韋煥麗 杜星 吳夢苑 郭東艷

(1.陜西中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院,陜西 咸陽 712000;2.陜西中醫(yī)藥大學(xué)/陜西省中藥基礎(chǔ)與新藥研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,陜西 咸陽 712046)

風(fēng)濕骨痛液是陜西中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院研制的外用止痛酊劑,由黑順片、雪上一支蒿、威靈仙等八味藥配伍組成。經(jīng)臨床用藥觀察,該制劑可治療多種疼痛,如關(guān)節(jié)疼痛、軟組織痛、頸椎腰椎痛等均有顯著療效[1]。方中黑順片辛、甘,大熱,回陽補(bǔ)火,散寒除濕,以為君藥;配合威靈仙、雪上一枝蒿,功能祛風(fēng)除濕,通絡(luò)止痛;桂枝、花椒、紅花、白術(shù),具有溫經(jīng)、發(fā)汗解肌、化瘀止痛、健脾除濕等功效,用作臣佐藥。甘草補(bǔ)氣,調(diào)和方中各味藥物,為使藥[2-7]。其中威靈仙具有祛風(fēng)除濕、通絡(luò)止痛的功效,為中醫(yī)臨床使用治療風(fēng)濕痹痛的要藥,廣泛應(yīng)用于風(fēng)濕性關(guān)節(jié)痛、四肢麻木、肌肉痙攣、屈伸不利等疾病,治療風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、骨鯁咽喉、乳腺炎及癰瘡等[8-12]。風(fēng)濕骨痛液原標(biāo)準(zhǔn)僅有生物堿、皂苷類成分的理化鑒別、威靈仙的薄層色譜鑒別及烏頭堿的限量檢查,尚缺方中主要藥味的含量測定,難以有效控制制劑的質(zhì)量。因此本文擬采用HPLC法對(duì)風(fēng)濕骨痛液中的活性成分(常春藤皂苷元和齊墩果酸)含量進(jìn)行測定,以期提升制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn),更好地控制制劑質(zhì)量。

1 儀器與試藥

1.1儀器 島津LC-2030C 3D Plus高效液相色譜儀(日本SHIMADZU);ME204E電子分析天平(瑞士METTLER梅特勒托利多);KH-400KDE型高功率數(shù)控超聲波清洗器(昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司)。

1.2試藥 常春藤皂苷元對(duì)照品(批號(hào):HR2002W6,純度98%,寶雞辰光生物科技公司);齊墩果酸對(duì)照品(批號(hào):160314,純度98%,成都普菲德生物技術(shù)有限公司);無水乙醇(天津市富宇精細(xì)化工有限公司);風(fēng)濕骨痛液(批號(hào):20210601,20210701,20210801)陜西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院制劑室提供;甲醇、乙腈(色譜純,美國飛世爾科學(xué)世界公司);純凈水(陜西娃哈哈乳品有限公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1溶液的制備

2.1.1風(fēng)濕骨痛液陰性樣品的制備 根據(jù)處方比例,稱取黑附片、雪上一枝蒿、桂枝、花椒、紅花、白術(shù)、甘草,粉碎成粗粉,用45%乙醇做溶劑,浸漬48 h后,以每分鐘2～4 mL的速度滲漉,收集初漉液750 mL,將藥渣內(nèi)余液壓出,與初漉液合并,加45%乙醇至1000 mL,混勻,過濾,即得。

2.1.2混合對(duì)照品溶液 稱取常春藤皂苷元、齊墩果酸對(duì)照品適量,精密稱定,用甲醇配成含常春藤皂苷元1.0920 mg·mL-1、齊墩果酸1.0440 mg·mL-1的混合溶液,即得。

2.1.3供試品溶液 精密移取風(fēng)濕骨痛液10 mL,水浴蒸干,加適量甲醇復(fù)溶,定容至2 mL,過0.45 μm微孔濾膜,備用。

2.1.4陰性樣品溶液 取除處方中威靈仙以外的其他藥,按照“2.1.1”項(xiàng)下方法處理后,再按“2.1.3”項(xiàng)下方法制備威靈仙陰性供試溶液。

2.2色譜條件 色譜柱為PFchrom C18色譜柱(4.6×250 mm);流動(dòng)相:乙腈-水(90∶10);流速:1.0 mL·min-1;柱溫:25 ℃;檢測波長205 nm;進(jìn)樣量10 μL。

2.3方法學(xué)考察

2.3.1線性關(guān)系考察 取常春藤皂苷元對(duì)照品溶液及齊墩果酸對(duì)照品溶液,分別加甲醇稀釋成含常春藤皂苷元32.76,65.52,131.04,196.56,327.60和655.2 μg·mL-1,含齊墩果酸20.88,41.76,83.52,125.28,208.80和417.6 μg·mL-1的混合對(duì)照品溶液,進(jìn)樣,HPLC分析,以峰面積(Y)為縱坐標(biāo),濃度(X)為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。各成分的回歸方程、線性范圍見表1。

表1 線性回歸方程

2.3.2專屬性試驗(yàn) 分別精密吸取混合對(duì)照品溶液、供試品溶液及陰性對(duì)照溶液各10 μL,進(jìn)樣,HPLC分析,對(duì)照品及樣品常春藤皂苷元、齊墩果酸的色譜峰分離良好,陰性樣品中指標(biāo)成分相應(yīng)保留時(shí)間均無吸收峰,表明該方法專屬性良好(見圖1)。

注:A.混合對(duì)照品;B.風(fēng)濕骨痛液樣品;C.威靈仙陰性;1.常春藤皂苷元;2.齊墩果酸

2.3.3精密度實(shí)驗(yàn) 精密吸取同一混合對(duì)照品溶液,按“2.2”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次,進(jìn)行HPLC分析,測得常春藤皂苷元、齊墩果酸峰面積的RSD值分別為0.17%、0.28%,表明儀器精密度良好。

2.3.4穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 精密吸取同一供試品溶液,分別于配制后的0,2,4,8,12和24 h按“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣HPLC分析,測得常春藤皂苷元、齊墩果酸24 h內(nèi)峰面積的RSD值分別為2.65%、1.74%,表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.5重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取6份風(fēng)濕骨痛液樣品,每份10 mL,精密量取,分別按“2.1.3”項(xiàng)下方法制備供試液,按“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣HPLC分析,測得常春藤皂苷元、齊墩果酸的平均含量分別為 0.0961 mg·mL-1、0.0477 mg·mL-1,其RSD分別為1.14%、1.70%,表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.6加樣回收率實(shí)驗(yàn) 精密移取已知含量的風(fēng)濕骨痛液樣品6份,分別加入適量對(duì)照品,按“2.1.3”項(xiàng)下方法制備加樣供試品溶液,按“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣 HPLC 分析,記錄色譜峰面積,計(jì)算回收率及 RSD 值,結(jié)果見表2。

表2 加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果(n=9)

2.4樣品測定 取3批風(fēng)濕骨痛液樣品,按“2.1.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液,按“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣HPLC分析,計(jì)算樣品中常春藤皂苷元和齊墩果酸的含量,結(jié)果見表3。

表3 樣品含量測定結(jié)果(n=3)

3 討論

3.1檢測波長的選擇 參考文獻(xiàn)[13-16]并對(duì)比檢測波長205 nm、215 nm 下的色譜圖,發(fā)現(xiàn)在205 nm下常春藤皂苷元、齊墩果酸均有較好的吸收。

3.2流動(dòng)相的選擇 實(shí)驗(yàn)考察了甲醇-水溶液、乙腈-水溶液等多種不同比例的流動(dòng)相系統(tǒng),結(jié)果表明以乙腈-水(90∶10)為流動(dòng)相時(shí)分離效果最好。

3.3柱溫的選擇 試驗(yàn)考察了25 ℃、30 ℃、35 ℃、40 ℃等多種不同柱溫,結(jié)果表明當(dāng)色譜柱柱溫為25℃時(shí),分離效果最好。

因方中黑順片與雪上一枝蒿均為毛茛科植物烏頭類藥材,近年來研究表明[17-19],烏頭類藥材的化學(xué)成分主要為生物堿,具有鎮(zhèn)痛、抗炎、局麻、抗腫瘤等藥理活性同時(shí)又具有心血管、神經(jīng)等毒性[20-22]。應(yīng)進(jìn)行毒性限定實(shí)驗(yàn),因原標(biāo)準(zhǔn)已進(jìn)行烏頭堿限量檢查,故本文未選取黑順片及雪上一枝蒿中生物堿類成分進(jìn)行含量測定。威靈仙具有祛風(fēng)濕,通經(jīng)絡(luò)的功效,臨床上多用于風(fēng)濕痹痛等病癥又兼本方之臣藥,故選取威靈仙中有效成分常春藤皂苷元與齊墩果酸進(jìn)行含量測定。

本文采用HPLC法對(duì)風(fēng)濕骨痛液臣藥威靈仙中的有效成分常春藤皂苷元和齊墩果酸同時(shí)進(jìn)行了含量測定[23-25],同時(shí)所建立的方法可以對(duì)樣品中的兩個(gè)及以上的指標(biāo)成分進(jìn)行同步分析,減少了樣品分析時(shí)間及溶劑的消耗。經(jīng)方法學(xué)考察,本文所建立的含量測定方法準(zhǔn)確、穩(wěn)定、可靠,可作為風(fēng)濕骨痛液的質(zhì)量控制方法之一,為今后風(fēng)濕骨痛液質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提升奠定基礎(chǔ)。