孫潺 張軒斌 趙江 代巖

肺癌屬于較為常見的肺原發(fā)性惡性腫瘤疾病,發(fā)病率及死亡率均比較高,對人們身心健康造成很大威脅[1]?？鼓[瘤藥物治療是臨床治療肺癌的一種主要方法[2]。然而,抗腫瘤藥物比較多,其抗腫瘤效果也不盡相同[3-4]。雷帕霉素是一種新型免疫抑制劑,早先用于肝移植中發(fā)現(xiàn)其具有良好的抗排斥作用[5]。近年來,隨著雷帕霉素在臨床中的的逐步應用,人們發(fā)現(xiàn)其也有一定的抗腫瘤特性,可以抑制肝癌[6]、鼻咽癌[7]、骨肉瘤[8]等細胞的生長及轉移。但是,目前關于雷帕霉素對肺癌細胞的影響及作用機制的研究尚不多。本研究旨在通過體外培養(yǎng)人肺癌SPC-A-1細胞,分析不同濃度梯度的雷帕霉素處理SPC-A-1細胞后,對細胞增殖及凋亡產生的影響,并探究其可能的作用機制。

資料與方法

一、材料

人肺癌SPC-A-1細胞購自上海弘順生物科技有限公司。胰酶購自江蘇凱基生物技術股份有限公司。胎牛血清購自鄭州九龍生物制品有限公司。雷帕霉素購自廣州碩恒生物科技有限公司。CCK-8試劑盒購自南京諾唯贊生物科技有限公司。FITC-Annexin V/PI雙染色法細胞凋亡試劑盒購自上海莼試生物技術有限公司。

p53、Bax、Bcl-2、GAPDH等抗體購自廣州奕源生物科技有限公司公司。倒置顯微鏡購自德國徠卡集團有限公司。酶標儀購自北京凱奧科技發(fā)展有限公司。流式細胞儀購自貝克曼庫爾特商貿(中國)有限公司。

二、方法

1 CCK-8法測定SPC-A-1細胞增殖 選擇對數(shù)生長期的SPC-A-1細胞,采用胰酶溶液將其消化成為單細胞的懸液,并將其接種在96孔板上。其中,空白對照組(雷帕霉素,0 ng/mL)和雷帕霉素組分別設置5個復孔,每個孔滴入200 μL的SPC-A-1細胞懸液,過夜,空白對照組給予換用200μL的新鮮培養(yǎng)基,雷帕霉素組分別換用200μL含有不同濃度(5 ng/mL,10 ng/mL,15 ng/mL)雷帕霉素的培養(yǎng)基,放入37℃,5%二氧化碳條件下的培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。培養(yǎng)48h之后,于避光的環(huán)境中,在每孔滴入20 μL的CCK-8溶液,然后再孵育3h。采用酶標儀測定對每孔的吸光度(波長為450 nm)進行測定。算出各組SPC-A-1細胞增殖抑制率。細胞增殖抑制率(%)=(空白對照組吸光度值-雷帕霉素組吸光度值)/空白對照組吸光度值 ×100%。

2 FITC-Annexin V/PI雙染色法測定SPC-A-1細胞凋亡 選擇對數(shù)生長期的SPC-A-1細胞,采用胰酶溶液將其消化成為單細胞的懸液,并將其接種在6孔培養(yǎng)板上。過夜,SPC-A-1細胞貼壁之后,空白對照組換用新鮮培養(yǎng)基,雷帕霉素組分別換用含有不同濃度(5 ng/mL,10 ng/mL,15 ng/mL)雷帕霉素的培養(yǎng)基,并再培養(yǎng)48h。采用不含EDTA的胰蛋白酶對SPC-A-1細胞進行消化;運用PBS溶液對SPC-A-1細胞洗滌2次,離心5 min,收集SPC-A-1細胞,并加入FITC-Annexin V/PI試劑盒混勻,于避光及室溫條件下再次孵育20 min。采用流式細胞儀測定各組SPC-A-1細胞凋亡率。

3 Western Blot法測定凋亡蛋白表達水平 選擇對數(shù)生長期的SPC-A-1細胞,采用胰酶溶液將其消化成為單細胞的懸液,并將其接種在6孔培養(yǎng)板上。過夜,SPC-A-1細胞貼壁之后,空白對照組換用新鮮培養(yǎng)基,雷帕霉素組分別換用含有不同濃度(5 ng/mL,10 ng/mL,15 ng/mL)雷帕霉素的培養(yǎng)基,并再使用培養(yǎng)箱培養(yǎng)48h。隨后,每孔滴入200μL細胞裂解液,在冰上裂解半小時之后,離心25 min后收集上清,冷藏備用。運用BCA法實施蛋白定量操作之后,實施SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳操作,轉膜完畢,使用Western洗滌液對蛋白膜進行漂洗2 min,滴入Western封閉液,加入一抗(p53、Bcl-2、Bax)稀釋液(1:5000),加入二抗(辣根過氧化物酶標記的IgG抗體)稀釋液,顯影掃描。所測蛋白相對表達量=目標蛋白條帶的灰度值/內參β-actin的灰度值。

三、統(tǒng)計學處理

結 果

一、SPC-A-1細胞增殖的對比

5 ng/mL,10 ng/mL,15 ng/mL雷帕霉素處理后的SPC-A-1細胞增殖數(shù)較空白對照組顯著下降(P<0.05),增殖抑制率顯著上升(P<0.05),且增殖抑制率與雷帕霉素存在劑量依賴性的關系(見圖1、表1)。

圖1 雷帕霉素對SPC-A-1細胞增殖的抑制作用注:與對照組比較,*P<0.05

表1 各組SPC-A-1細胞增殖的對比

二、SPC-A-1細胞凋亡的對比

與空白對照組比較,5 ng/mL,10 ng/mL,15 ng/mL雷帕霉素處理組的細胞凋亡率均有顯著性上升(均P<0.05),其中15 ng/mL雷帕霉素處理組細胞凋亡率最高,其凋亡率變化存在劑量依賴性關系。隨著雷帕霉素處理濃度的升高,處于G0/G1期的細胞比例明顯上升(P<0.05),處于S期或G2/M期的細胞比例明顯下降(P<0.05),表明雷帕霉素可將SPC-A-1細胞增殖阻滯于G0/G1期(見表2)。

表2 SPC-A-1細胞凋亡的對比

三、SPC-A-1細胞凋亡蛋白p53、Bcl-2、Bax表達水平的對比

與空白對照組比較,5 ng/mL,10 ng/mL,15 ng/mL雷帕霉素處理SPC-A-1細胞后的p53、Bax蛋白水平上升,Bcl-2蛋白水平下降(P<0.05)(見圖2,圖3)。

圖2 Western Blot法測定細胞凋亡蛋白p53、Bax、Bcl-2的表達水平A:空白對照組;B:5 ng/mL 雷帕霉素;C:10 ng/mL 雷帕霉素; D:15 ng/mL雷帕霉素

圖3 細胞凋亡蛋白p53、Bax、Bcl-2的相對表達量的對比注:與空白對照組比較,*P<0.05

四、p53、Bax、Bcl-2蛋白表達水平與細胞凋亡率的相關性

取上述3板15 ng/mL雷帕霉素處理組細胞,經15 ng/mL雷帕霉素處理72h后,15 ng/mL雷帕霉素處理組細胞p53、Bax蛋白表達水平均與細胞凋亡率呈正相關(r=0.906,P<0.05;r=0.938,P<0.05);Bcl-2蛋白表達水平與細胞凋亡率呈負相關(r=-0.712,P<0.05),表明p53、Bax蛋白能促進SPC-A-1細胞凋亡,Bcl-2蛋白能抑制SPC-A-1細胞凋亡(見圖4～6)。

圖4 p53蛋白表達水平與細胞凋亡率呈正相關(r=0.906,P<0.05)

圖5 Bax蛋白表達水平與細胞凋亡率呈正相關(r=0.938,P<0.05)

圖6 Bcl-2蛋白表達水平與細胞凋亡率呈負相關(r=-0.712,P<0.05)

討 論

細胞增殖、凋亡和癌細胞死亡緊密相關[9]。Rastegar等人研究發(fā)現(xiàn)[10],雷帕霉素可誘導肝癌細胞凋亡。有研究表明[11],雷帕霉素聯(lián)合奧沙利鉑具有協(xié)同效應,可以有效誘導HCT116結腸癌細胞發(fā)生凋亡。本研究發(fā)現(xiàn),雷帕霉素體外處理人肺癌SPC-A-1細胞后對細胞的增殖具有抑制作用,對細胞凋亡具有誘導作用,且其作用呈劑量依賴性。此結論與?；蹚┑葓蟮赖睦着撩顾乜梢砸种品伟┘毎l(fā)生增殖,誘導其凋亡的的研究結果基本一致[12]。

癌細胞增殖、凋亡均受到多種基因的正性調控與負性調控,其增殖、凋亡機制均較為復雜。p53抑癌基因p53屬于一種較為重要的抑癌基因,它發(fā)生突變跟人類腫瘤密切相關[13]。Bcl-2的表達水平的高低與癌細胞存活至關重要。有研究顯示[14],Bcl-2轉錄調控與卵巢癌細胞的增殖及凋亡密切相關。Bax是一種重要的促凋亡基因。已有研究證實[15],Bax可以促進肝癌細胞凋亡。本研究顯示,與對照組(雷帕霉素,0 ng/mL)比較,5 ng/mL,10 ng/mL,15 ng/mL雷帕霉素處理對SPC-A-1細胞的凋亡率上升(P<0.05),且p53與Bax蛋白水平增加(P<0.05),而Bcl-2蛋白水平下降(P<0.05)。此外,本研究還發(fā)現(xiàn),15 ng/mL雷帕霉素處理組細胞p53、Bax蛋白表達水平均與細胞凋亡率呈正相關(r=0.906,P<0.05;r=0.938,P<0.05);Bcl-2蛋白表達水平與細胞凋亡率呈負相關(r=-0.712,P<0.05)。提示,雷帕霉素抑制人肺癌SPC-A-1細胞發(fā)生增殖并可促進其發(fā)生凋亡的作用機制,可能與雷帕霉素可以上調p53、Bax蛋白表達水平和下調Bcl-2蛋白表達水平相關。

綜上,本實驗研究表明,雷帕霉素對人肺癌SPC-A-1細胞增殖具有抑制作用,在48h內可以有效地誘導人肺癌SPC-A-1細胞發(fā)生凋亡。本實驗結果為更好地開發(fā)利用雷帕霉素的抗腫瘤作用提供了一定的參考依據(jù)。