王靚賢，賈 鰻，李科先，冉 苒，康燕山，高林瑞

（云南大益微生物技術(shù)有限公司，云南 昆明 650000）

近年來(lái)，隨著科技的發(fā)展和人們生活水平的提高，消費(fèi)者在購(gòu)買(mǎi)發(fā)酵食品時(shí)會(huì)越來(lái)越注重發(fā)酵食品的口感、風(fēng)味、菌株來(lái)源等，因此西藏牦牛原料乳及發(fā)酵乳中的微生物成為廣大科研工作者的研究熱點(diǎn)，尤其是從乳制品中分離出來(lái)的目錄內(nèi)菌株，更是吸引了很多的學(xué)者對(duì)其進(jìn)行深入研究[1-2]。

釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）是一種單細(xì)胞生物，同時(shí)也是最重要的模式生物，其生長(zhǎng)速度快、pH 適應(yīng)性廣、耐高滲透、高產(chǎn)酒精、富含多種營(yíng)養(yǎng)元素、易于分離和培養(yǎng)的特性使釀酒酵母更方便在各領(lǐng)域進(jìn)行研究及應(yīng)用[3]。目前，釀酒酵母在日常食品生產(chǎn)中占據(jù)重要作用，一直作為面包、饅頭、乳制品以及釀造葡萄酒和啤酒等產(chǎn)品的發(fā)酵菌株，可增加面包、饅頭、釀造酒的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值、口感、風(fēng)味[4-9]。近年來(lái)，釀酒酵母還進(jìn)行注射疫苗抗原生產(chǎn)，使用重組型釀酒酵母進(jìn)行HPV 和乙肝病毒抗原的培養(yǎng)純化，安全且抗原得率高[10]。由于釀酒酵母具有安全性，還可與腸上皮細(xì)胞相互作用，誘發(fā)機(jī)體粘膜免疫應(yīng)答等特性，有學(xué)者正在進(jìn)行基于釀酒酵母表面展示技術(shù)構(gòu)建寨卡（ZIKV）、甲型流感等病毒的口服疫苗的研究[11-12]。

馬克斯克魯維酵母（Kluyveromyces marxianus）由于普遍酒精產(chǎn)量不高，應(yīng)用較少，在酸奶生產(chǎn)中易引起漲袋，需要遏制其生長(zhǎng)[13-14]。馬克斯克魯維酵母目前對(duì)其的研究及應(yīng)用相較于釀酒酵母均較少，但其菌株性能穩(wěn)定，產(chǎn)香性能較好，發(fā)酵的食品感官較好，因此常常單獨(dú)或與乳酸菌一起用于發(fā)酵乳制品，生產(chǎn)低酒精度、氣味芳香怡人的奶啤、乳清等低醇發(fā)酵型風(fēng)味飲料[15-16]；或進(jìn)行納豆、稀奶油等食品的發(fā)酵風(fēng)味研究及工藝優(yōu)化[17-18]；或進(jìn)行混合發(fā)酵提升冰酒、黃酒的風(fēng)味及感官品質(zhì)[19-20]。

總而言之，釀酒酵母及馬克斯克魯維酵母具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和科研意義，但目前對(duì)于馬克斯克魯維酵母的研究和應(yīng)用都比較少見(jiàn)，而針對(duì)高原藏區(qū)來(lái)源的酵母菌的研究及應(yīng)用就更為稀少。本研究中，以從高原藏區(qū)乳制品中分離得到的釀酒酵母及馬克斯克魯維酵母為生物材料，對(duì)其進(jìn)行了生理特性及食品發(fā)酵方面的一系列研究，為后期研究及應(yīng)用奠定基礎(chǔ)且提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

2021年在云南大益微生物技術(shù)有限公司內(nèi)，對(duì)多個(gè)藏區(qū)來(lái)源的酸奶進(jìn)行分離，研究中使用的是其中分離保藏的7 株酵母菌，菌株具體信息見(jiàn)表1。

表1 菌株信息

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 最適生長(zhǎng)溫度研究

將OD600=1.0 的菌懸液稀釋后涂布于YPD 固體培養(yǎng)基上，分別放置于25 ℃、30 ℃、35 ℃、40 ℃、45℃條件下培養(yǎng)48 h 后取出計(jì)數(shù)。

將OD600=1.0 的菌懸液按1%比例接種于牛奶試管中，將牛奶試管分別置于25 ℃、30 ℃、35 ℃、40 ℃、45 ℃條件下培養(yǎng)24 h 后取出稀釋涂布后計(jì)數(shù)。

1.2.2 碳源替換研究

將OD600=0.5 的菌懸液按1%體積比分別接種于葡萄糖、麥芽糖、D-木糖、乳糖、蔗糖YPD 液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)32 h，期間每隔4 h 取樣測(cè)量其OD600 值。

1.2.3 產(chǎn)氣能力研究

將OD600=0.5 的菌懸液取100 μL 分別接種于含杜氏小管的YPD 液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)24 h，取出觀察產(chǎn)氣現(xiàn)象。

1.2.4 溶血試驗(yàn)

于血平板上進(jìn)行各菌株的劃線，37 ℃培養(yǎng)48 h后取出觀察有無(wú)溶血反應(yīng)。

1.2.5 葡萄糖及乙醇耐受性測(cè)定

將OD600=0.5 的菌懸液按1%體積比分別接種于含20 g·L-1、40 g·L-1、60 g·L-1、80 g·L-1、100 g·L-1、120 g·L-1葡萄糖的YPD 液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)，24 h 和48 h 時(shí)取出分別測(cè)定其OD600 值。

1.2.6 乙醇耐受性測(cè)定

將OD600=0.5 的菌懸液按1%體積比分別接種于含0%、1%、3%、6%、9%、12%、15%乙醇的YPD 液體培養(yǎng)基中37 ℃培養(yǎng)，24 h 和48 h 時(shí)取出分別測(cè)定其OD600 值。

1.2.7 牛奶發(fā)酵研究

將OD600=2.0 的菌懸液按1%體積比接種于奶茶及牛奶中，置于37 ℃條件下分別培養(yǎng)12 h、22 h、36 h取出，測(cè)定發(fā)酵前后pH 值，并進(jìn)行風(fēng)味評(píng)估。

1.2.8 茶湯發(fā)酵研究

將OD600=2.0 的菌懸液按1%體積比接種于茶湯中，置于37 ℃條件下培養(yǎng)12 h 取出，測(cè)定發(fā)酵前后pH 值，并進(jìn)行風(fēng)味評(píng)估。

2 結(jié)果與分析

2.1 7 株酵母菌生理特性研究

2.1.1 最適生長(zhǎng)溫度測(cè)定

由圖1 可知，各菌株溫度耐受存在一定差異，但35 ℃條件下長(zhǎng)勢(shì)均比較良好。在利用牛奶發(fā)酵時(shí)，各菌株溫度耐受差異較大，綜合來(lái)看40 ℃條件下長(zhǎng)勢(shì)較好，但其中菌株11783 隨著溫度升高活菌數(shù)不斷增加，45 ℃時(shí)有效活菌數(shù)顯著較高。

圖1 7 株酵母菌最適生長(zhǎng)溫度測(cè)定

2.1.2 碳源替換生長(zhǎng)曲線測(cè)定

由圖2 可知，在碳源為常用的葡萄糖時(shí)，除菌株11708 外，其余6 株菌的菌株數(shù)量均在15 h 后無(wú)顯著增加；在24 h 后菌株11708 生長(zhǎng)略顯緩慢，其菌株數(shù)量無(wú)明顯增加；碳源替換后，7 株酵母菌對(duì)不同碳源表現(xiàn)出了顯著的個(gè)體性差異，但均更能適應(yīng)葡萄糖和蔗糖，且當(dāng)碳源為蔗糖時(shí)，長(zhǎng)勢(shì)較葡萄糖更好。

圖2 7 株酵母菌糖替換生長(zhǎng)曲線

2.1.3 產(chǎn)氣能力測(cè)定

由表2 可知，培養(yǎng)24 h 后，菌株11704、11708 無(wú)產(chǎn)氣反應(yīng)；菌株11714 產(chǎn)氣較少；菌株11701、11703產(chǎn)氣較多，杜氏小管中有一半氣體；菌株11783、11595產(chǎn)氣最多，氣體充滿(mǎn)整個(gè)杜氏小管。

表2 7 株酵母菌產(chǎn)氣能力測(cè)定

2.1.4 溶血試驗(yàn)

由表3 可知，7 株酵母菌溶血反應(yīng)均為陰性，表明7 株酵母菌均不產(chǎn)生可使紅血球細(xì)胞溶解的溶血素。

表3 7 株酵母菌溶血試驗(yàn)

2.1.5 葡萄糖耐受性測(cè)定

由圖3 可知，7 株酵母菌在培養(yǎng)時(shí)間為24 h 時(shí)，菌株11701、11703、11783 的OD600 值變化較大，在葡萄糖濃度為40 g·L-1時(shí)，OD600 值大幅下降，當(dāng)濃度高于60 g·L-1后，OD600 值無(wú)顯著變化；而在培養(yǎng)48 h 后，7 株菌中只有菌株11701 對(duì)培養(yǎng)條件中葡萄糖濃度較為敏感，當(dāng)葡萄糖濃度高于40 g·L-1時(shí)，OD600值大幅降低，其余菌株無(wú)較大變化。

圖3 葡萄糖耐受性測(cè)定

2.1.6 乙醇耐受性測(cè)定

由圖4 可知，7 株酵母菌中乙醇耐受最弱的為菌株11708，只能耐受3%以下的乙醇濃度，菌株11703、11704、11783、11595 耐受性稍好，在乙醇濃度為3%時(shí)，生長(zhǎng)不受影響，濃度為6%時(shí)，表現(xiàn)為不耐受，而菌株11714 及11701 耐受性較好，可耐受6%的乙醇濃度，其中耐受性較強(qiáng)的菌株11701，6%乙醇濃度對(duì)其生長(zhǎng)無(wú)明顯影響。

圖4 乙醇耐受性測(cè)定

2.2 食品發(fā)酵研究

2.2.1 牛奶發(fā)酵

由圖5 可知，從開(kāi)始發(fā)酵后，隨著時(shí)間的推移，各處理pH 值均呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，發(fā)酵12 h 后均有一定程度的降低，但各處理間差異并不明顯；發(fā)酵22 h 后pH值繼續(xù)降低，其中菌株11701、11783 較低，pH 值分別為5.70、5.50；發(fā)酵36 h 后各處理pH 值均在6.0 以下，其中菌株11701、11595、11783 較低，pH 值分別為5.67、5.56、4.86。

圖5 牛奶發(fā)酵前后酸堿度變化

在進(jìn)行牛奶發(fā)酵時(shí)，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，7 株酵母菌均出現(xiàn)凝固現(xiàn)象，除菌株11703、11708 無(wú)乳清析出外，其余處理均有乳清析出現(xiàn)象；在風(fēng)味口感方面，菌株11704 風(fēng)味不佳，發(fā)酵12 h 后，菌株11701、11714、11783 具有奶啤風(fēng)味且氣泡感強(qiáng)，其余均為普通乳酸飲品風(fēng)味；而隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，最終均為奶啤風(fēng)味。

2.2.2 茶湯發(fā)酵

由圖6 可知，生普洱茶湯發(fā)酵12 h 后，各處理pH均有顯著下降，除菌株11783 pH 值為5.19 外，其余均下降至5.0 以下，菌株11701、11703 較低，pH 值分別為4.54、4.47。熟普洱茶湯發(fā)酵12 h 后，各處理pH 也呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，其中菌株11714、11783 較低，pH 值分別為4.51、4.43。

圖6 茶湯發(fā)酵前后酸堿度變化

7 株酵母菌均能在生茶、熟茶茶湯中生長(zhǎng)，在發(fā)酵12 h 后，均有明顯產(chǎn)氣現(xiàn)象，其中，菌株11701、11704、11714、11783 風(fēng)味較佳，同時(shí)具有茶香與酒香，兩種香氣較為協(xié)調(diào)，且有氣泡感。

3 結(jié)論

本研究7 株酵母菌代謝物均無(wú)溶血素，對(duì)人體無(wú)害，其生理特性符合一般酵母菌特征，與李新玲等人的結(jié)果一致[16]。對(duì)牛奶及茶湯發(fā)酵試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，菌株11701、11703、11714、11783 發(fā)酵牛奶具有奶啤風(fēng)味且氣泡感強(qiáng)，菌株11701、11704、11714、11783風(fēng)味較佳，同時(shí)具有茶香與酒香，兩種香氣較為協(xié)調(diào)，且有氣泡感，最終得出菌株11701、11703、11704、11714、11783 的發(fā)酵特性更適宜進(jìn)行后期的相應(yīng)研究及應(yīng)用，但其不能耐受>6%的乙醇，按照一般乙醇耐受分類(lèi)，可劃分為乙醇耐受能力差[21]。而針對(duì)菌株乙醇耐受性差的問(wèn)題，目前已有許多提高酵母菌乙醇耐受性的研究，例如利用乳酸菌共培養(yǎng)、原生質(zhì)體融合、紫外線照射、基因重組技術(shù)等方法都可以針對(duì)性的提高酵母菌對(duì)乙醇的耐受性[21-23]，到時(shí)可根據(jù)不同用途及發(fā)酵條件再選取具有相應(yīng)特性的菌株。

本研究中，以從高原藏區(qū)乳制品中分離得到的釀酒酵母及馬克斯克魯維酵母為生物材料，對(duì)其進(jìn)行了生理特性及食品發(fā)酵方面的一系列研究，發(fā)現(xiàn)菌株11701、11703、11704、11714、11783 較為適宜進(jìn)行低醇風(fēng)味乳制品或者茶酒的發(fā)酵，也再一次證實(shí)馬克斯克魯維酵母在發(fā)酵風(fēng)味上的優(yōu)越性，為日后深入研究并將菌株應(yīng)用于乳制品或其他發(fā)酵食品的生產(chǎn)中奠定了基礎(chǔ)且提供了數(shù)據(jù)支撐，以便未來(lái)實(shí)現(xiàn)產(chǎn)學(xué)研一體化，從而達(dá)到實(shí)現(xiàn)真正意義上的以科研服務(wù)企業(yè)、服務(wù)消費(fèi)者。