江 川，黃玉芳，卓 實(shí)，章 靚

（福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬人民醫(yī)院藥學(xué)部，福州 350004）

丹瓜護(hù)脈顆粒是福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬人民醫(yī)院在特色中藥制劑丹瓜護(hù)脈口服液的基礎(chǔ)上研制的，由丹參、赤芍、瓜蔞、川芎等八味中藥組成，具有調(diào)節(jié)糖脂代謝，抗氧化應(yīng)激，改善血管功能的作用[1-4]，臨床研究證明丹瓜護(hù)脈制劑對糖尿病血管病變具有顯著療效[5-6]，方中丹參活血祛瘀為君藥，赤芍活血散血為臣藥，助君藥活血祛瘀。經(jīng)查閱文獻(xiàn)[7]，并按照前期預(yù)實(shí)驗(yàn)的研究[8]，本研究采用高效液相色譜法（HPLC）法檢測丹瓜護(hù)脈口服液和顆粒劑中的丹酚酸B 與芍藥苷2 種成分，并同時(shí)進(jìn)行抗糖尿病藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)，為丹瓜護(hù)脈制劑新劑型研制提供科學(xué)數(shù)據(jù)。

1 儀器、試藥與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

1.1 儀器

HP-1100 高效液相色譜儀（美國安捷倫公司，DAD 二極管陣列檢測器），LE104E 240 電子天平（瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司），超聲波發(fā)生器（上海精密儀器儀表有限公司），隨手測血糖儀[強(qiáng)生（中國）醫(yī)療器材有限公司]，電熱恒溫水浴箱（天津市泰斯特儀器有限公司）。

1.2 試藥

丹瓜護(hù)脈顆粒由福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬人民醫(yī)院藥劑科制劑室制備，批號(hào)分別為20210903、20211001、20211002；丹瓜護(hù)脈口服液由本院藥劑科制劑室制備，批號(hào)分別為20210601、20210602 和20210603。芍藥苷對照品（批號(hào)：110736-200424）、丹酚酸B對照品（批號(hào)：180208）均購于北京中科質(zhì)檢生物技術(shù)有限公司，含量≥98%；川芎對照藥材（批號(hào)：200204）購于北京中科質(zhì)檢生物技術(shù)有限公司；腎上腺素（批號(hào)：M08GS147766，購于上海源葉生物科技有限公司）；乙腈（批號(hào)：A104441，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）、甲醇（批號(hào)：P109359，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）均為色譜級(jí)；超純水自制。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

選取SPF 級(jí)KM 小鼠，雄性，20 ～22 g，購自北京華埠康生物科技股份有限公司，許可證號(hào)：SCXK（京）2019-0008，合格證號(hào)：110322210102917173。選取SPF 級(jí)C57BL/6 小鼠，雄性，18 ～20 g，購自杭州醫(yī)學(xué)院，許可證號(hào)：SCXK（浙）2019-0002，合格證號(hào)：20211117Abzz0100000103；實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)于福建省中醫(yī)藥研究科學(xué)院動(dòng)物房，室內(nèi)溫度為25℃，濕度為75%，飼養(yǎng)1 周后使用。本研究已通過倫理委員會(huì)審批（動(dòng)物倫理號(hào)：2021068）

2 方法與結(jié)果

2.1 TLC 鑒別

取川芎5 g，粉碎，取粉末加乙醚 30 mL，加熱回流提取60 min，過濾，將濾液揮干，加2 mL 乙酸乙酯，溶解殘?jiān)?，作為供試品溶液。取川芎對照藥?.5 g，按前述方法制成對照藥材溶液。按照薄層色譜法（中國藥典2020 年版）試驗(yàn)，吸取上述兩種溶液各 2 μL，點(diǎn)于硅膠G 薄層板上，用正己烷-乙酸乙酯（9:1）為展開劑，展開，取出，晾干后置于紫外光（365 nm）下檢視。供試品色譜中在與對照藥材色譜相應(yīng)的位置上顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)。見圖1。

圖1 川芎薄層色譜圖

2.2 樣品檢查

按2020 年版《中國藥典（四部）》顆粒劑項(xiàng)下規(guī)定，對三批樣品的粒度、水分、溶化性、干燥失重、重金屬、砷鹽進(jìn)行檢查，結(jié)果 三批樣品的檢查結(jié)果均符合《2020 年版藥典》顆粒劑項(xiàng)下標(biāo)準(zhǔn)。結(jié)果見表1。

表1 三批樣品檢查結(jié)果

2.3 芍藥苷和丹酚酸B 含量測定

2.3.1 色譜條件 色譜柱：Ultimate C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈-0.1%磷酸溶液（17:83）；流速：1 mL·min-1；檢測波長：230 nm；柱溫：室溫；進(jìn)樣量：20 μL。

2.3.2 試液配制 取實(shí)驗(yàn)所需的芍藥苷和丹酚酸B對照品，配制的對照品含量：芍藥苷為21.8 μg·mL-1、丹酚酸B 為22.4 μg·mL-1。精密稱取 1 g 的丹瓜護(hù)脈顆粒樣品通過乙酸乙酯定容至1 mL，超聲提取后，搖勻，過濾，取續(xù)濾液配制供試品溶液。

2.3.3 方法學(xué)考察 1）專屬性試驗(yàn)：上述色譜條件下，色譜圖中兩種對照品相鄰峰分離度均＞1.5；理論塔板數(shù)均＞1 萬。色譜圖見圖2。2）線性關(guān)系考察：以對照品色譜峰面積（A）為縱坐標(biāo)，對照品濃度（C）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，芍藥苷回歸方程為Y= 50.268 6X+ 25.226 4（r= 0.999 9），線性范圍為3.3 ～95 μg·mL-1；丹酚酸B 的回歸方程為Y= 57.946 4X+ 33.184 1（r= 0.999 9），線性范圍為2.5 ～80 μg·mL-1。3）精密度試驗(yàn)：取芍藥苷和丹酚酸B 的混合對照樣品溶液，每次20 μL，連續(xù)進(jìn)樣6 次，計(jì)算結(jié)果芍藥苷RSD為2.32%和丹酚酸B 的RSD為2.66%，說明色譜儀精密度良好。4）重復(fù)性試驗(yàn)：取丹瓜護(hù)脈顆粒樣品（批號(hào)20211001）按設(shè)定方法提取和液相分析，計(jì)算芍藥苷和丹酚酸B 的RSD分別為2.41%、2.19%，說明該方法的重復(fù)性良好。5）加樣回收試驗(yàn)：取丹瓜護(hù)脈顆粒樣品（批號(hào)20211001）按設(shè)定方法提取和液相分析，結(jié)果芍藥苷和丹酚酸B 含量的平均回收率與RSD值分別為97.63%（1.33%）、95.00%（2.43%）。結(jié)果見表2。

圖2 專屬性試驗(yàn)粒HPLC 色譜圖

表2 樣品芍藥苷、丹酚酸B 含量測定結(jié)果

2.3.4 樣品測定 批號(hào)為20210903、20211001、20211002 丹瓜護(hù)脈顆粒樣品中分別取出1 g，按上述顆粒劑溶液樣品的方法制備其對應(yīng)的試驗(yàn)溶液，按照上述實(shí)驗(yàn)相同的色譜條件進(jìn)樣測定，通過外標(biāo)法計(jì)算芍藥苷、丹酚酸B 含量，三批丹瓜護(hù)脈顆粒中芍藥苷的含量均＞1.3 mg·g-1，丹酚酸B 含量均＞0.8 mg·g-1。結(jié)合實(shí)際生產(chǎn)工藝波動(dòng)，暫擬定丹瓜護(hù)脈顆粒制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)芍藥苷含量不得少于1.0 mg·g-1，丹酚酸B 含量不得少于0.6 mg·g-1。見表3。

表3 樣品芍藥苷、丹酚酸B 含量測定結(jié)果 mg·g-1

2.4 抗糖尿病藥效實(shí)驗(yàn)

2.4.1 對腎上腺素高血糖小鼠的降血糖作用 將購回的小鼠喂養(yǎng)3 d 后，隨機(jī)分成6 組，即丹瓜護(hù)脈顆粒高、中、低劑量組（ 40 g·kg-1、20 g·kg-1、10 g·kg-1）；丹瓜護(hù)脈口服液組（20 mL·kg-1）；空白對照組（等劑量蒸餾水）；陽性對照組（二甲雙胍0.2 g·kg-1）。按照組別連續(xù)3 周，每天1 次進(jìn)行灌胃給藥，最后1次給藥前的0.5 d內(nèi)不禁水但禁食，給藥后繼續(xù)禁食2 h 后測定其空腹血糖，隨即腹腔注射0.4 mg·kg-1的腎上腺素，0.5 h 后測定其血糖。

丹瓜護(hù)脈顆粒對腎上腺素高血糖小鼠的降血糖實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表4，腎上腺素造模后，給藥組與空白對照組比較，小鼠血糖明顯下降，具有顯著性差異。

表4 丹瓜護(hù)脈顆粒對腎上腺素高血糖小鼠的降血糖實(shí)驗(yàn)結(jié)果（±s，n = 10） mmol·L-1

表4 丹瓜護(hù)脈顆粒對腎上腺素高血糖小鼠的降血糖實(shí)驗(yàn)結(jié)果（±s，n = 10） mmol·L-1

注：與空白組比較，# P ＜0.05，## P ＜0.01

組別給藥前血糖濃度給藥0.5 h 后血糖濃度顆粒劑高劑量8.610±0.97615.910±2.589#顆粒劑中劑量8.720±0.58716.200±2.338#顆粒劑低劑量7.080±0.88816.440±2.365#口服液組8.060±1.11314.990±2.561##空白組7.930±0.52519.720±3.895陽性組7.756±0.67810.711±2.798##

2.4.2 對鏈脲佐菌素（STZ）高血糖小鼠的降血糖實(shí)驗(yàn)

2.4.2.1 正常動(dòng)物降糖實(shí)驗(yàn) 選健康成年小鼠按禁食3 ～5 h 的血糖水平分組后，隨機(jī)其分為口服液組（20 mL·kg-1）、空白對照組（蒸餾水）和顆粒劑（40 g·kg-1）組。其中口服液組與顆粒劑組分別通過灌胃給高劑量的口服液和顆粒劑，灌胃給藥持續(xù)30 d 后測量其空腹血糖值，并分別與空白組比較其血糖濃度差異。丹瓜護(hù)脈顆粒與丹瓜護(hù)脈口服液對正常小鼠灌胃30 d 血糖變化見表5，丹瓜護(hù)脈顆粒劑組血糖明顯升高。

表5 丹瓜護(hù)脈顆粒和丹瓜護(hù)脈口服液對正常小鼠灌胃30 d后的血糖影響（±s，n = 10） mmol·L-1

表5 丹瓜護(hù)脈顆粒和丹瓜護(hù)脈口服液對正常小鼠灌胃30 d后的血糖影響（±s，n = 10） mmol·L-1

注：與空白組比較，## P ＜0.01

組別30 d 后血糖濃度顆粒劑組8.870±0.882##口服液組8.060±1.113空白組9.730±0.525

2.4.2.2 高血糖模型動(dòng)物降糖實(shí)驗(yàn) 購入小鼠喂養(yǎng)3 d 后，隨機(jī)取15 只小鼠不禁水但禁食4 h，隨后測量空腹血糖，將此數(shù)值作為該批小鼠的基礎(chǔ)血糖值。再將此批小鼠禁食24 h 但不禁水，持續(xù)5 d 通過腹腔注射以50 mg·kg-1為體質(zhì)量劑量的STZ 造以糖尿病小鼠模型。第10 天時(shí)測空腹血糖，小鼠血糖值在10 ～25 mmol·L-1則說明造模成功，符合糖尿病模型要求。糖尿病模型小鼠按血糖水平隨機(jī)分為丹瓜護(hù)脈顆粒高、中、低劑量組（40 g·kg-1、20 g·kg-1、10 g·kg-1）；丹瓜護(hù)脈口服液高、中、低劑量組（20 mL·kg-1、10 mL·kg-1、5 mL·kg-1）；空白對照組（等劑量蒸餾水）；陽性對照組（二甲雙胍0.2 g·kg-1）；組間差≤1.1 mmol·L-1。連續(xù)灌胃30 d。第30 天時(shí)禁食4 h，隨后測量其空腹血糖值并相互比較。丹瓜護(hù)脈顆粒和丹瓜護(hù)脈口服液對高血糖模型小鼠的血糖影響見表6。持續(xù)灌胃30 d 后血糖濃度穩(wěn)定，與空白組比較血糖濃度明顯下降。

表6 丹瓜護(hù)脈顆粒和丹瓜護(hù)脈口服液對高血糖模型小鼠的血糖影響（±s，n = 10） mmol·L-1

表6 丹瓜護(hù)脈顆粒和丹瓜護(hù)脈口服液對高血糖模型小鼠的血糖影響（±s，n = 10） mmol·L-1

注：治療前，與空白組比較，# P ＜0.05；治療后，與空白組比較，△P ＜0.05，△△P ＜0.01

組別造模成功后測得血糖灌胃30 d 后測得血糖顆粒劑高劑量組19.090±5.29419.189±4.334△△顆粒劑中劑量組20.060±6.20920.530±4.172△顆粒劑低劑量組19.200±4.49520.720±4.734△口服液高劑量組20.090±4.33518.790±3.099△△口服液中劑量組19.540±4.80319.900±4.512△口服液低劑量組19.470±4.96921.200±6.483空白組19.890±5.66025.360±4.595陽性組20.190±5.51117.940±4.885△△正常組 8.560±0.669# 8.330±0.291△△

2.4.2.3 高血糖模型動(dòng)物糖耐量實(shí)驗(yàn) 各組禁食4 h后立即測量其血糖濃度，測量完畢后立刻向上述各組（顆粒劑高劑量組、中劑量組、低劑量組）給藥或?qū)?yīng)體積的溶劑（蒸餾水）。給藥完成20 min 之后，通過腹腔以2.0 g·kg-1為體質(zhì)量劑量進(jìn)行葡萄糖注射。注射后分別于0.5 h 和2 h 后測定各組的血糖濃度，并根據(jù)計(jì)算其葡萄糖曲線下面積（AUC）。實(shí)驗(yàn)后分別將給藥組的0 h、0.5 h、2 h 時(shí)刻的血糖濃度以及AUC 值與空白對照組進(jìn)行對比，觀察其變化。丹瓜護(hù)脈顆粒和丹瓜護(hù)脈口服液對高血糖模型小鼠的糖耐量影響見表7。與空白組相比，不同濃度的丹瓜護(hù)脈口服液和丹瓜護(hù)脈顆粒劑對小鼠血糖曲線下面積明顯下降，具有顯著性差異。

表7 丹瓜護(hù)脈顆粒和丹瓜護(hù)脈口服液對高血糖模型小鼠的糖耐量影響（±s，n= 10）

注：與空白組比較，# P ＜0.05，## P ＜0.01

組別0 h 血糖濃度/（mmol·L-1） 0.5 h 血糖濃度/（mmol·L-1） 2 h 血糖濃度/（mmol·L-1） 血糖曲線下面積顆粒劑高劑量組19.19±4.33##34.56±12.3820.82±4.18##59.09±8.52##顆粒劑中劑量組20.53±4.17#39.96±3.9822.52±4.21#62.23±7.31#顆粒劑低劑量組20.72±4.73#41.52±4.9621.70±4.77#62.98±7.54#口服液高劑量組18.79±3.10##37.92±5.58#20.51±4.35##58.00±3.53##口服液中劑量組19.90±4.51#38.13±5.9822.67±4.69#60.11±8.96#口服液低劑量組21.20±6.4840.20±6.0122.83±5.9862.63±9.30#空白組25.36±4.6044.52±7.4526.97±3.0271.84±8.55陽性組17.94±4.89##32.76±8.12##14.51±4.14##48.13±10.91##

由表4 和表7 可知，與空白對照組比較，顆粒劑組和傳統(tǒng)口服液劑組均可顯著降低小鼠的血糖值，表明該方藥效良好；顆粒劑組藥效與傳統(tǒng)口服液劑組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)果表明，丹瓜護(hù)脈口服液改變原劑型制成顆粒劑方案科學(xué)、合理、可行。

3 討論

在流動(dòng)相的選擇中，本實(shí)驗(yàn)先用甲醇和0.1%磷酸溶液作為液相流動(dòng)相，發(fā)覺丹酚酸B 的分離不理想，然后加入甲醇，峰形發(fā)生變化，便把甲醇改為乙腈，發(fā)現(xiàn)芍藥苷和丹酚酸B 在圖上峰型較好，故對乙腈和0.1%磷酸溶液的流動(dòng)相濃度進(jìn)行調(diào)節(jié)，乙腈-0.1% 磷酸為17:83 峰型較好，分離度較好，因此本實(shí)驗(yàn)選擇了17:83 的乙腈-0.1%磷酸溶液作為流動(dòng)相。

持續(xù)的高血糖模型實(shí)驗(yàn)的造模常常采用鏈脲佐菌素進(jìn)行造模[9-10]，這是一種廣譜抗生素，但由于其對胰島β 細(xì)胞具有高度的選擇性且對胰島β 細(xì)胞具有一定毒性，故導(dǎo)致機(jī)體出現(xiàn)糖尿病癥狀，其病理機(jī)制為使胰島β 細(xì)胞壞死，使機(jī)體出現(xiàn)胰島素依賴性糖尿??；腎上腺素是一種交感神經(jīng)興奮藥物，可以促進(jìn)多條糖代謝途徑以迅速提高機(jī)體血液的含糖量，使得血糖迅速升高。利用這一特點(diǎn)可向小鼠注射腎上腺素以形成急性高血糖模型。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，對比丹瓜護(hù)脈制劑劑型在對抗由腎上腺素所引起的急性高血糖實(shí)驗(yàn)中，口服液組降血糖的作用強(qiáng)度較強(qiáng)，與空白組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），與陽性組對比，均存在顯著差異（P＜0.05）。提示低劑量的丹瓜護(hù)脈顆粒及其口服液對急性高血糖的對抗具有顯著功效。

與空白組相比，使用任意一種丹瓜護(hù)脈制劑向小鼠灌胃，均可顯著降低其葡萄糖的曲線下面積（P＜0.05），其中高劑量口服液組與高劑量顆粒組（P＜0.01），提高機(jī)體的糖耐量。但其效果遠(yuǎn)不及陽性組的二甲雙胍效果（P＜0.05），其中顆粒劑組不同劑量間曲線下面積差異不顯著（P＞0.05），結(jié)合上述實(shí)驗(yàn)臨床使用建議使用低劑量即可，避免長時(shí)間服用導(dǎo)致攝入糖分較高。

綜上所述，對于長期高血糖，丹瓜護(hù)脈制劑具有預(yù)防高血糖加重作用，但不如二甲雙胍的降血糖功效顯著，且其顆粒劑本身或存在一定含糖量；對于急性高血糖患者，其具備一定降糖功效。