吳格怡 黃心蔚 鄭美喬 劉嘉慧

(廣東醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院呼吸與危重癥學(xué)科,湛江,524000)

阻塞性睡眠呼吸暫停低通氣綜合征(Obstructive Sleep Apnea-hypopnea Syndrome,OSAHS)是臨床常見而又容易忽略的疾病,可引起多臟器損害,可并發(fā)原發(fā)性高血壓、糖尿病、冠心病、心腦血管意外等全身性疾病,其根本原因?yàn)橐归g的慢性間歇低氧引起的損害[1-3]。核轉(zhuǎn)錄因子-κB(NF-κB)是一種核轉(zhuǎn)錄因子,有觀點(diǎn)認(rèn)為OSAHS反復(fù)發(fā)作的呼吸暫停和低通氣可激活一系列炎癥相關(guān)機(jī)制,如慢性間歇缺氧條件下NF-κB的活化[4]。NF-κB與OSAHS之間的關(guān)系尚不十分明確。本研究觀察核轉(zhuǎn)錄因子-κB(NF-κB)在正常大鼠及慢性間歇低氧大鼠的表達(dá)差異及其信號通路介導(dǎo)的慢性間歇低氧大鼠機(jī)體多種炎癥因子變化。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 選擇廣東醫(yī)科大學(xué)動物研究實(shí)驗(yàn)中心提供標(biāo)準(zhǔn)SD雄性大鼠30只,體質(zhì)量(210±20)g,實(shí)驗(yàn)動物合格證號:SYXK(粵)2020-0034。所有大鼠均在正常環(huán)境中以普通飼料及飲用水喂養(yǎng)8周。

1.1.2 藥物 苯甲基磺酰氟(PMSF)裂解液(上海谷研實(shí)業(yè)有限公司,GOYK97200),10%水合氯醛(上海酶聯(lián)生物科技有限公司,貨號:mlsw-2012)。

1.1.3 試劑與儀器 間歇缺氧艙(S1008型,間歇氧濃度控制系統(tǒng),上海玉研科學(xué)儀器有限公司),酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)血清單核細(xì)胞趨化蛋白-1試劑盒(MCP-1,上?；钌锟萍加邢薰?貨號:HBP37057R)、腫瘤壞死因子-α試劑盒(TNF-α,西格瑪奧德里奇(上海)貿(mào)易有限公司,貨號:T6674-10UG,)、白細(xì)胞介素-6試劑盒(IL-6,上?；钌锟萍加邢薰?貨號:HBP31372R)、IL-8試劑盒(上?；钌锟萍加邢薰?貨號:HBP31375R)、C-反應(yīng)蛋白試劑盒(CRP,深圳瑞清生物信息科技有限公司,貨號:RQ-P-R0128,),十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)凝膠制備試劑盒((克拉瑪爾)上海譜振生物科技有限公司),TBST洗滌緩沖液(深圳逗點(diǎn)生物技術(shù)有限公司,貨號:TBST-510),辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG二抗(南京沃博生物科技有限公司,貨號:A21020),超敏ECL化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒WB顯影液(南京江苑生物科技有限公司,貨號:JY01051)。

1.2 方法

1.2.1 分組與干預(yù)方法 按隨機(jī)原則分為觀察組大鼠15只,對照組大鼠15只。對照組正常關(guān)燈睡眠。觀察組大鼠放養(yǎng)于間歇缺氧艙內(nèi),每日9:30—16:30開艙,每日共7h,間歇向艙內(nèi)循環(huán)充入氮?dú)庵圃炻蚤g歇缺氧,8min為一個(gè)循環(huán),使艙內(nèi)氧濃度維持在8.5%～21%之間,以模擬阻塞性睡眠呼吸暫停呼吸時(shí)患者的缺氧狀態(tài)。直視下抽取大鼠腹主動脈血檢測動脈血?dú)夥治鲋笜?biāo),直至提示達(dá)重度OSAHS表示造模成功。

1.2.2 檢測方法 暴露結(jié)束后，于第8周將各組大鼠心臟采血后注射10%水合氯醛麻醉后處死。血液4 ℃靜置、離心，上清液于-80 ℃凍存以備酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測血清MCP-1、TNF-α、IL-6、IL-8、CRP含量。。處死后迅速整取其肺臟、心臟及腦組織，并將取出組織于液氮中冷卻迅速凍存以備蛋白質(zhì)印跡法(Western Blotting)檢測NF-κB蛋白的表達(dá)。

1.2.3 檢測指標(biāo)與方法 1)ELISA檢測:稀釋標(biāo)準(zhǔn)品后,嚴(yán)格按ELISA說明書操作,在樣品孔中加入待檢炎癥因子標(biāo)本,封板膜封板,4 ℃過夜。取出后室溫2 h,洗板;37 ℃室溫下加入一抗孵育2 h,反復(fù)洗滌清除殘留物;37 ℃室溫下加入二抗孵育2 h,再洗滌。避光顯色后終止反應(yīng),加入酶標(biāo)儀中比色,分別計(jì)算2組血清MCP-1、TNF-α、IL-6、IL-8、CRP含量。2)Western Blotting檢測:取出凍存的大鼠腦、心、肺組織,解凍后去血去污,液氮冰上研磨至粉末狀。加入含苯甲基磺酰氟(PMSF)的裂解液400 μL,于勻漿器中勻漿,冰上孵育30 min后移入離心管,4 ℃離心15 000 r/min,20 min,取上清細(xì)胞裂解液用BCA法檢測蛋白濃度。蛋白樣品沸水加熱5 min充分變性蛋白。制好十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)凝膠后加入1×上樣緩沖液,蛋白樣品冷卻后加樣進(jìn)行電泳,電泳電壓100 V,時(shí)間為90 min,結(jié)束后轉(zhuǎn)膜,洗滌,5%脫脂奶粉室溫封閉2 h。TBST洗滌緩沖液洗膜3次,加入1∶1 000比例一抗搖床上緩慢4 ℃孵育過夜,TBST洗滌緩沖液洗膜3次;加入1∶1 000辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG二抗搖床上緩慢4 ℃孵育過夜,再TBST洗滌緩沖液洗膜3次。ECL化學(xué)發(fā)光顯影液顯影,凝膠成像系統(tǒng)曝光,分析NF-κB蛋白的表達(dá)。

2 結(jié)果

2.1 2組大鼠腦、心、肺組織中NF-κB蛋白的表達(dá) 觀察組大鼠腦、心、肺組織中NF-κB蛋白表達(dá)均明顯高于對照組(見圖1、圖2、圖3);觀察組腦、心、肺組織NF-κB灰度值比較與蛋白表達(dá)相符,均高于對照組(均P<0.01)(見圖4,圖5、圖6);腦、心、肺組織NF-κB蛋白相對表達(dá)量差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.01)(見表1)。本研究結(jié)果顯示,在慢性間歇低氧大鼠器官組織中,NF-κB蛋白均為高表達(dá)。

圖1 2組腦組織NF-κB蛋白表

圖2 2組心組織NF-κB蛋白表達(dá)

圖3 2組肺組織NF-κB蛋白表達(dá)

圖4 2組大鼠腦組織NF-κB蛋白比較

圖5 2組大鼠心組織NF-κB灰度值比較

圖6 2組大鼠肺NF-κB灰度值比較

表1 2組大鼠腦、心、肺組織中NF-κB蛋白相對表達(dá)量比較

2.2 2組大鼠動脈血清MCP-1、TNF-α、IL-6、IL-8、CRP水平比較 觀察組血清MCP-1、TNF-α、IL-6、IL-8、CRP水平均升高,與對照組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),慢性間歇低氧大鼠多種炎癥介質(zhì)均升高。見表2。

表2 2組大鼠血清MCP-1、TNF-α、IL-6、IL-8、CRP水平比較

3 討論

NF-κB是一種核蛋白,在基因轉(zhuǎn)錄中至關(guān)重要。同時(shí),其生物學(xué)活性廣泛,主管著免疫和炎癥反應(yīng),調(diào)控炎癥介質(zhì)和細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)錄。當(dāng)外界因素刺激時(shí),inhibitor of NF-κB(IκB)磷酸化,原有的NF-κB/I-κB復(fù)合體解離,NF-κB游離出來并被轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞核內(nèi),啟動靶基因轉(zhuǎn)錄,生成相應(yīng)的mRNA[5]。

MCP-1蛋白由單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞或細(xì)支氣管上皮細(xì)胞產(chǎn)生,作為單核細(xì)胞浸潤的主要因子,MCP-1與NF-κB關(guān)系密切,并受NF-κB調(diào)控。因此,慢性間歇低氧大鼠體內(nèi)NF-κB可能是MCP-1增加的主因[6]。糖尿病患者體內(nèi)可發(fā)現(xiàn)二者均有增高,而抑制了腎臟NF-κB活性后,NF-κB表達(dá)減少,MCP-1的產(chǎn)生及巨噬細(xì)胞浸潤也可隨之減少,腎臟炎癥狀態(tài)隨之緩解[7]。

慢性間歇低氧大鼠體內(nèi)的多種炎癥介質(zhì)、因子包括TNF-α、IL-6、IL-8等均由NF-κB調(diào)控、轉(zhuǎn)錄。在生理狀況下,NF-κB并不表達(dá)或表達(dá)很少,它與其抑制因子Inhibitor of NF-κB(IκB)結(jié)合,為無活性狀態(tài)存在于胞漿中。疾病中任何的物理及化學(xué)因素刺激均可導(dǎo)致這種結(jié)合的分離,如病毒、細(xì)菌內(nèi)毒素、氧化應(yīng)激反應(yīng)以及OSAHS的特征性改變——慢性間歇低氧。在這些變化刺激中,NF-κB與靶基因、增強(qiáng)子或早期炎癥反應(yīng)基因再結(jié)合,TNF-α、IL-6、IL-8等炎癥因子大量產(chǎn)生。TNF-α是促炎因子,并且是機(jī)體免疫應(yīng)答的重要因子,過度的應(yīng)答聚集了大量中性粒細(xì)胞,繼續(xù)上調(diào)IL-8的表達(dá),IL-8可進(jìn)一步趨化中性粒細(xì)胞,炎癥反應(yīng)更加嚴(yán)重[8]。

慢性間歇低氧大鼠的心肌細(xì)胞中NF-κB的表達(dá)對心臟炎癥也起著至關(guān)重要作用[9],并有可能參與了心臟疾病的發(fā)生發(fā)展[10]。IL-6是一種糖蛋白,多種淋巴細(xì)胞和非淋巴細(xì)胞均可產(chǎn)生,其可以調(diào)節(jié)CRP的合成,增加心臟心肌黏附分子的表達(dá),同時(shí)促進(jìn)TNF-α釋放[11]。IL-6、CRP、TNF-α和NF-κB共同維持著心臟炎癥平衡,當(dāng)炎癥介質(zhì)IL-6、TNF-α增多時(shí),會反饋?zhàn)饔糜贜F-κB,造成心肌惡性損害[12]。通過抑制NF-κB介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)有可能阻斷炎癥損害惡性循環(huán),減輕心肌損傷程度[13]。

慢性間歇低氧引起的損傷特征是缺血再灌注損傷。反復(fù)的缺氧,復(fù)灌注是心肌梗死、心力衰竭死亡的主要原因[14]。MCP-1、TNF-α、IL-6、IL-8、CRP共同參與了炎癥的發(fā)生發(fā)展過程,對心肌的缺血再灌注損傷起重要作用[15]。在缺血再灌注早期炎癥細(xì)胞即可侵入心肌細(xì)胞,并釋放這些炎癥因子,誘導(dǎo)心肌損傷[16-17]。

本研究中,檢測到慢性間歇低氧大鼠腦、心、肺組織的NF-κB表達(dá)增強(qiáng),同時(shí)MCP-1、TNF-α、IL-6、IL-8、CRP不同程度激活,提示慢性間歇低氧是改變發(fā)生的根源。慢性間歇低氧可使機(jī)體氧化應(yīng)激反應(yīng)加強(qiáng)[18-19],如果NF-κB被激活,在氧化應(yīng)激狀態(tài)下,IL-6、TNF-α等因子隨之增加,成為OSAHS患者的炎癥反應(yīng)基礎(chǔ)[20]。因此,找到適合OSAHS人群,應(yīng)用同時(shí)能阻斷NF-κB過度激活帶來的機(jī)體反應(yīng)的藥物,是我們治療OSAHS疾病的方向。

利益沖突聲明:無。