荊紅梅,周鵬,張玥,劉皓,劉紅斌

(1.中國科學(xué)院 深?？茖W(xué)與工程研究所,海南 三亞 572000;2.南方海洋科學(xué)與工程廣東省實(shí)驗(yàn)室(珠海),廣東 珠海 519082;3.中國科學(xué)院三亞海洋科學(xué)綜合實(shí)驗(yàn)室,海南 三亞 572000;4.香港科技大學(xué) 海洋科學(xué)系,香港 999077)

研究者主要采用16S rRNA基因分析方法進(jìn)行不同環(huán)境樣品中AOA的豐度以及系統(tǒng)發(fā)育分析[4].但該基因過于保守,甚至不同群落的16S rRNA基因相似性能達(dá)97%以上,所以很難將AOA的不同種屬在16S rRNA基因水平上區(qū)分開來[5].隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展以及對AOA的深入研究,發(fā)現(xiàn)了氨氧化過程中的關(guān)鍵酶—氨單加氧酶(ammonia monooxygenase,AMO).該酶是由amoA、amoB、amoC基因分別編碼的α、β、γ 3個(gè)亞基組成的三聚體膜結(jié)合蛋白,屬于單加氧蛋白家族[6].相比較16S rRNA基因作為分子標(biāo)記,編碼α亞基的amoA基因具有較強(qiáng)的保守性和明顯的專一性,在相近的群落之間具有高分辨率,并且具有功能基因特性,因而在氨氧化古菌的遺傳多樣性分析方面具有優(yōu)勢,常被作為研究AOA的分子標(biāo)記[7].

目前利用AOA功能基因amoA和qPCR技術(shù)來研究不同生境中AOA的基因豐度分布特征的報(bào)道較多,包括中國內(nèi)蒙古草地、東北的海河、珠江口到南海的沉積物、日本海、北太平洋加利福尼亞海灣和蒙特利海灣等.不同水體環(huán)境中的AOAamoA基因豐度也不同.通常海水樣品中的AOAamoA基因拷貝數(shù)介于103～108copies/L之間;且表層海水的豐度普遍低于透光層區(qū)域;不同營養(yǎng)類型湖泊中基因拷貝數(shù)為7.80×104～1.34×106copies/L[8],珠江底泥中的拷貝數(shù)為9.60×109～5.10×1010copies/kg[3].

珠江年徑流量約3 492億m3,僅次于長江,是黃河年徑流量的6倍.全長2 320 km,流域面積約44萬km2,且4至9月的徑流量占全年的80%.珠江口是三角洲網(wǎng)河和殘留河口灣并存的河口,徑流大,潮差小,含沙量相對較小.河口區(qū)河汊發(fā)育,水網(wǎng)密布[3].此外,珠江口夏季受沖淡水影響明顯,流速大.目前對于珠江口AOA的研究表明其在水體中的豐度通常高于氨氧化細(xì)菌[9],以Shallow group簇和SCM1-like簇樣亞系為優(yōu)勢類群,且在DNA水平上的整體類群組成與cDNA水平上活躍參與氨氧化過程的類群具有明顯差異[10].同時(shí)AOA在較大的顆粒有機(jī)物上表現(xiàn)出更高的轉(zhuǎn)錄活性[11].為了深入了解夏季珠江口沖淡水對功能微生物類群的影響,利用新一代高通量測序技術(shù)和熒光定量PCR(qPCR)技術(shù)研究了夏季珠江口不同鹽度、不同深度及不同過濾孔徑(0.22 μm 代表自由生活的;3 μm代表附著的)的各水體樣品中的AOA群落結(jié)構(gòu)組成以及豐度分布特征.此外,在DNA和cDNA水平上進(jìn)行了比較研究,解析了關(guān)鍵的生態(tài)因子,系統(tǒng)闡述徑流輸入對AOA的群落演替的影響.

1 材料和方法

1.1 樣品采集

珠江口夏季海水樣品借助廈門大學(xué)航次于2014年7月9日至26日采集.共包括9個(gè)站位(圖1):A02、A04、A06、A08、A10、A12、A14、A16、A18.每個(gè)站位的表層及底層海水經(jīng)3 μm和0.22 μm的聚碳酸酯濾膜來分級過濾,以收集附著生活(3 μm,attached)的和自由生活(0.22 μm,free-living)的微生物類群.濾膜放入加有500 μL RNAlater的凍存管中并立即凍入液氮罐中,回到實(shí)驗(yàn)室后保存于-80 ℃超低溫冰箱中.

1.2 核酸提取,PCR擴(kuò)增與測序

濾膜上的DNA采用Genomic DNA Mini Kit試劑盒提取,RNA采用PureLinkTM RNA Mini Kit試劑盒提取,然后第一鏈cDNA采用SuperScript?Ⅲ First-Strand試劑盒合成.利用含MID的特異性引物對amoAF和amoAR擴(kuò)增AOAamoA基因序列[12].用無菌水作為反應(yīng)的陰性對照.DNA使用1 μL為模板,cDNA使用3 μL為模板;每個(gè)PCR的反應(yīng)體系總體積為20 μL.PCR反應(yīng)程序?yàn)?95 ℃預(yù)變性5 min;95 ℃變性45 s,53 ℃退火1 min,72 ℃延伸1 min,運(yùn)行35個(gè)循環(huán);最后72 ℃延伸7 min,保存在4 ℃.PCR產(chǎn)物用質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.2%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行檢測,以100 bp Ladder為DNA標(biāo)準(zhǔn)Marker.PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后,使用Roche GS Junior測序平臺進(jìn)行高通量測序.

1.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

AOAamoA基因的定量PCR反應(yīng)采用amo196F和amo277R[8]為引物,利用SYBR?Premix Ex TaqTM試劑盒,在ABI 7500 Fast定量PCR儀上進(jìn)行.每個(gè)qPCR的反應(yīng)體系為10 μL,其中1 μL DNA或cDNA為模板,并使用無菌水作為陰性對照,每個(gè)樣品和質(zhì)粒均做3個(gè)平行.實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)程序?yàn)?95 ℃預(yù)變性10 min;95 ℃變性15 s,60 ℃延伸1 min,45個(gè)循環(huán);然后進(jìn)行溶解曲線檢測階段,熒光取值在60 ℃和溶解曲線全程.利用梯度稀釋的質(zhì)粒(10-8～10-1)分別作為模板進(jìn)行qPCR,并用其分別對應(yīng)的Ct值和基因拷貝數(shù)來構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線(R2=0.990 6,擴(kuò)增效率為102.16%),然后將樣品(DNA、cDNA)通過qPCR獲得的Ct值分別代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中進(jìn)行計(jì)算,最后用SigmaPlot對數(shù)據(jù)進(jìn)行繪圖.

1.4 生物信息學(xué)分析

通過Roche GS Junior平臺所獲得的AOAamoA基因原始序列利用mothur軟件(http://www.mothur.org/)進(jìn)行初步篩選和去雜,將引物以及測序標(biāo)簽的錯(cuò)配堿基數(shù)大于1的序列去除,同時(shí)將總序列長度小于300 bp的序列去除,隨后去除含有嵌合體的序列,最終形成一個(gè)shared文件.利用mothur的get.oturep命令基于97%的序列相似度得到各個(gè)OTU的代表序列名.隨后,按照樣品最低序列為標(biāo)準(zhǔn)對數(shù)據(jù)進(jìn)行均一化處理.利用Primer 5進(jìn)行多樣性指數(shù)分析,主要包括群落豐富度指數(shù)(Margalef)、均勻度指數(shù)、香農(nóng)指數(shù)、辛普森指數(shù)等,其計(jì)算公式分別為:d[Species Richness(Margalef)]=(S-1)/ln(N),J'(Pielou's Evenness)=H'/ln(S)、H'(Shannon)=-∑i[Pi×ln(Pi)],1-λ'(Simpson)=1-∑i[Ni×(Ni-1)/N×(N-1)],其中S為群落總OTU數(shù),N為總序列數(shù),Pi為第i個(gè)OTU在整個(gè)序列中所占的比例,Ni為第i個(gè)OTU的個(gè)體數(shù).各站位序列覆蓋度(Coverage,C)是利用mothur軟件的summary.single命令基于97%的序列相似度對氨氧化古菌amoA基因序列進(jìn)行計(jì)算的,其計(jì)算公式為C=[1-(n1/N)],其中n1為序列中僅有一條序列的OTU數(shù),N為序列的總OTU數(shù).

利用mothur軟件進(jìn)行樣品間相似度的聚類分析,其中非度量多維尺度分析(NMDs)利用Primer 5[13]完成.此外,還利用mothur的tree.shared命令基于布雷柯蒂斯(Bray-Curtis)距離進(jìn)行樣品間的非加權(quán)組平均法(UPGMA)聚類分析.

挑選豐度較高的OTUs(總序列數(shù)大于20)進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析.先將這些OTUs的代表序列上傳到NCBI的GenBank數(shù)據(jù)庫(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)做blastn比對,并下載參考序列.基于ClastalW進(jìn)行序列比較,并切除兩端不匹配的序列,然后利用Mega 6[14]的Models進(jìn)行模型預(yù)測.挑選出最優(yōu)的模型General Time Reversible,利用最大似然法(Maximum Likelihood)進(jìn)行Bootstrap值為1 000的系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建.

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

利用CANOCO V5.0對氨氧化古菌的群落結(jié)構(gòu)組成和環(huán)境因子之間進(jìn)行冗余分析(RDA);并利用SPSS 20對amoA基因豐度和主要類群與環(huán)境因子之間分別進(jìn)行兩兩之間的Spearman相關(guān)性分析,以確定達(dá)到極顯著水平(p<0.01)或顯著水平(p<0.05)的環(huán)境生態(tài)因子.

1.6 基因序列的提交號

將獲得的原始序列提交至NCBI數(shù)據(jù)庫,獲得序列號PRJNA948716.

2 結(jié)果與討論

2.1 氨氧化古菌群落多樣性

夏季珠江口的表層及底層的溫鹽差異非常明顯(圖1).從珠江河口A2一直到外海A18的斷面的鹽度差異尤其明顯,包括了全淡水環(huán)境到淡海水交匯環(huán)境最后到全海水環(huán)境(圖1).

每個(gè)站位的樣品序列的覆蓋度均達(dá)到了0.99(表1),且稀釋曲線隨測序量增加而逐步達(dá)到飽和,均顯示了測序深度足夠反映樣品的多樣性.

表1 夏季珠江口氨氧化古菌amoA基因測序信息

總體而言,夏季珠江口各站位AOA的OTUs偏低,數(shù)目最多的A2B-0.22擁有52個(gè)OTUs,而A18B-3僅含有6個(gè)OTUs(表1).其次,底層樣品的OTUs數(shù)目高于表層;cDNA樣品的OTUs數(shù)目高于DNA,結(jié)果與之前的研究相似[10].主要是淡水來源的A2B站位含有最大的OTU數(shù)(52),同時(shí)也有最大的群落豐富度指數(shù)(6.34)、均勻度指數(shù)(0.56)、香農(nóng)指數(shù)(2.22)和辛普森指數(shù)(0.81)(表1).生物群落的多樣性反映了生物群落的豐富度以及各個(gè)類群的相對比例.群落豐富度指數(shù)(Margalef)越高,說明此環(huán)境中生物群落的種類越豐富;對于均勻度指數(shù)J'(Pielou's Evenness)來說,指數(shù)越高說明在此環(huán)境中各群落的分布均一性越好;辛普森指數(shù)代表了群落優(yōu)勢度,其值越高說明群落在此環(huán)境種類越豐富;香農(nóng)指數(shù)則是綜合考慮了群落豐富度和均勻度的一個(gè)群落多樣性指數(shù),其指數(shù)值越高,則反映在此環(huán)境中群落多樣性越高.基于各個(gè)參數(shù),大概得出以下結(jié)論:(1)鹽度較低的站位(例如A2、A4、A6和A8),AOA的群落多樣性顯著高于其他鹽度較高的站位(p<0.05);(2)同一研究站位,表層來源的AOA群落多樣性高于底層;(3)通過DNA水平和cDNA水平的比較,發(fā)現(xiàn)cDNA水平上的群落多樣性反而高于DNA水平;(4)cDNA水平的均勻度指數(shù)高于DNA水平,說明AOA的一些豐度較低的物種卻具有極強(qiáng)的轉(zhuǎn)錄活性或者一些豐度較高的物種具有極低的轉(zhuǎn)錄活性,如豐度最高的OTU1在DNA水平上的相對比例為68%～97%,cDNA水平上為48%～60%;而OTU2在DNA水平上的相對比例為2%～27%,cDNA水平上為25～45%.cDNA水平上更為直觀地反映了活躍代謝的微生物類群,能增加人們對于微生物群落組成和分布及生態(tài)功能的全面認(rèn)識,如之前在珠江口的研究發(fā)現(xiàn)某些SCM1-like簇亞系的高轉(zhuǎn)錄活性[10].此外,轉(zhuǎn)錄水平上的結(jié)果還需要結(jié)合其他研究手段來反映真正的生態(tài)功能.

2.2 AOA amoA基因的系統(tǒng)發(fā)育分析

夏季珠江口的AOA主要聚于7簇,分別是Shallow group簇,Freshwater簇,SCM1-like簇,Coastal簇,Sediment簇,Deep group簇,Soil簇,其中Shallow group簇被細(xì)分為Shallow group Ⅰ亞簇、Shallow group Ⅱ亞簇,Shallow group Ⅲ亞簇;Freshwater簇和Coastal簇是本研究中新發(fā)現(xiàn)的并分別命名(圖2).

Shallow group簇是夏季珠江口的優(yōu)勢種群,這與之前的研究相一致[10].其中Shallow group Ⅰ亞簇包括OTU1和OTU3在內(nèi)共7個(gè)OTUs;Shallow group Ⅱ亞簇也包含了8個(gè)OTUs;Freshwater簇,SCM1-like簇,Coastal簇,Sediment簇,Deep group簇,Soil簇分別包含8,3,6,4,2,2個(gè)OTUs.這些序列絕大多數(shù)來源于海洋水體,少部分序列來自海洋沉積物和陸地生態(tài)系統(tǒng).其中Shallow group Ⅰ亞簇的同源序列來源于中國東海水體和南海水體、沉積物[15];Shallow group Ⅱ亞簇的同源序列來源于揚(yáng)子江河口[16]、東北太平洋的缺氧區(qū)[12]、東海水體和南海水體及沉積物[15],同時(shí)CN25菌株[17]也聚集在這個(gè)亞簇;Freshwater簇的同源序列來源于東江水體[18]及淡水水族館[19];Coastal簇的同源序列包括2株海岸分離的純菌(PS0和HCA1)[2]和來自墨西哥海灣、南海表面沉積物[16]的環(huán)境樣品序列;Sediment簇的同源序列來源于夏威夷珊瑚礁保護(hù)區(qū)沉積物、加利福尼亞灣沉積物[12];Deep group簇的同源序列來源于東北太平洋缺氧區(qū)、加利福利亞灣沉積物[9]和東海水體[15];Soil簇的同源序列來源于崇明島東灘濕地[20]、太湖沉積物[21]和東海水體[15].

2.3 氨氧化古菌群落結(jié)構(gòu)組成

通過對得到的總計(jì)185個(gè)OTUs進(jìn)行分類鑒定,獲得珠江口夏季AOA的群落結(jié)構(gòu)組成信息(圖3).

除A2B-0.22樣品外,其他樣品都被Shallow group Ⅰ亞簇主導(dǎo),而A2B-0.22樣品的AOA來源主要是Freshwater簇,其中底層樣品來源的OTU1和表層樣品來源的OTU3分別在其對應(yīng)的群落結(jié)構(gòu)組成中占據(jù)著較大比例,而OTU1和OTU3在系統(tǒng)進(jìn)化樹上均屬于Shallow group Ⅰ亞簇.在Tara Oceans的研究中,Shallow group Ⅰ亞簇在全球海洋的表層AOA群落中占主要地位[22],這表明Shallow group Ⅰ亞簇更適合此水域的環(huán)境,正如其代表性培養(yǎng)種(CandidatusNitrosopelagicusbrevisCN25)的基因組和蛋白質(zhì)組學(xué)所揭示的結(jié)果,Shallow group Ⅰ亞簇具有高編碼密度和普遍分布于寡營養(yǎng)表層海洋的流線型基因組[23].通過對同一站位樣品DNA和cDNA水平上進(jìn)行比較,Shallow group Ⅱ亞簇在cDNA水平上擁有相對更高的比例;Deep group簇只在cA16B-0.22和cA18B-0.22兩個(gè)樣品中存在;且Soil簇來源的也主要在A2B-0.22樣品中發(fā)現(xiàn).本研究的群落結(jié)構(gòu)組成與南海海域100 m[15]的AOA群落結(jié)構(gòu)組成極為相似,但本研究中未發(fā)現(xiàn)Shallow group Ⅲ亞簇.這可能是由于本研究的采樣點(diǎn)集中在珠江口,而Shallow group Ⅲ亞簇主要在南海開放海域中發(fā)現(xiàn)所造成的.

2.4 氨氧化古菌群落聚類分析

通過NMDs和UPGMA兩種聚類分析,樣品間的相似性聚類表現(xiàn)出了幾乎一致的結(jié)果(圖4):除淡水來源A2B站位和鹽度相對較低的A8B站位外,所有底層海水來源的0.22 μm(free-living)樣品聚集在一起;表層海水來源的free-living樣品聚集在一起;而底層海水來源的3 μm(attached)樣品聚集在一起,說明表層和底層來源的AOA差異較明顯.自由生活的與附著的AOA群落之間也存在著一定的差異,但相對于表層和底層之間的差異較小.

2.5 氨氧化古菌的amoA豐度分布

利用標(biāo)準(zhǔn)曲線分別計(jì)算自由生長和附著生長的AOAamoA基因拷貝數(shù)(圖5).自由生活(0.22 μm)的AOAamoA在DNA水平上表層拷貝數(shù)為2.31×102～2.76×105copies/L,其中A2、A8、A16站位未檢出;底層AOAamoA基因拷貝數(shù)為3.40×103～1.81×106copies/L;而底層cDNA水平上AOAamoA基因拷貝數(shù)為4.66×101～1.73×104copies/L且A2和A6站位未檢出.附著生活(3 μm)的AOAamoA在DNA水平上表層拷貝數(shù)為8.57×101～1.98×104copies/L,其中A8站位未檢出;表層cDNA水平上AOAamoA基因拷貝數(shù)為1.93×102～5.87×103copies/L且A2、A8、A16和A18站位未檢出;底層AOAamoA基因拷貝數(shù)為2.21×102～6.60×103copies/L;而底層cDNA水平上AOAamoA基因拷貝數(shù)為1.06×102～5.81×103copies/L.通過以往的文獻(xiàn)報(bào)道顯示:珠江表層水體中AOAamoA拷貝數(shù)為 6.27×104～3.63×107copies/L,而底層水體為3.59×105～4.98×108copies/L[10];不同營養(yǎng)類型湖泊中AOAamoA基因拷貝數(shù)為7.80×104～1.34×106copies/L[8].總體而言,0.22 μm比3 μm有著更高的amoA基因豐度;無論是在0.22 μm孔徑還是在3 μm孔徑上,amoA的豐度都有著從河口到外海升高的趨勢;而從DNA相對于cDNA上的占比看,0.22 μm孔徑上的比值大于3 μm孔徑,說明自由生活的AOAamoA基因活性比附著生活的低,表明了AOA微生物的生活策略與之前的研究相符[10].在0.22 μm孔徑上,底層的樣品的amoA基因豐度遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于表層.

2.6 相關(guān)性分析

RDA分析表明夏季珠江口氨氧化古菌群落組成受到溫度和鹽度顯著影響.Spearman相關(guān)性分析顯示,溫度與鹽度及Shallow group Ⅱ亞簇呈極顯著負(fù)相關(guān)(p<0.01);鹽度與Shallow group Ⅱ亞簇呈極顯著正相關(guān)(p<0.01),而與SCM1-like簇呈負(fù)相關(guān)(p<0.05);但溫度和鹽度均未與amoA基因豐度顯示出任何相關(guān)性(表2).以往對珠江口河口到南海沉積物中氨氧化微生物的研究也證明了鹽度是影響AOA群落結(jié)構(gòu)的關(guān)鍵因素,且AOA的豐度與pH和溫度呈正相關(guān)[3];珠江口沉積物中的AOA豐度與鹽度相關(guān),且鹽度越低豐度更高[24].而本研究發(fā)現(xiàn)AOAamoA基因豐度隨著鹽度降低而降低,這可能是本研究聚焦于海水樣品所造成的差異,且河口系統(tǒng)中AOA的amoA基因豐度不僅僅受鹽度因子的調(diào)節(jié),同時(shí)還會受到溫度、無機(jī)營養(yǎng)鹽濃度和溶解氧的組合控制[11].

表2 夏季珠江口氨氧化古菌群落組成、豐度與環(huán)境因子之間的Spearman相關(guān)性分析

3 結(jié) 論

通過對夏季珠江口氨氧化古菌的群落結(jié)構(gòu)及豐度分布進(jìn)行研究,研究結(jié)論如下:(1)主要是淡水來源的A2站位有著最大的AOA群落多樣性但有最低的amoA豐度,且群落結(jié)構(gòu)組成主要是Freshwater簇占主導(dǎo);(2)除A2站位外,其他樣品均被Shallow group Ⅰ亞簇主導(dǎo),而Shallow group Ⅱ亞簇有著更高的轉(zhuǎn)錄活性;(3)AOAamoA基因豐度在底層樣品中明顯高于表層,且free-living的AOA豐度比attached高10～1 000倍;(4)Shallow group Ⅱ亞簇與溫度存在極顯著負(fù)相關(guān),但其和SCM1-like簇與鹽度存在著顯著正相關(guān).