崔宗斌,任靜,龍勇

(1.廣東省科學院 微生物研究所,廣州 510070;2.中國科學院 水生生物研究所,武漢 430072)

溫度是一個十分關鍵的環(huán)境因子,參與動物體幾乎所有生命活動的調(diào)控.魚類屬于變溫動物,其生長、繁殖、能量代謝等對環(huán)境溫度的變化更為敏感.在一定溫度范圍內(nèi),魚體可通過調(diào)節(jié)自身的新陳代謝和生理活動來適應環(huán)境的溫度變化,但當水體溫度超過魚體耐受范圍時就會破壞其生理生化功能,造成機體組織損傷甚至導致魚死亡[1].近年來,我國水產(chǎn)養(yǎng)殖特別是南方海水養(yǎng)殖發(fā)展迅速,然而許多優(yōu)良魚類養(yǎng)殖品種,如尼羅羅非魚(Oreochromisniloticus)[2]、金頭鯛(Sparusauraa)和牙鲆(Paralichthysolivaceus)[3],均不具有耐低溫的特點,冬季寒潮降臨時常出現(xiàn)大量死亡,造成嚴重的經(jīng)濟損失.本文主要介紹低溫脅迫導致魚體應激反應和損傷的信號通路與調(diào)控機制,旨在為培育耐寒養(yǎng)殖魚類新品種和促進我國水產(chǎn)養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的發(fā)展提供理論參考.

1 低溫脅迫造成的魚體損傷

低溫作為一種物理信號,可參與魚體幾乎所有的生命活動調(diào)控,超出耐受范圍的低溫可對魚體的許多組織、器官和系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)與功能造成損傷.魚類在低溫條件下的損傷與能否生存,取決于低溫暴露的嚴重程度和持續(xù)時間,而且不同種群對急性溫度變化的耐受性通常有很大差異[1].在致死低溫脅迫下,魚類在分子、細胞、組織和系統(tǒng)等多個水平發(fā)生損傷作用(圖1).例如:在分子水平,低溫會降低核酸和蛋白質(zhì)的活性,影響其結(jié)構(gòu)和功能[4];在細胞水平,低溫可降低微管蛋白的穩(wěn)定性以及生物膜的流動性,引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激反應,使線粒體產(chǎn)生活性氧(Reactive Oxygen Species,ROS),出現(xiàn)功能障礙[5-6].低溫脅迫還會影響魚體各組織和系統(tǒng)的功能,主要包括神經(jīng)、心血管、免疫等系統(tǒng).

1.1 低溫脅迫與魚體神經(jīng)系統(tǒng)

在脊椎動物中,神經(jīng)系統(tǒng)可快速感知和響應外界溫度變化,同時腦部作為神經(jīng)中樞可參與體溫調(diào)節(jié),即使是變溫脊柱動物也有一定的體溫調(diào)節(jié)能力.在受到降溫刺激30 s后,鯉魚(Cyprinuscarpio)腦部下丘腦周圍的內(nèi)分泌神經(jīng)元被激活,然后釋放促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素(Corticotropin Releasing Hormone,CRH),誘導下游的生理反應[7].有文獻報道[8],下丘腦視前區(qū)可能是變溫脊椎動物最重要的體溫調(diào)節(jié)器,它包含對熱敏感和冷敏感的神經(jīng)元,整合來自身體不同部位的溫度信息,并且在外界溫度變化過程中,決定體溫高低.研究發(fā)現(xiàn),太陽魚(Lepomiscyanellus)和金魚(Carassiusauratus)下丘腦的視前區(qū)中部和雙側(cè)被電損毀后,會打亂其對極端溫度的逃避行為,導致體溫不再保持恒定[9].大腦中的快速生理適應能力使魚體能夠應對劇烈的溫度下降,而不會導致立即死亡.低溫脅迫會增加斑馬魚(Daniorerio)大腦中的ROS水平,從而激活過氧化物酶體增殖劑激活受體(Peroxisome Proliferators-Activated Receptors,PPARs),活化的PPARs可以通過增強抗氧化酶的活性或表達來控制魚腦組織中超氧化物的積累[10].

低溫脅迫對神經(jīng)系統(tǒng)的損傷主要體現(xiàn)在大腦組織結(jié)構(gòu)、功能以及神經(jīng)行為等方面[11].WESTFALL等[12]發(fā)現(xiàn),短時間低溫脅迫可增加小鼠交感神經(jīng)緊張度以及代謝活動,而長時間處于寒冷條件下,機體的感覺神經(jīng)和運動神經(jīng)都會受到抑制,甚至會引起凍僵反應并造成不可逆的損害.另有文獻報道[13],小鼠在低溫脅迫下出現(xiàn)沮喪、緊張和混亂等現(xiàn)象,并且認知能力下降.研究發(fā)現(xiàn),斑馬魚幼魚在10 ℃致死低溫脅迫下失去運動能力,腦組織切片透射電鏡圖像出現(xiàn)大量凋亡、壞死和自噬細胞(圖2),隨著低溫暴露時間的延長,存活率逐漸降低,最終全部死亡[14].利用功能性磁共振成像技術(shù),研究者發(fā)現(xiàn)鯉魚在15 ℃低溫條件下暴露90 s后,體溫調(diào)節(jié)中樞視中前區(qū)被激活,其腦部血流量下降,供血量嚴重不足,從而影響神經(jīng)系統(tǒng)的功能[7].

1.2 低溫脅迫與魚體心血管系統(tǒng)

在哺乳動物中的研究表明,低溫暴露可以明顯增加心血管系統(tǒng)疾病(高血壓、心肌梗死、中風等)的發(fā)病率和死亡率[15].低溫脅迫會導致心肌收縮功能不足和心臟重構(gòu),從而使氧化應激增強,抗氧化抵御能力減弱[16].有人發(fā)現(xiàn),在急性冷水刺激下小鼠的血液濃縮,局部組織血紅蛋白、紅細胞顯著升高,血小板高凝集甚至形成血栓[17].許多研究報道[18-19],魚類的心臟結(jié)構(gòu)、心率、心肌收縮力以及血液生化反應等通常會隨著溫度的波動而發(fā)生變化.虹鱒(Oncorhynchusmykiss)在低溫條件下結(jié)締組織增加,心臟肥大,從而導致心臟功能受損、心力衰竭[20].尼羅羅非魚在13 ℃低溫暴露下,紅細胞數(shù)量、平均紅細胞體積以及平均紅細胞血紅蛋白顯著降低[21].將斑馬魚幼魚暴露于10 ℃致死低溫條件下,會導致其圍心腔擴大、心率降低、心臟結(jié)構(gòu)異常以及心肌中紅細胞減少,大量紅細胞積聚在卵黃、腹腔等部位[14].這些研究結(jié)果表明,低溫脅迫會對魚體心血管功能造成嚴重損傷.

1.3 低溫脅迫與魚體免疫系統(tǒng)

魚類免疫系統(tǒng)是機體執(zhí)行免疫應答和免疫功能的組織系統(tǒng),由免疫組織器官(胸腺、脾臟和腎臟)、免疫細胞以及免疫因子組成.魚類的免疫功能與環(huán)境溫度息息相關,急性或者慢性的低溫暴露都會損害魚體抵御病原體的能力[22].據(jù)報道[23-24],低溫(或高溫)脅迫會抑制石斑魚(Epinephelussp)和羅非魚(Oreochromismossambicus)的免疫力,從而導致石斑魚對溶藻弧菌以及羅非魚對鏈球菌的抵抗力顯著降低.暴露于15 ℃低溫條件下的牙鲆對病毒性出血性敗血癥病毒(Viral Hemorrhagic Septicemia Virus,VHSV)敏感,死亡率為24%,而當水溫保持在20 ℃時不會觀察到死亡個體[25].

與哺乳動物類似,魚類的免疫系統(tǒng)分為先天性免疫和適應性免疫兩大部分.先天性免疫又稱為非特異性免疫,由胚系編碼的效應分子(抗菌肽、補體)和免疫細胞(巨噬細胞、中性粒細胞、嗜酸性粒細胞、嗜堿性粒細胞、細胞毒性細胞)組成,可識別保守的微生物相關分子模式(Microbe-Associated Molecular Patterns,MAMP).研究表明,魚體在受到細菌和原生動物病原體攻擊時,外周血白細胞(粒細胞、淋巴細胞、單核細胞)的組成受溫度影響[22].石斑魚和羅非魚分別受到溶藻弧菌、鏈球菌攻擊時,低溫條件下血液中白細胞數(shù)量顯著減少[23-24].此外,暴露于急性或慢性低溫條件下的魚體外周血白細胞的活性普遍受到抑制.虹鱒在5 ℃低溫脅迫下2月,其血液中白細胞的吞噬活性相對于15 ℃顯著降低[26].巨噬細胞和中性粒細胞是硬骨魚類最主要的先天免疫細胞,在長期暴露于低溫環(huán)境下其活性增強,從而可以對其他免疫缺陷進行補償[27].魚類個體發(fā)育過程中,低溫還影響著各種免疫基因的表達,包括促炎性細胞因子、抗病毒途徑蛋白和Toll樣受體(Toll-Like Receptor,TLR).在歐洲鱸魚(Dicentrarchuslabrax)和大西洋鮭(Salmosalar)中,長期低溫刺激會誘導腫瘤壞死因子(Tumor Necrosis Factor,TNF-α)以及白細胞介素(IL-1β)的表達,表明魚類在低溫脅迫下會引發(fā)炎癥反應[28-29].斑馬魚在受到干擾素誘導劑(Polyl:C)刺激時,免疫相關基因il1β、ifn1、ifng、inos、irf3和mda5的誘導表達,在低溫環(huán)境下均受到抑制[30].低溫脅迫還會對抗原呈遞具有負面影響,從而導致魚體受到病原體攻擊時免疫反應受損[31].

魚類適應性免疫又稱為特異性免疫,具有可誘導、病原體特異等特性,通過免疫細胞(T細胞、B細胞)和體液(抗體)產(chǎn)生免疫記憶.B細胞在抗原刺激下分化為漿細胞,漿細胞可合成和分泌抗體(免疫球蛋白),主要執(zhí)行機體的體液免疫[32].當魚體遭遇低溫脅迫時,會對B淋巴細胞增殖和功能產(chǎn)生不利影響.在暴露于11 ℃低溫條件下,斑點叉尾鮰(Ictaluruspunctatus)血液中的B細胞數(shù)量顯著減少,直到5周后才恢復到正常水平[33].水體溫度在3 h內(nèi)從25 ℃下降到16 ℃,導致鯉魚脾臟和血液中B細胞的含量顯著降低[34].虹鱒受到病原體感染時,只有在較高溫度條件下(15 ℃),B細胞活化標記基因(分泌型igm、膜結(jié)合型igt、pax5和blimp1)的表達才會顯著上調(diào),表明在低溫條件下B細胞對病原體的反應受到損害[35].此外,低溫通常會抑制魚體響應病原體或滅活疫苗時抗體產(chǎn)生的能力.在虹鱒中使用針對病毒性出血敗血癥病毒(Viral Hemorrhagic Septicemia Virus,VHSV)的DNA疫苗后,養(yǎng)殖水溫在15 ℃時觀察到的血清抗體滴度比10 ℃高,而在5 ℃低溫條件下未檢測到抗體,并且暴露于病毒后的種群存活率也與溫度有關,表明在較低溫度下疫苗接種效率可能降低[36].總之,急性或慢性低溫暴露通常會對硬骨魚類的免疫系統(tǒng)產(chǎn)生抑制作用,特別是適應性免疫,而具體影響取決于溫度變化的幅度、持續(xù)時間以及魚的種類(表1).

2 低溫脅迫相關的“存活”途徑

為了抵抗環(huán)境溫度變化對機體造成的不利影響,魚類進化出了十分有效的低溫適應機制,即在低溫脅迫條件下,魚體通過生化重構(gòu)(Biochemical restructuring)和遺傳調(diào)控,調(diào)整細胞內(nèi)特定分子的種類和數(shù)量,建立新的胞內(nèi)穩(wěn)態(tài),最終增強低溫耐受能力[37].生化重構(gòu)主要表現(xiàn)為:改變細胞膜流動性,合成低溫特異性的同工酶,調(diào)整線粒體密度和特性,改變組織結(jié)構(gòu)等.遺傳調(diào)控包括:表觀遺傳調(diào)控、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、蛋白質(zhì)翻譯后修飾以及代謝物變化等.近年來,隨著轉(zhuǎn)錄組、蛋白質(zhì)組以及生物信息學的快速發(fā)展,極大地促進了魚類低溫應激反應的分子機制研究.目前,研究者已采用RNA-seq方法研究了鯉魚(Cyprinuscarpio)、斑馬魚(Daniorerio)、羅非魚(Oreochromismossambicus)、斑點叉尾鮰(Ictaluruspunctatus)等物種低溫脅迫反應和適應的轉(zhuǎn)錄反應.在斑馬魚仔魚中的研究發(fā)現(xiàn),即使在10 ℃致死低溫條件下,基因表達也具有適應性反應的特征,并且魚體對低溫的響應依賴于各種生物學過程和信號途徑,其中起保護作用的信號通路包括:Ca2+信號通路、MAPK、FoxO以及自噬等[14].

表1 低溫脅迫對不同魚類免疫反應的影響

2.1 Ca2+信號通路

鈣離子作為細胞內(nèi)重要的第二信使,可以發(fā)揮信息傳遞的作用,參與調(diào)控各種生物學過程.當機體或者細胞受到外界刺激時,胞內(nèi)Ca2+濃度通過離子通道介導的胞外游離Ca2+內(nèi)流以及胞內(nèi)鈣庫的釋放而增加[38].胞內(nèi)Ca2+可以與各種傳感器和效應器結(jié)合以改變它們的構(gòu)象和活性,從而啟動下游信號傳導事件.研究表明,高溫和低溫應激都可以激活機體內(nèi)鈣離子信號通路.在高溫條件下,熱傳感器和鈣離子經(jīng)過一系列信號級聯(lián)反應將信號傳遞給熱應激轉(zhuǎn)錄因子,進而調(diào)控熱誘導基因的表達[39].我們將表達鈣離子熒光指示劑的轉(zhuǎn)基因斑馬魚仔魚暴露于高溫條件下,會引發(fā)即時和短暫的鈣信號;熱應激誘導的鈣信號的活性在30 s達到峰值,并在開始暴露后120 s迅速下降至接近基礎水平[40].

早期在昆蟲和植物中的研究發(fā)現(xiàn),鈣離子信號通路在低溫應激反應中起著重要的調(diào)控作用,是傳遞低溫信號的關鍵信使[41].昆蟲在受到低溫脅迫后,細胞膜上的鈣離子通道開啟,介導胞外Ca2+向胞內(nèi)流動,進入到細胞內(nèi)的Ca2+可以結(jié)合鈣調(diào)蛋白,然后激活下游的一些轉(zhuǎn)錄因子和信號通路[42].水稻在低溫脅迫下,G蛋白信號調(diào)節(jié)因子(COLD1)與G-蛋白互作激活鈣離子通道,觸發(fā)下游耐寒防御反應[43].抑制鈣離子信號通路可以完全消除昆蟲的快速低溫強化作用(Rapid Cold Hardening,RCH)以及植物低溫的適應能力[42].這些研究結(jié)果說明鈣離子作為低溫信使的功能在不同的物種中具有一定的保守性.鈣離子信號通路在魚類低溫應激過程中也有可能發(fā)揮非常重要的調(diào)控作用.對黃姑魚(Nibeaalbiflora)的大腦和肌肉進行轉(zhuǎn)錄表達和定量分析,發(fā)現(xiàn)7.5 ℃低溫暴露12 h后,鈣離子信號通路相關鈣結(jié)合蛋白7基因(cbp7)顯著上調(diào)[44].石斑魚肝臟的轉(zhuǎn)錄組研究發(fā)現(xiàn),低溫處理(水溫以1 ℃/h的速率從28 ℃降至13 ℃并保持1 h)后,有41個差異表達基因富集到鈣離子信號通路[45].這些研究結(jié)果說明,魚類在低溫脅迫下也能激活鈣離子信號通路,但還有待深入研究鈣離子信號系統(tǒng)在魚類低溫信號傳導、耐寒和低溫適應過程中的作用和機制.

2.2 MAPK信號通路

絲裂原活化蛋白激酶(Mitogen-Activated Protein Kinase,MAPK)是生物體內(nèi)非常重要的信號轉(zhuǎn)導因子,當機體或者細胞受到外界環(huán)境刺激時可將信號從細胞表面?zhèn)鬟f到細胞核內(nèi)部.MAPK家族主要由細胞外信號調(diào)節(jié)激酶(Extracellular Signal-Regulated Kinase,ERK)、p38和c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal Kinase,JNK)組成.早期研究表明,ERK信號通路主要參與細胞增殖、分化、遷移和凋亡等多種生物學過程[46],而JNK和p38能夠被各種環(huán)境刺激和遺傳毒性脅迫激活[47-48].在擬南芥、水稻等植物中發(fā)現(xiàn),MAPK信號通路參與冷馴化過程,并且有利于提高耐寒能力[49-50].紅尾肉蠅(Sarcophagacrassipalpis)在低溫條件下暴露10 min,p38蛋白的磷酸化水平顯著上升,是啟動低溫應激反應的重要激酶[51].以上研究表明,MAPK信號通路在不同物種中響應低溫脅迫的功能是保守的.

低溫信號的感知和細胞內(nèi)轉(zhuǎn)導對于魚體在低溫脅迫下的適應和生存至關重要.MAPK作為重要的細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導系統(tǒng),參與不同魚類低溫應激響應的調(diào)控.我們利用TMT標記定量磷酸化蛋白質(zhì)組技術(shù),研究離體斑馬魚胚胎成纖維細胞系ZF4在低溫應激早期的蛋白質(zhì)磷酸化修飾,發(fā)現(xiàn)在510個蛋白上的702個磷酸化位點發(fā)生差異變化;激酶底物預測結(jié)果表明,ERK1/2是低溫應激過程中調(diào)控蛋白質(zhì)磷酸化的關鍵激酶,磷酸化水平發(fā)生差異變化的蛋白在功能上也與MAPK信號通路有關[52].轉(zhuǎn)錄組分析已成為揭示魚類應激反應及其調(diào)控機制的重要手段,人們應用RNA-seq技術(shù)檢測了不同魚類響應不同程度低溫刺激(急性或慢性低溫暴露、短暫或長期低溫處理)的轉(zhuǎn)錄變化,發(fā)現(xiàn)斑馬魚(Daniorerio)[53]、石斑魚(Epinephelussp)[45]、牙鲆(Paralichthysolivaceus)[3]以及黃姑魚(Nibeaalbiflora)[44]等在低溫脅迫下都能激活MAPK信號通路.此外,我們的生化實驗證明,在致死低溫暴露過程中,斑馬魚仔魚的p38和ERK1/2信號通路顯著激活,并且在低溫處理過程抑制ERK和P38信號通路的活性,會導致斑馬魚低溫耐受能力顯著降低[14].以上研究結(jié)果表明,低溫脅迫激活的MAPK信號通路在魚類耐寒和低溫適應過程中起保護作用.

2.3 FoxO信號通路

叉頭蛋白O(FoxO)蛋白家族是一類重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子,其結(jié)構(gòu)和功能在從線蟲到人類的所有后生動物中都是保守的.FoxO蛋白由DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(DNA Binding Domain,DBD)、核定位信號(Nuclear Localization Signal,NLS)結(jié)構(gòu)域、核輸出序列(Nuclear Export Signal,NES)和C端反式激活結(jié)構(gòu)域組成,主要參與調(diào)控細胞自噬、凋亡、代謝以及應激反應等生理過程[54].FoxO作為細胞穩(wěn)態(tài)、應激反應的核心調(diào)節(jié)因子,其活性受多種翻譯后修飾控制,包括磷酸化、乙?；?、甲基化和泛素化.研究發(fā)現(xiàn),FoxO家族蛋白參與熱休克反應途徑和熱休克因子1(Heat shock factor 1,HSF1)介導的應激反應.在黑腹果蠅(Drosophilamelanogaster)中,dFoxO可以直接調(diào)節(jié)各種熱休克蛋白(Heat Shock Protein,HSP)的表達,包括應激誘導的HSP70相關伴侶家族[55];在小鼠中,熱應激通過Hsp72直接激活FoxO信號通路[56].對鯉魚、斑馬魚的研究表明,無論是溫和還是致死低溫刺激都能激活FoxO信號通路,當FoxO的轉(zhuǎn)錄活性受到抑制時,松浦鏡鯉(Songpumirrorcarp)的低溫適應能力以及斑馬魚仔魚的低溫耐受能力都顯著降低[14,57].在應激條件下,FoxO信號通路的活性受蛋白激酶B(Protein Kinase B,PKB/Akt)、AMP依賴的蛋白激酶(AMP-Activated Protein Kinase,AMPK)以及JNK調(diào)控[58].鯉魚在低溫應激過程中,通過激活JNK信號通路以及抑制AKT信號通路,從而介導FoxO信號通路的激活[57].因此,FoxO信號通路及其調(diào)控的下游生物學過程在魚類耐寒和低溫適應過程中起重要作用.

2.4 自噬

自噬是一個將自身細胞成分隔離到溶酶體中進行降解的過程,降解產(chǎn)物可被循環(huán)利用構(gòu)建新的細胞結(jié)構(gòu)或細胞器.這一過程由多種應激源誘導,如營養(yǎng)缺乏、熱休克、缺氧、氧化應激和病原體感染.選擇性降解的細胞內(nèi)成分通常包括聚集或無用的蛋白質(zhì)、受損的細胞質(zhì)成分、過量的過氧化物酶體以及入侵的微生物等.根據(jù)底物進入溶酶體的途徑自噬被分為三類:巨自噬、微自噬和分子伴侶介導的自噬[59].巨自噬是最重要且研究最深入的自噬形式,其發(fā)生及調(diào)控的分子機制包括以下幾個階段:1)自噬起始階段,由ULK1,FIP200,Atg13三種蛋白形成的ULK1復合物介導,誘導Ⅲ類磷酸肌醇3激酶(Phosphoinositide 3-Kinase,P13K)復合物形成吞噬細胞;2)自噬體的延伸階段,ATG5,ATG12和ATG16L以及微管相關蛋白輕鏈3(LC3II)組成的復合物刺激吞噬細胞的伸長;3)隨著自噬體的形成,LC3II與蛋白p62結(jié)合形成LC3-II-p62復合物,然后自噬體與溶酶體融合以吞噬靶蛋白和細胞器[60].因此,LC3-I,LC3-II和p62通常被認為是自噬過程的激活標志物.

自噬在響應環(huán)境變化以控制細胞穩(wěn)態(tài)和新陳代謝方面發(fā)揮著重要作用.在正常情況下,自噬維持細胞內(nèi)穩(wěn)態(tài),而在饑餓、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激以及外界脅迫(如低溫、低氧)等情況下,自噬則起自我保護的生存作用.文獻報道,在急性冷刺激早期誘導的HeLa細胞自噬有利于細胞存活,并且低溫刺激的同時用自噬抑制劑處理可使細胞內(nèi)ROS增加,推測自噬是通過降低ROS水平從而對細胞起保護作用[61].在斑馬魚ZF4細胞中發(fā)現(xiàn),在低溫應激條件下組蛋白去乙?；?0(Histone Deacetylase 10,HDAC10)通過上調(diào)細胞自噬相關基因的表達,從而提高細胞在低溫脅迫下的存活[62].斑馬魚仔魚在致死低溫脅迫下會誘導自噬相關基因表達,并且在低溫暴露過程中加入自噬抑制劑Bafilomycin A1,斑馬魚的抗寒能力顯著降低[14].此外,在斑馬魚成魚肝臟組織中發(fā)現(xiàn),低溫脅迫以及饑餓處理會觸發(fā)線粒體自噬,參與低溫環(huán)境下肝細胞能量穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)[63],這可能是魚類抵抗寒冷和饑餓應激的重要代謝策略.

3 低溫脅迫相關的“死亡”途徑

魚類在低溫脅迫下,最終的命運是存活或者死亡.前文已綜述了低溫刺激會誘發(fā)魚體的保護性反應,從而增強其在致死低溫下的存活率;同時,低溫損傷也能激活機體死亡途徑,包括p53、凋亡以及壞死性凋亡,從而導致魚體死亡.研究表明,輕度或者中度損傷以及低水平的死亡信號通常會誘導細胞凋亡,而重度損傷和高水平的死亡信號則會導致壞死性凋亡[64].這些細胞死亡過程可以互相聯(lián)系,甚至通過重疊的信號通路進行交叉對話,而細胞最終的命運是不同死亡途徑相互作用的結(jié)果[65].

3.1 細胞凋亡與壞死性凋亡

細胞凋亡(Apoptosis)是機體為維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài),自主發(fā)生的一種由基因控制的程序性死亡方式,主要由Caspase激酶、銜接蛋白、腫瘤壞死因子受體家族蛋白、Bcl-2家族蛋白等四類因子共同參與和精準調(diào)控.細胞凋亡的過程大致可分為以下幾個階段:接受凋亡信號、凋亡調(diào)控分子間的相互作用、蛋白水解酶的活化、最后進入連續(xù)反應過程.凋亡的啟動有兩條途徑,分別是外在(死亡受體)途徑和內(nèi)在(線粒體)途徑[66].當Caspase激酶受抑制條件下,受體相互作用蛋白1(Receptor-Interacting Protein kinase 1,RIP1)和RIP3(Receptor-Interacting Protein kinase 3)結(jié)合形成壞死體(Necrosome),并激活混合系列蛋白激酶樣結(jié)構(gòu)域(Mixed Lineage Kinase Domain-Like protein,MLKL)從而引發(fā)壞死性凋亡(Necroptosis)[67].在細胞凋亡早期,通過對應激后不能恢復細胞進行清除,以達到保護組織免受脅迫損傷的目的;但是當細胞凋亡積累到一定程度時會導致組織受到不可恢復的損傷,最終導致機體死亡.

凋亡和壞死性凋亡能被多種因素觸發(fā),包括腫瘤壞死因子(Tumor Necrosis Factor,TNF)、氧化應激、DNA損傷以及各種外界刺激.在細胞水平,低溫暴露會顯著降低羅非魚離體神經(jīng)細胞的融合度,并誘導細胞凋亡[68].在活體水平,不同程度的低溫脅迫都會引起不同魚類的不同組織發(fā)生凋亡現(xiàn)象.例如,斑馬魚和羅非魚成魚在8 ℃致死低溫條件下,鰓組織發(fā)生了凋亡現(xiàn)象[69];低溫損傷后恢復異常的斑馬魚腦織組中出現(xiàn)凋亡和壞死細胞,轉(zhuǎn)錄組分析表明低溫暴露和恢復過程中誘導的基因在凋亡和壞死性凋亡途徑中持續(xù)富集[14].這些研究僅局限于魚體在低溫條件下發(fā)生的細胞凋亡和壞死凋亡現(xiàn)象,尚未揭示魚類在低溫脅迫下引發(fā)凋亡的分子調(diào)控機制,以及細胞凋亡對魚體耐寒能力有何意義.

冷應激可通過誘導產(chǎn)生過量的ROS來引起氧化應激,當機體中的活性氧水平增加時,消除ROS的抗氧化酶系統(tǒng)會在體內(nèi)被激活[70].例如,急性低溫刺激可誘導ZF4細胞發(fā)生氧化應激[71];羅非魚和河豚(Takifuguobscurus)抗氧化酶基因的表達在低溫脅迫下顯著增加[72-73].然而,過度的氧化應激會引發(fā)對生物體的氧化損傷,從而直接導致細胞凋亡.在遮目魚(Chanoschanos)中發(fā)現(xiàn),低溫脅迫下其肝臟中的氧化應激被誘導,并通過外在凋亡途徑導致肝細胞凋亡[74].

低溫脅迫可誘發(fā)斑馬魚胚胎內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的應激反應,從而造成線粒體鈣超載并向胞質(zhì)釋放細胞色素C,胞質(zhì)中的細胞色素C與Apaf-1以及Caspase 9形成復合物,激活下游的細胞凋亡執(zhí)行者Caspase 3,進而引發(fā)線粒體介導的細胞凋亡信號通路,最終導致胚胎的死亡[5].此外,還發(fā)現(xiàn)斑馬魚仔魚在低溫損傷過程分別抑制凋亡、壞死性凋亡通路,其低溫耐受能力顯著提高,說明細胞凋亡和壞死性凋亡是低溫脅迫導致斑馬魚死亡的關鍵原因[14].

3.2 p53信號通路

p53蛋白是有著“分子警察”和“人類基因組衛(wèi)士”之稱的抑癌基因,有超過半數(shù)癌癥的發(fā)生伴隨著p53基因的突變.在正常細胞中p53被一系列調(diào)節(jié)因子維持在低水平,例如MDM2作為p53泛素連接酶,能夠促進p53的降解.在DNA損傷、細胞應激情況下,p53發(fā)生磷酸化和乙酰化而被激活[75],活化的p53選擇性的轉(zhuǎn)錄激活或抑制下游各個信號通路靶基因的表達,或者直接通過蛋白相互作的方式調(diào)節(jié)信號通路的開關.當細胞輕度損傷時,p53將會阻滯細胞周期,調(diào)節(jié)細胞代謝、進行DNA損傷修復;細胞損傷嚴重至無法修復時,p53則可誘發(fā)凋亡途徑,或者促進衰老進而引起細胞死亡[76].

文獻報道,離體細胞在40 ℃次高溫條件下,p53通過抑制過度熱激反應來促進細胞存活;然而,在43 ℃超高溫度下,誘發(fā)DNA損傷,被激活的ATM通過對p53的 S37位絲氨酸磷酸化,來穩(wěn)定p53蛋白并激活其轉(zhuǎn)錄功能,最終誘導細胞凋亡[77].低溫條件下,p53信號通路在不同魚類中被激活.在大黃魚(Larimichthyscrocea)不同組織中發(fā)現(xiàn),急性低溫刺激下p53信號通路相關基因會受到不同程度的影響,并具有組織特異性[78].羅非魚在8 ℃致死低溫條件下,核糖體蛋白(RPL11)與MDM2結(jié)合,抑制其泛素化連接酶的活性從而激活p53,并且隨著低溫暴露時間的延長,p53下游促凋亡相關基因bad和p21的誘導表達,說明低溫可通過p53信號通路引發(fā)細胞凋亡,從而造成魚體損傷[79].

4 低溫脅迫相關的“存活”與“死亡”途徑的互作機制

魚體對低溫脅迫的響應依賴于各種生物學過程和信號途徑.魚類的中樞神經(jīng)系統(tǒng)接收到低溫信號后激活離子通道,然后介導胞外Ca2+向胞內(nèi)流動,進入到細胞內(nèi)的Ca2+可以結(jié)合鈣調(diào)蛋白[40],從而激活MAPK信號通路以及蛋白激酶C(Protein Kinase C,PKC).激活的MAPK對FoxO、p53、自噬以及凋亡等都有重要的調(diào)控作用(圖3).在氧化應激誘導小鼠細胞凋亡中,JNK的磷酸化作用可以促進轉(zhuǎn)錄因子FoxO1從其阻斷蛋白14-3-3中的釋放,從而促進FoxO1進入細胞核行使其轉(zhuǎn)錄激活的作用[80].在低溫條件下,我們發(fā)現(xiàn)鯉魚JNK也會被激活從而調(diào)節(jié)FoxO信號通路,以保護魚體免受極端低溫脅迫的損傷[57].JNK-FoxO通過調(diào)節(jié)自噬相關(ATG)基因的表達來激活自噬[81].MAPK信號通路對細胞凋亡具有雙重作用,即可以促進細胞凋亡,也可以通過轉(zhuǎn)錄調(diào)控和翻譯后修飾下調(diào)促凋亡蛋白和上調(diào)抗凋亡蛋白來抑制凋亡[82].在應激細胞中,JNK介導的磷酸化可以穩(wěn)定和激活p53,從而促進細胞凋亡[83].ERK1/2和p38 MAPK通過磷酸化Caspase-9的Thr125位點,抑制高滲應激引起以及有絲分裂過程中的細胞凋亡[84-85].在低溫暴露過程中,抑制斑馬魚的ERK、p38信號通路以及FoxO1的轉(zhuǎn)錄活性,會影響p53信號通路和凋亡相關基因的表達,表明FoxO轉(zhuǎn)錄因子和MAPKs主要通過調(diào)節(jié)細胞凋亡來影響斑馬魚的抗寒能力[14].

5 結(jié)語和展望

低溫脅迫可同時激活魚體內(nèi)的存活和死亡信號通路.它們之間相互作用的動態(tài)平衡決定魚體的損傷程度和能否存活.目前,已知鈣離子在魚體感知和傳遞低溫信號過程中起著重要作用,但尚不清楚其如何在低溫脅迫下激活MAPK、FoxO等信號通路.以斑馬魚等模式魚為研究對象,利用磷酸化蛋白質(zhì)組和轉(zhuǎn)錄組學方法,結(jié)合使用特異性激活劑和抑制劑,以及遺傳學和生化技術(shù)手段,將可解析低溫脅迫相關信號通路的上游信號分子和信號傳導途徑.在系統(tǒng)解析低溫脅迫信號通路活性調(diào)控機制基礎上,鑒定關鍵分子靶標,利用基因編輯、分子模塊等育種新技術(shù),有望獲得經(jīng)濟魚類抗寒新品種.此外,低溫脅迫可損傷硬骨魚類的免疫系統(tǒng),深入研究腸道微生物尤其是益生菌在魚類抗寒過程中的作用和機制,有望用來提高魚類的免疫和抗寒能力,促進水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展.