCF7、CEA、Cyfra21-1單獨(dú)檢測(cè)診斷NSCLC的AUC分別為0.648(0.579～0.717)、0.769(0.710～0.829)、0.755(0.692～0.817)、0.642(0.571～0.713), lncRNA-SNHG20、lncRNA-TCF7的AUC大于Cyfra21-1, CEA的AUC介于lncRNA-SNHG20和lncRNA-TCF7之間。lncRNA-SNHG20和lncRNA-TCF7聯(lián)合診斷的AUC為0.772(0.713～0.832), 大于上述4種任一單獨(dú)檢測(cè)的AUC。lncRNA-SNHG20與lncRNA-TCF7聯(lián)合Cyfra21-1的AUC為0.773(0.712～0.832), 低于lncRNA-SNHG20與lncRNA-TCF7聯(lián)合CEA的AUC0.882(0.839～0.926), 但大于lncRNA-SNHG20與lncRNA-TCF7聯(lián)合檢測(cè)的AUC。LncRNA-SNHG20、lncRNA-TCF7、CEA、Cyfra21-1這4種指標(biāo)單獨(dú)檢測(cè)及l(fā)ncRNA-SNHG20與lncRNA-TCF7聯(lián)合檢測(cè)、lncRNA-SNHG20與lncRNA-TCF7聯(lián)合Cyfra21-1、lncRNA-SNHG20與lncRNA-TCF7聯(lián)合CEA的AUC比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05), 見圖2。

lncRNA-SNHG20與lncRNA-TCF7分別聯(lián)合常規(guī)腫瘤標(biāo)志物CEA及Cyfra21-1后AUC增大, lncRNA-SNHG20與lncRNA-TCF7聯(lián)合CEA檢測(cè)診斷的敏感度提高。診斷NSCLC的cut-off值、陽性預(yù)測(cè)值、陰性預(yù)測(cè)值及準(zhǔn)確性見表2。

表2 lncRNA-SNHG20、lncRNA-TCF7、CEA及Cyfra21-1單獨(dú)診斷及聯(lián)合診斷NSCLC的效能

3 討 論

LncRNA是一組不具有蛋白翻譯功能、長度超過200個(gè)核苷酸的轉(zhuǎn)錄本[10]。LncRNA在不同類型腫瘤細(xì)胞中異常表達(dá),在不同水平的基因表達(dá)中發(fā)揮調(diào)控作用[11]。近年來, lncRNA因其在癌癥中的調(diào)控作用而受到越來越多的關(guān)注。研究[12]發(fā)現(xiàn), lncRNA異常表達(dá)可能會(huì)影響遺傳表觀信息,為腫瘤的細(xì)胞生長提供優(yōu)勢(shì),通過調(diào)節(jié)微小RNA(miRNA)或mRNAs參與癌癥進(jìn)展。因此, lncRNA正在成為癌癥診斷和治療的新的標(biāo)志物。

LncRNA-SNHG20位于染色體17q25.2, 具有2 183個(gè)堿基對(duì),研究[13]認(rèn)為過表達(dá)lncRNA-SNHG20可通過不同機(jī)制促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞周期、增殖、侵襲和遷移能力。lncRNAs可以通過miRNAs調(diào)控卵巢癌的進(jìn)展, lncRNA-SNHG20與卵巢癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[14]。研究[15]發(fā)現(xiàn),與正常人卵巢上皮細(xì)胞系相比,在4種卵巢癌細(xì)胞系中觀察到lncRNA-SNHG20顯著高表達(dá),敲除lncRNA-SNHG20可抑制細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞凋亡。研究[16]表明,在卵巢癌組織和細(xì)胞中, lncRNA-SNHG20和MCL1水平上調(diào),而miR3383p水平下調(diào),經(jīng)雙熒光素酶報(bào)告分析進(jìn)行發(fā)現(xiàn)lncRNA-SNHG20通過靶向miR-338-3p來增加MCL1的表達(dá),從而促進(jìn)卵巢癌的發(fā)展。相關(guān)研究通過檢測(cè)68例結(jié)直腸癌組織及鄰近正常組織的lncRNA-SNHG20表達(dá)水平發(fā)現(xiàn), lncRNA-SNHG20在癌組織中呈高表達(dá),而且癌細(xì)胞系中l(wèi)ncRNA-SNHG20的表達(dá)顯著增加。miR495是lncRNA-SNHG20的直接靶點(diǎn), STAT3被確定為結(jié)直腸癌中miR495的下游靶點(diǎn), LncRNA-SNHG20通過調(diào)節(jié)STAT3表達(dá)和miR495促進(jìn)結(jié)直腸癌進(jìn)展[17]。此外,與癌旁組織相比,肺腺癌組織中l(wèi)ncRNA-SNHG20呈過表達(dá),且lncRNA-SNHG20在肺腺癌細(xì)胞系中的表達(dá)高于正常上皮細(xì)胞系。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn), lncRNA-SNHG20直接結(jié)合肺腺癌細(xì)胞中的miR-342, 而miR-342又直接結(jié)合DDX49, lncRNA-SNHG20通過海綿介導(dǎo)miR-342上調(diào)DDX49, 促進(jìn)肺腺癌細(xì)胞增殖、侵襲和抑制凋亡[18]。本研究結(jié)果顯示, NSCLC患者血漿中l(wèi)ncRNA-SNHG20呈高表達(dá),與既往研究中l(wèi)ncRNA-SNHG20在肺癌、卵巢癌、結(jié)直腸癌等腫瘤組織中高表達(dá)結(jié)果相符。此外, NSCLC患者血漿中l(wèi)ncRNA-SNHG20表達(dá)上調(diào),與年齡、吸煙史、性別、病理組織分型、臨床分期等無明顯相關(guān)性,檢索Gepia數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)lncRNA-SNHG20的相對(duì)表達(dá)水平與NSCLC總生存期無明顯相關(guān)性。

TCF7主要在T細(xì)胞中表達(dá),在NK細(xì)胞及先天淋巴細(xì)胞的發(fā)育中其關(guān)鍵作用[19]。研究[20]發(fā)現(xiàn),經(jīng)IL-6/STAT3反激活誘導(dǎo)TCF7,通過上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化促進(jìn)肝細(xì)胞癌的侵襲性。體外實(shí)驗(yàn)表明,敲低lncRNA-TCF7可以降低SK-Hep-1肝癌細(xì)胞系的細(xì)胞侵襲能力。研究表示, TCF7在結(jié)直腸癌細(xì)胞系中相對(duì)于正常結(jié)直腸上皮細(xì)胞高表達(dá)。免疫沉淀及熒光素酶報(bào)告基因分析顯示,lncRNA-TCF7招募BAF170激活TCF7啟動(dòng)子,并調(diào)控TCF7表達(dá)。研究[21]表明, lncRNA-TCF7的下調(diào)可通過抑制TCF7的表達(dá)來抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的遷移和侵襲。通過流式細(xì)胞術(shù)及轉(zhuǎn)染試驗(yàn)表明,沉默癌細(xì)胞中TCF7可抑制細(xì)胞增殖、遷移與侵襲,但對(duì)細(xì)胞凋亡無明顯影響。表達(dá)lncRNA-TCF7可以增加細(xì)胞侵襲能力,而shRNA沉默lncRNA-TCF7可以降低NSCLC細(xì)胞侵襲能力[9]。因此,上述研究表明,lncRNA-TCF7在多種癌癥中發(fā)揮促進(jìn)腫瘤生長作用。本研究結(jié)果顯示, NSCLC患者血漿中l(wèi)ncRNA-TCF7呈高表達(dá),與上述研究腫瘤組織及細(xì)胞系高表達(dá)相符。同時(shí), NSCLC患者血漿中l(wèi)ncRNA-TCF7高表達(dá)與年齡、吸煙史、性別、病理組織分型、臨床分期等無明顯相關(guān)性,但檢索ULCAN數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)TCF7不僅在肺腺癌呈高表達(dá),且在早期腺癌中TCF7的表達(dá)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。但本研究數(shù)據(jù)表明, NSCLC患者血漿中l(wèi)ncRNA-TCF7的表達(dá)水平與臨床分期無明顯相關(guān)性,考慮可能與本研究中早期樣本僅20例有關(guān)。

本研究中,單獨(dú)檢測(cè)lncRNA-TCF7的AUC(0.769)大于常規(guī)腫瘤標(biāo)志物CEA(0.755)和Cyfra21-1(0.642), 且lncRNA-TCF7的特異度(87.5%)高于CEA(78.2%)和Cyfra21-1(67.5%)。單獨(dú)檢測(cè)lncRNA-SNHG20的AUC(0.648)介于CEA(0.755)和Cyfra21-1 (0.642)之間,但lncRNA-SNHG20的敏感度為81.5%, 高于CEA的72.5%和Cyfra21-1的60.5%。聯(lián)合檢測(cè)lncRNA-TCF7及l(fā)ncRNA-SNHG20的AUC為0.772, 敏感度為73.2%, 大于TCF7單獨(dú)檢測(cè)的AUC, 但低于lncRNA-SNHG20單獨(dú)檢測(cè)的敏感度; 特異度(80.2%)低于TCF7單獨(dú)檢測(cè),但高于lncRNA-SNHG20(42.5%)、CEA(78.2%)及Cyfra21-1(67.5%)。聯(lián)合檢測(cè)lncRNA-TCF7+lncRNA-SNHG20+CEA的AUC(0.882)、敏感度(79.0%)、特異度(83.3%)均高于聯(lián)合檢測(cè)lncRNA-TCF7+lncRNA-SNHG20+Cyfra21-1的AUC(0.773)、敏感度(73.2%)、特異度(80.2%)。此外,不僅聯(lián)合檢測(cè)lncRNA-TCF7+lncRNA-SNHG20+CEA的敏感度提高,而且檢測(cè)的準(zhǔn)確性也提高,其可能成為NSCLC診斷的新的腫瘤標(biāo)志物。

綜上所述,與良性肺病患者相比, NSCLC患者血漿lncRNA-SNHG20和lncRNA-TCF7呈高表達(dá)。血漿lncRNA-SNHG20和lncRNA-TCF7的高表達(dá)與吸煙史、年齡、性別、病理分型、臨床分期無明顯相關(guān)性。lncRNA-TCF7、lncRNA-SNHG20和CEA聯(lián)合診斷的敏感度及準(zhǔn)確性高于單獨(dú)診斷。但是,目前NSCLC的確診仍需病理學(xué)依據(jù),而早期肺癌多無明顯臨床癥狀, lncRNA-TCF7和lncRNA-SNHG20或可作為分子標(biāo)志物在NSCLC的篩選中發(fā)揮作用。