司峰志, 周 旭

(新疆醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院 耳鼻喉科, 新疆 烏魯木齊, 830000)

炎性反應(yīng)是慢性鼻竇炎伴鼻息肉(CRSwNP)的主要病理改變[1], 如何抑制鼻腔黏膜上皮細(xì)胞的炎性反應(yīng)成為關(guān)鍵。微小RNA(miRNA)是一類非編碼的小分子RNA, 在多種疾病進(jìn)展中發(fā)揮作用[2-4]。miR-142-3p與細(xì)胞的炎性反應(yīng)相關(guān),參與炎性疾病的發(fā)生發(fā)展[5-7]。但有關(guān)miR-142-3p與CRSwNP關(guān)系的研究較少。腫瘤壞死因子-α(TNF-α)可誘導(dǎo)白細(xì)胞介素(IL)-6、IL-10和干擾素γ(IFN-γ)的釋放[8]。研究[9]表明, TNF-α在慢性鼻竇炎患者鼻腔黏膜及血清中高表達(dá)。但TNF-α在CRSwNP炎性反應(yīng)中的作用尚不清楚。本研究通過脂多糖(LPS)處理鼻腔黏膜上皮細(xì)胞建立炎性反應(yīng)模型,觀察miR-142-3p對LPS處理后的鼻腔黏膜上皮細(xì)胞炎性反應(yīng)的影響。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、試劑及儀器

人鼻黏膜上皮細(xì)胞(HNEPC, 長沙豐暉生物有限公司), LPS(L5293, Sigma公司,美國), RPMI-1640(11875101, BI, 以色列), miR-142-3p 上調(diào)、miR-142-3p下調(diào)、空質(zhì)粒及引物(廣州銳博生物有限公司),野生型TNF-α載體(TNF-α-WT)、突變型TNF-α載體(TNF-α-MUT)、TNF-α下調(diào)質(zhì)粒及下調(diào)對照質(zhì)粒(天津擎科生物有限公司), Lipofectamine 3000、TRIzol(L3000015, 15596018, Thermo公司,美國), Luciferase試劑盒(16170, Thermo公司,美國),逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)試劑盒(638315, Tarkara公司,日本),四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)試劑盒(25830, 天津天裔生物有限公司), IL-6、IL-10、IFN-γ及TNF-α酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)試劑盒(EK0410, EK0416, EK0373, EK0527, 武漢博士德生物有限公司),雙熒光素酶報(bào)告基因檢測試劑盒(D0010, 北京Solarbio公司), HBS-1096A酶標(biāo)儀(南京貝燈醫(yī)療器械有限公司), ABI7500型PCR儀(ABI公司,美國)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及模型構(gòu)建: HNEPC使用RPMI-1640培養(yǎng),用不同濃度LPS(0.1、0.5、1.0 μg/mL)處理細(xì)胞,正常培養(yǎng)的細(xì)胞為對照組,培養(yǎng)24、48、72 h。細(xì)胞及上清液中炎性因子含量較對照組下降提示模型構(gòu)建成功[10]。

1.2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染及分組: 將miR-142-3p 上調(diào)、miR-142-3p下調(diào)、空質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染細(xì)胞,用0.5 μg/mL LPS處理記為LPS組、miR-142-3p上調(diào)組、miR-142-3p下調(diào)組、空質(zhì)粒組; 將TNF-α下調(diào)質(zhì)粒及下調(diào)對照質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染至miR-142-3p上調(diào)組細(xì)胞及0.5 μg/mL LPS處理過的細(xì)胞,記為miR-142-3p上調(diào)+TNF-α下調(diào)組、空質(zhì)粒+TNF-α下調(diào)組、TNF-α下調(diào)組及下調(diào)對照組。

1.2.3 MTT檢測細(xì)胞增殖: 每孔1 000～10 000個細(xì)胞接種到96孔板,培養(yǎng)72 h后加入150.0 μL MTT反應(yīng)30 min, 對照組加入等量二甲基亞砜(DMSO), 酶標(biāo)儀檢測490 nm處光密度(OD)值。

1.2.4 實(shí)時熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測細(xì)胞、組織miR-142-3p和IL-6、IL-10、IFN-γ、TNF-αmRNA表達(dá)水平: 取對數(shù)生長期的細(xì)胞,胰酶消化,離心。加入1 mL Trizol利用一步法提取總RNA, 檢測濃度,根據(jù)試劑盒說明書合成cDNA, 反應(yīng)條件為30 ℃ 10 min, 42 ℃ 30 min, 99 ℃ 5 min, 4 ℃ 5 min。按照熒光定量試劑盒說明進(jìn)行PCR, 體系為ddH2O 9.0 μL, TB Green Advantage Premix (2×) 12.5 μL, ROX Dye (50×) 0.5 μL, miRNA-specific primer (10 μmol/L)及mRQ 3′ Primer (10 μmol/L)各0.5 μL, cDNA 2.0 μL。循環(huán)條件為95 ℃ 5 s, 60 ℃ 34 s, 共40個循環(huán),構(gòu)建溶解曲線,相對表達(dá)量用2-△△Ct法計(jì)算。內(nèi)參為GAPDH。引物序列見表1。

表1 引物序列

1.2.5 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測細(xì)胞上清液中IL-6、IL-10、IFN-γ、TNF-α含量: 收集細(xì)胞培養(yǎng)液,離心后保留上清液,采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測細(xì)胞上清液中IL-6、IL-10、IFN-γ、TNF-α OD值,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算濃度。

1.2.6 在線網(wǎng)站預(yù)測miR-142-3p與TNF-α的靶向關(guān)系: 使用TargetScan在線網(wǎng)站(http: //www.targetscan.org/)預(yù)測miR-142-3p與TNF-α的靶向關(guān)系。

1.2.7 熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn): 將空質(zhì)?；騧iR-142-3p上調(diào)質(zhì)粒分別與TNF-α-WT、TNF-α-MUT載體共轉(zhuǎn)染至HNEPC, 48 h后裂解各組細(xì)胞并收集上清液,按照試劑盒說明書檢測細(xì)胞熒光素酶相對活性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 miR-142-3p對HNEPC增殖活性的影響

LPS組細(xì)胞增殖能力高于對照組, miR-142-3p上調(diào)組細(xì)胞增殖能力高于空質(zhì)粒組, miR-142-3p下調(diào)組細(xì)胞增殖能力低于空質(zhì)粒組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05), 見圖1。

2.2 miR-142-3p對HNEPC細(xì)胞炎性因子水平的影響

LPS組細(xì)胞IL-6、IL-10、IFN-γ和TNF-α蛋白及其mRNA表達(dá)水平高于對照組, miR-142-3p上調(diào)組細(xì)胞相關(guān)炎性因子表達(dá)水平高于空質(zhì)粒組, miR-142-3p下調(diào)組細(xì)胞相關(guān)炎性因子表達(dá)水平低于空質(zhì)粒組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05), 見圖2、圖3。

2.3 TNF-α對HNEPC細(xì)胞炎性因子表達(dá)水平的影響

TNF-α下調(diào)組細(xì)胞IL-6、IL-10、IFN-γ和TNF-αmRNA及其細(xì)胞上清液中蛋白表達(dá)水平低于下調(diào)對照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05), 見圖4、圖5。

2.4 miR-142-3p與TNF-α的靶向關(guān)系

生物信息學(xué)預(yù)測發(fā)現(xiàn),TNF-α與miR-142-3p存在一定的結(jié)合位點(diǎn)。miR-142-3p上調(diào)+TNF-α-WT組熒光素酶活性高于空質(zhì)粒+TNF-α-WT組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見圖6。

2.6 TNF-α抑制劑對miR-142-3p過表達(dá)的影響

miR-142-3p上調(diào)+TNF-α下調(diào)組細(xì)胞TNF-αmRNA及其蛋白表達(dá)水平低于miR-142-3p上調(diào)組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01), 見圖6。

3 討 論

CRSwNP的發(fā)病機(jī)制尚未闡明,炎癥反應(yīng)在CRSwNP的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用[11], 探討調(diào)控CRSwNP炎癥反應(yīng)的機(jī)制意義重大。

miRNA在調(diào)控CRSwNP炎癥反應(yīng)中發(fā)揮作用[2-4]。多種腫瘤中miR-142-3p差異表達(dá),其與腫瘤的惡性生物學(xué)行為有關(guān)[12-14]。此外, miR-142-3p在炎癥性疾病中也異常表達(dá)[5-7]。但miR-142-3p在CRSwNP中的作用尚不清楚。LPS誘導(dǎo)HNEPC是研究CRSwNP的常用模型[15]。本研究結(jié)果顯示, LPS誘導(dǎo)的HNEPC增殖能力增強(qiáng),且轉(zhuǎn)染miR-142-3p過表達(dá)可增強(qiáng)細(xì)胞增殖能力。研究[16-17]表明, 炎性因子在CRSwNP鼻腔黏膜組織中高表達(dá),與疾病的進(jìn)展相關(guān)。本研究結(jié)果顯示, LPS誘導(dǎo)的HNEPC高表達(dá)IL-6、IL-10、IFN-γ及TNF-α, 細(xì)胞上調(diào)miR-142-3p可升高炎性因子的表達(dá),下調(diào)miR-142-3p可抑制炎性因子的表達(dá),提示miR-142-3p具有促進(jìn)CRSwNP炎癥反應(yīng)的功能。

miRNA一般通過與下游的靶基因3′-UTR結(jié)合發(fā)揮作用。本研究首先通過生物信息學(xué)預(yù)測了miR-142-3p的靶基因,發(fā)現(xiàn)TNF-α基因mRNA 3′-UTR與miR-142-3p存在互補(bǔ)的堿基對。TNF-α可增強(qiáng)炎性細(xì)胞的吞噬、分泌功能,還可調(diào)控多種信號通路,促進(jìn)炎性因子的分泌[18-20]。研究[21-23]表明, LPS刺激的多種細(xì)胞可高表達(dá)TNF-α。研究[24-25]發(fā)現(xiàn), LPS可增加HNEPC中TNF-α的表達(dá),與本研究結(jié)果一致。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),下調(diào)LPS誘導(dǎo)的HNEPC的TNF-α表達(dá)后,細(xì)胞IL-6、IL-10、IFN-γ表達(dá)水平也顯著下降,提示TNF-α調(diào)控LPS誘導(dǎo)的HNEPC炎性反應(yīng)。本研究采用熒光素酶實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證miR-142-3p對TNF-α的直接調(diào)節(jié)作用,結(jié)果表明, miR-142-3p與TNF-α具有靶向關(guān)系。上述結(jié)果證實(shí)TNF-α是miR-142-3p的靶基因, miR-142-3p可靶向促進(jìn)TNF-α表達(dá)。但本研究存在一定局限性:首先,本研究入選病例數(shù)較少,有待增加樣本量進(jìn)一步驗(yàn)證miR-142-3p、TNF-α的表達(dá)情況;其次,對于miR-142-3p調(diào)控炎癥反應(yīng)的信號通路需要進(jìn)一步探討。

綜上所述, miR-142-3p、TNF-α在LPS誘導(dǎo)的HNEPC中表達(dá)升高。上調(diào)miR-142-3p可顯著增強(qiáng)LPS誘導(dǎo)后HNEPC的增殖和相關(guān)炎癥因子的表達(dá)。TNF-α是miR-142-3p的靶基因,提示miR-142-3p可能通過調(diào)控TNF-α發(fā)揮抑制作用。