余國營,姬志華,溫洪智,孫志恒

(河南師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院;河南省與科技部共建細(xì)胞分化調(diào)控國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室;河南省肺纖維化國際聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室,河南 新鄉(xiāng)453007)

乳酸曾一度被視為代謝廢物,然而最近的研究發(fā)現(xiàn)乳酸在各項(xiàng)生命活動(dòng)和疾病進(jìn)展的過程中發(fā)揮了至關(guān)重要的作用[1].多項(xiàng)研究表明乳酸可以作為一種能量來源,糖異生的前體和信號(hào)分子在機(jī)體中發(fā)揮作用[2].乳酸由糖酵解的終產(chǎn)物丙酮酸還原而來,通過質(zhì)膜上的單羧酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)體(MCTs)在細(xì)胞內(nèi)與微環(huán)境之間穿梭,因此,單羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在乳酸調(diào)控的代謝活動(dòng)中起著重要作用.其中MCT4主要負(fù)責(zé)細(xì)胞內(nèi)乳酸流出[3],其有助于穩(wěn)定細(xì)胞內(nèi)外的H+水平.由于乳酸的異常累積常和疾病的加重與不良預(yù)后密切相關(guān),故靶向MCT4是一種非常有前景的疾病治療策略.在此,總結(jié)了乳酸及MCT4的生理功能和參與調(diào)控MCT4表達(dá)的分子機(jī)制,同時(shí)也闡述了針對(duì)MCT4設(shè)計(jì)的抑制劑在疾病治療中的進(jìn)展.

1 乳酸的生物學(xué)功能

1.1 作為一種能量物質(zhì),實(shí)現(xiàn)細(xì)胞間的代謝偶聯(lián)

即便是在有氧氣存在的情況下,癌細(xì)胞仍以糖酵解作為主要的能源獲取方式,即“Warburg effect”.不僅僅是癌細(xì)胞,快速增殖的細(xì)胞幾乎都存在著類似的共性.除此之外,也有學(xué)者提出了“Reverse Warburg effect”,即在腫瘤中,葡萄糖主要被遠(yuǎn)離血管(缺氧)區(qū)域的癌細(xì)胞利用并供給能量,而靠近血管(富氧)區(qū)域的癌細(xì)胞處于代謝中的有利位置,且可以與缺氧區(qū)域癌細(xì)胞建立代謝共生關(guān)系.缺氧區(qū)域癌細(xì)胞將通過表達(dá)MCT4產(chǎn)生的乳酸排出細(xì)胞,而含氧區(qū)域的癌細(xì)胞則可以通過MCT1將胞外乳酸攝取進(jìn)胞內(nèi),并且在乳酸脫氫酶的作用下氧化為丙酮酸,進(jìn)而通過三羧酸循環(huán)和呼吸鏈供能[4].所以如將MCT1或MCT4的功能抑制進(jìn)而使乳酸不能在腫瘤微環(huán)境中得以循環(huán),缺氧的癌細(xì)胞將會(huì)因?yàn)槿鄙贍I養(yǎng)物質(zhì)發(fā)生死亡,可見乳酸及其轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在其中的關(guān)鍵作用.也有其他文獻(xiàn)表明在不同的組織器官中,乳酸及其轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白也發(fā)揮著重要作用,如:在骨骼肌中,表達(dá)MCT4的糖酵解型白色肌纖維向表達(dá)MCT1的氧化型紅色肌纖維提供乳酸[5](圖1).

在心肌細(xì)胞中,正常情況下脂肪酸氧化是產(chǎn)生ATP的主要途徑,然而在心力衰竭時(shí),心肌細(xì)胞代謝方式發(fā)生改變,從脂肪酸的氧化轉(zhuǎn)向糖酵解,乳酸便是最主要的能量來源.在大腦中也有類似的共生關(guān)系報(bào)道,正常的星形膠質(zhì)細(xì)胞以糖酵解的方式為自身提供能量,同時(shí)生成并釋放大量的乳酸,神經(jīng)元能夠吸收和利用乳酸,進(jìn)行充分氧化磷酸化供能,這一過程被稱為“神經(jīng)元-星形膠質(zhì)細(xì)胞乳酸穿梭”[6].

腫瘤微環(huán)境中的TGF-β信號(hào)可以被腫瘤細(xì)胞中的乳酸誘導(dǎo),進(jìn)而抑制由乳酸和其他經(jīng)典配體誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞炎癥小體的活化.因此,在特發(fā)性肺纖維化(Idiopathic Pulmonary Fibrosis ,IPF)中,乳酸可以作為一種新型的促纖維化介質(zhì),通過酸化細(xì)胞外空間,并以pH依賴的方式激活TGF-β,從而進(jìn)一步延續(xù)纖維化信號(hào).JUDGE等[7]確定乳酸脫氫酶A(Lactate Dehydrogenase-A,LDHA)是肺纖維化的潛在治療靶點(diǎn).LDHA可催化丙酮酸轉(zhuǎn)化為乳酸.進(jìn)一步的研究表明,LDHA抑制劑棉酚(gossypol)的處理不僅可以在體外抑制TGF-β1誘導(dǎo)的肌成纖維細(xì)胞分化和膠原生成,還可以以劑量依賴性的方式抑制博來霉素誘導(dǎo)的小鼠肺內(nèi)膠原蓄積和TGF-β1活化.該研究表明棉酚抑制LDHA在預(yù)防和治療博來霉素誘導(dǎo)的肺纖維化方面都有重要作用.與健康肺組織相比,特發(fā)性肺纖維化IPF中乳酸濃度顯著升高,約為正常肺組織的3倍[8].表明代謝失調(diào)的Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞(Alveolar type Ⅱ Epithelial Cell,AECⅡ)是IPF的主要驅(qū)動(dòng)因素,而控制乳酸代謝可能是一種干預(yù)和逆轉(zhuǎn)這種致命疾病的手段(圖2).

另外,IPF、系統(tǒng)性硬化癥(SSc)、哮喘和慢性阻塞性肺疾病(Chronic Obstructive Pulmonary Diseases,COPD)患者都受到胃食管反流病(Gastro-Esophageal Reflux Disease,GERD)的影響.有假說認(rèn)為食管上、下括約肌壓力的降低可能會(huì)導(dǎo)致小液滴的反流物微量吸入,長此以往,便會(huì)在分子和細(xì)胞水平上引起亞臨床肺損傷和纖維增生反應(yīng),導(dǎo)致肺纖維化.然而,GERD和IPF之間的因果關(guān)系尚未被很好地定義[9].

這些結(jié)果都說明乳酸在慢性疾病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著不可忽視的關(guān)鍵作用,理解并設(shè)法屏蔽上述疾病中的乳酸合成及其對(duì)效應(yīng)細(xì)胞的直接作用,是重要的潛在治療方案之一.

1.2 作為信號(hào)分子,介導(dǎo)細(xì)胞與外界環(huán)境信息交流

越來越多的研究顯示乳酸在細(xì)胞的生命活動(dòng)中承擔(dān)著信號(hào)分子的功能.GPR81又被稱為HCA1或HCAR1,是乳酸的特異性受體,被激活后不僅可以通過抑制Gi依賴性的腺苷酸環(huán)化酶活性進(jìn)而發(fā)揮抗脂解作用和抑制cAMP的形成[10].另外,GPR81在軟腦膜成纖維樣細(xì)胞中高度富集,被激活后可促進(jìn)腦血管內(nèi)皮生長因子A(VEGFA)以及腦血管的生成[11].值得注意的是,GPR81在免疫逃避和化療耐藥方面也發(fā)揮了至關(guān)重要的作用[12].GPR132是乳酸的另一個(gè)感受器,目前僅在巨噬細(xì)胞中發(fā)現(xiàn).過氧化物酶體增殖物激活受體(PPARγ)通過與GPR132的啟動(dòng)子結(jié)合抑制其轉(zhuǎn)錄活性,進(jìn)而抑制巨噬細(xì)胞向M2表型轉(zhuǎn)換,調(diào)節(jié)乳腺癌細(xì)胞-巨噬細(xì)胞之間的相互作用,抑制癌細(xì)胞黏附、遷移和侵襲.同樣在巨噬細(xì)胞中,其在攝取乳酸之后可以激活哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白復(fù)合物1(mTORC1),導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄因子TFEB及其下游的靶基因表達(dá)減少,比如編碼液泡質(zhì)子泵D2亞單位的Atp6v0d2,該蛋白亞單位可酸化溶酶體并促進(jìn)蛋白質(zhì)降解,即巨噬細(xì)胞可以通過乳酸介導(dǎo)的相關(guān)信號(hào)通路減少其胞內(nèi)蛋白的水解[13].此外,乳酸也可以直接與RLR(視黃酸誘導(dǎo)基因1樣受體)適配器線粒體抗病毒信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白(MAVS)的跨膜結(jié)構(gòu)域結(jié)合,抑制MAVS的聚集和RLR介導(dǎo)的Ⅰ型干擾素的產(chǎn)生,進(jìn)而干擾病原的清除.MAVS的跨膜結(jié)構(gòu)域不僅對(duì)其線粒體定位至關(guān)重要,而且也參與了RIG-I(視黃酸誘導(dǎo)基因蛋白I)對(duì)MAVS的招募.這可能是乳酸擾亂MAVS的線粒體定位和與RIG-I蛋白結(jié)合的分子基礎(chǔ)[14].

1.3 免疫抑制作用

癌細(xì)胞和免疫細(xì)胞(主要是T細(xì)胞,自然殺傷細(xì)胞和NK細(xì)胞)之間的代謝競爭是腫瘤進(jìn)展的基礎(chǔ),Warburg代謝為癌細(xì)胞的生長和增殖提供了優(yōu)勢,導(dǎo)致細(xì)胞外大量的葡萄糖被癌細(xì)胞攝取以及細(xì)胞外乳酸濃度升高,進(jìn)而導(dǎo)致腫瘤浸潤和T細(xì)胞功能失調(diào)[15].有研究表明細(xì)胞外乳酸鈉和乳酸分別抑制CD4+和CD8+殺傷性T細(xì)胞的浸潤和遷移.這種對(duì)T細(xì)胞運(yùn)動(dòng)的選擇性控制是通過特異性轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(Slc5a12和Slc16a1)介導(dǎo)的.乳酸鈉介導(dǎo)的CD4+殺傷性T細(xì)胞運(yùn)動(dòng)抑制是由于在趨化因子受體CXCR3與趨化因子CXCL10結(jié)合后對(duì)糖酵解的干擾所致.然而乳酸對(duì)CD8+殺傷性T細(xì)胞運(yùn)動(dòng)的卻不受糖酵解的控制,而是使其喪失細(xì)胞溶解功能,抑制了T細(xì)胞的腫瘤殺傷作用[16].另外,乳酸介導(dǎo)的酸中毒可以損害TCR(T細(xì)胞受體)觸發(fā)的JNK和c-Jun磷酸化,這兩條通路可以介導(dǎo)IFN-γ產(chǎn)生,進(jìn)而對(duì)T細(xì)胞的功能造成損傷[17].同時(shí),乳酸水平升高不僅直接抑制自然殺傷(NK)細(xì)胞的殺傷作用,而且通過增加髓系來源的抑制性細(xì)胞(MDSCs)的數(shù)量間接抑制NK細(xì)胞的功能[18].又如上文中提到乳酸抑制RLR對(duì)干擾素的誘導(dǎo)作用.Ⅰ型干擾素是細(xì)胞內(nèi)關(guān)鍵的抗菌因子,可限制感染因子(如病毒病原體)的傳播[14].乳酸介導(dǎo)的酸中毒也可通過降低過氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPARγ)的表達(dá)來抑制腫瘤浸潤恒定自然殺傷T(iNKT)細(xì)胞的脂質(zhì)生物合成和抗腫瘤活性[19].

1.4 組蛋白乳酸化調(diào)控基因的表達(dá)

組蛋白賴氨酸乳酸化可以視為一種新的表觀遺傳學(xué)修飾,2019年文獻(xiàn)[20]首次報(bào)道了乳酸可以驅(qū)動(dòng)組蛋白乳酸化并直接調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄,發(fā)揮非代謝功能.研究者使用2-脫氧-D-葡萄糖(2-DG),二氯乙酸鈉(DCA)和草酸鹽分別抑制葡萄糖激酶,丙酮酸脫氫酶(PDH)和乳酸脫氫酶(LDH)的活性進(jìn)而抑制乳酸的產(chǎn)生,3種藥物分別刺激均可以降低細(xì)胞組蛋白乳酸化水平.相反,魚藤酮是線粒體呼吸鏈復(fù)合物I的抑制劑,它增加了細(xì)胞內(nèi)乳酸含量和組蛋白乳酸化水平[20].在巨噬細(xì)胞向M1型極化的過程中,組蛋白乳酸化的增加與時(shí)間密切相關(guān),而M2巨噬細(xì)胞中不存在這一特征.在傷口愈合中,賴氨酸乳酸化增強(qiáng)的基因會(huì)出現(xiàn)明顯的富集現(xiàn)象.與此一致的是,在經(jīng)外源性乳酸處理的M1巨噬細(xì)胞中,可以觀察到Arg1啟動(dòng)子上的賴氨酸乳酸化富集和基因表達(dá)增加.在乳酸處理的巨噬細(xì)胞中,啟動(dòng)子近端區(qū)域的修復(fù)基因(如Arg1、血小板衍生生長因子(Pdgf)、血小板反應(yīng)蛋白1和Vegf)的組蛋白乳酸化顯著增加[21].我們的研究也提示在轉(zhuǎn)化生長因子TGF-β(TGF-β1)誘導(dǎo)的肺肌成纖維細(xì)胞的條件培養(yǎng)基中,以及在TGF-β1或博來霉素誘導(dǎo)的肺纖維化小鼠的肺泡灌洗液(BALFs)中,乳酸含量顯著增加,組蛋白乳糖化水平也顯著增加.

還有研究表明[22],使用乳酸和博來霉素誘導(dǎo)的肺纖維化小鼠的支氣管肺泡灌洗液處理巨噬細(xì)胞,可以增加促纖維化介質(zhì)的表達(dá),進(jìn)而使肺泡巨噬細(xì)胞表現(xiàn)為促纖維化表型.這表明纖維化肺中因糖酵解增強(qiáng)產(chǎn)生的乳酸在纖維化肺的肺泡巨噬細(xì)胞促纖維化活性的調(diào)節(jié)中起重要作用.同時(shí),作者發(fā)現(xiàn)纖維化肺的巨噬細(xì)胞中組蛋白乳酸化增加.進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn),乳酸誘導(dǎo)組蛋白乳酸化和促纖維化基因表達(dá)是由p300介導(dǎo)的,這可以從p300敲除巨噬細(xì)胞中乳酸誘導(dǎo)組蛋白乳酸化和促纖維化基因表達(dá)水平的降低得到證明.但是由于p300也是最重要的乙酰轉(zhuǎn)移酶之一,它還履行著無數(shù)其他的細(xì)胞功能[22],因此靶向p300可能會(huì)產(chǎn)生遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過組蛋白乳酸化所能引起的劇烈效應(yīng),從而帶來不必要的副作用.

2 MCT4的生物學(xué)功能

2.1 MCT4的結(jié)構(gòu)

人類的SLC16基因家族一共有14個(gè)成員,該家族也被稱為單羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(MCT)家族,因?yàn)榈谝粋€(gè)被確定的成員是負(fù)責(zé)與質(zhì)子偶聯(lián)的單羧酸代謝物(如丙酮酸、L-乳酸和酮體)轉(zhuǎn)運(yùn)的蛋白質(zhì).目前研究顯示所有的家族成員都有12個(gè)跨膜螺旋,胞內(nèi)的C端和N端以及6和7螺旋之間存在一個(gè)很大的胞內(nèi)環(huán). MCTs1-4錨定到質(zhì)膜的過程需要伴侶蛋白的協(xié)助,Basigin(也稱為CD-147,OX-47,EMMPRIN或HT7)是MCT1、MCT3和MCT4主要的伴侶蛋白,而Embigen(也稱為gp-70)主要負(fù)責(zé)MCT2的在質(zhì)膜上的錨定.Basigin和Embigin都有一個(gè)單次跨膜結(jié)構(gòu)域,該結(jié)構(gòu)域包含一個(gè)保守的谷氨酸殘基、一個(gè)短的胞內(nèi)C末端和一個(gè)較大的糖基化胞外結(jié)構(gòu)域.敲降這兩個(gè)伴侶蛋白之后,MCTs1-4會(huì)因滯留在高爾基體中而無法行使正常的運(yùn)輸單羧酸鹽的功能[23].

2.2 MCT4的功能

MCTs家族成員不僅可以同向協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)質(zhì)子和乳酸,還可以運(yùn)輸丙酮酸,酮體乙酰乙酸,D-β-羥基丁酸,短鏈脂肪酸丙酸和丁酸.雖然MCTs家族成員擁有共同的底物,但是它們對(duì)于同一底物的相對(duì)親和力是不同的.MCT2對(duì)單羧酸鹽的親和力最高,其次是MCT1,MCT3與MCT1的親和力相當(dāng),與其他MCT家族成員相比,MCT4對(duì)乳酸的親和力較低,這可能與MCT4主要分布在低乳酸水平組織中的生物學(xué)特性有關(guān).值得注意的是,MCT4對(duì)丙酮酸的親和力更低.這可能是為了確保丙酮酸可以滯留在胞質(zhì)內(nèi)用于NAD+的再生.

2015年BAENKE等[24]在乳腺癌疾病中發(fā)現(xiàn),MCT4是乳腺癌細(xì)胞存活的重要調(diào)節(jié)因子,它的存在可以維持乳腺癌細(xì)胞的pH穩(wěn)定、乳酸分泌和非氧化性葡萄糖代謝(或Crabtree-effect).此外,MCT4的缺失增加了癌細(xì)胞對(duì)線粒體呼吸和谷氨酰胺代謝的依賴性.且描述了高糖和IL-1β處理降低MCT4的表達(dá)及其在質(zhì)膜上的定位,MCT4表達(dá)的下調(diào)阻斷乳酸外流,導(dǎo)致人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)中乳酸積累和pH下降,從而觸發(fā)HUVECs細(xì)胞凋亡.

SPINA等[25]進(jìn)行的一項(xiàng)研究表明MCT4被敲降之后,膠質(zhì)瘤干細(xì)胞(Glioma Stem Cells,GSC)的存活率和自我更新能力降低,并且抑制了癌細(xì)胞的侵襲性和致瘤性.同時(shí),先前已有文獻(xiàn)證實(shí)MCT4在惡性膠質(zhì)瘤(glioblastoma,GBM)中高度過表達(dá),特別是在缺氧條件下.之后,進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)在MCT4敲降之后,幾種嘧啶核苷酸的水平顯著降低,DNA損傷增加.而核苷的補(bǔ)充在很大程度上阻斷了MCT4缺失的有害影響.所以,MCT4的敲降會(huì)抑制嘧啶的從頭合成,直接導(dǎo)致DNA損傷和細(xì)胞凋亡.

2.3 調(diào)控MCT4的信號(hào)通路

ZBTB7A基因編碼的短轉(zhuǎn)錄誘導(dǎo)物連接因子1(FBI-1)是一個(gè)轉(zhuǎn)錄相關(guān)的胞內(nèi)蛋白,又可以被稱為ZBTB7A,LRF,POKEMON,是POK轉(zhuǎn)錄抑制物家族成員之一.FBI-1可以調(diào)控ARF腫瘤抑制因子(p14ARF),細(xì)胞周期蛋白激酶抑制因子(Rb)和脂肪酸合成酶(FASN)的表達(dá),在細(xì)胞周期進(jìn)程、細(xì)胞分化、增殖、脂肪酸合成、免疫應(yīng)答和腫瘤發(fā)生等多種細(xì)胞過程中發(fā)揮重要作用.先前已有報(bào)道表明,SLC16A3基因的啟動(dòng)子區(qū)存在缺氧反應(yīng)元件(HREs),可以被HIF1-α識(shí)別并結(jié)合,刺激MCT4的表達(dá)[26].RelA也可以被稱為p65,是構(gòu)成NF-κB(Nuclear Factor-kappa B)轉(zhuǎn)錄因子家族的5種成分之一.其余的家族成員包括P50、P52、c-Rel 和 RelB. RelA的翻譯后修飾可以精確地調(diào)控NF-κB的轉(zhuǎn)錄激活,并在炎癥及炎癥相關(guān)疾病的發(fā)生和發(fā)展過程中發(fā)揮重要的作用.先前有研究闡明了缺氧可以激活NF-κB信號(hào)通路,增強(qiáng)RelA/p65與NF-κB靶基因啟動(dòng)子的結(jié)合[27].在正常條件下,FBI-1與SLC16A3啟動(dòng)子區(qū)域FRE(FBI-1響應(yīng)元件)和HRE結(jié)合,抑制MCT4的表達(dá).在缺氧時(shí),RelA/p65表達(dá)增加并與ZBTB7A基因啟動(dòng)子區(qū)域的NF-κB響應(yīng)元件結(jié)合,抑制ZBTB7A的轉(zhuǎn)錄,FBI-1的表達(dá)降低,以至于其無法與SLC16A3啟動(dòng)子區(qū)域的FRE和HRE結(jié)合,與此同時(shí),HIF-1α可以與SLC6A3啟動(dòng)子區(qū)域的HRE結(jié)合,進(jìn)而解除FBI-1對(duì)SLC16A3的轉(zhuǎn)錄的抑制,MCT4蛋白的表達(dá)增加,進(jìn)而造成胞外PH降低和乳酸濃度升高,給腫瘤存活創(chuàng)造了條件[28].

MicroRNAs(miRNAs)是一類由內(nèi)源基因編碼的長度約為20～25個(gè)核苷酸的非編碼單鏈RNA分子,通過與mRNA的3′-UTR結(jié)合,介導(dǎo)基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控,導(dǎo)致mRNA的降解或翻譯抑制.一項(xiàng)miRNA芯片研究表明,在飲食誘導(dǎo)的高血糖和肥胖小鼠中,miR-425-5p顯著上調(diào)[29].另一項(xiàng)miRNA微陣列分析顯示,miR-425-5p在人的胃腺癌中被IL-1β誘導(dǎo)后上調(diào),且有研究顯示miR-425-5P啟動(dòng)子區(qū)域有3個(gè)NF-κB的結(jié)合位點(diǎn)[30].在2020年一項(xiàng)研究[31]中,miR-425-5p被PicTar,TargetScan 和miRcode 3個(gè)計(jì)算機(jī)程序預(yù)測在MCT4 mRNA的3′-UTR中存在潛在的結(jié)合位點(diǎn),并通過熒光素酶報(bào)告基因技術(shù)進(jìn)行驗(yàn)證.該研究闡述了在糖尿病中,NF-κB信號(hào)被激活,從而誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞中miR-425-5p的表達(dá).miR-425-5p是MCT4表達(dá)的負(fù)調(diào)控因子,通過與MCT4 mRNA的3′-UTR區(qū)域結(jié)合,下調(diào)MCT4的表達(dá),阻斷乳酸的外排,導(dǎo)致胞內(nèi)乳酸的積累和pH值下降,從而觸發(fā)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡,最終導(dǎo)致內(nèi)皮功能障礙[31].

DNA甲基化是一種廣泛研究的表觀遺傳學(xué)修飾策略,與組蛋白修飾等方式一起,在調(diào)控基因表達(dá)和染色質(zhì)構(gòu)象等方面發(fā)揮了重要作用[32].它是由DNA甲基轉(zhuǎn)移酶催化S-腺苷甲硫氨酸作為甲基供體,將DNA的CG兩個(gè)核苷酸的胞嘧啶被選擇性地添加甲基,主要形成5-甲基胞嘧啶(5-mC)(常見于基因的5′-CG-3′序列)和少量的N6-甲基嘌呤(N6-mA)及7-甲基鳥嘌呤(7-mG)[33].有研究表明透明細(xì)胞腎細(xì)胞癌(clear cell Renal Cell Carcinoma ,ccRCC,)中MCT4的蛋白mRNA水平明顯升高.之后,研究人員通過MALDI-TOF 質(zhì)譜技術(shù)評(píng)估了SLC16A3啟動(dòng)子區(qū)域的甲基化水平.結(jié)果表明,與癌旁組織相比,腎透明細(xì)胞癌中SLC16A3啟動(dòng)子特定區(qū)域的DNA甲基化水平顯著降低.為了進(jìn)一步確定DNA甲基化對(duì)SLC16A3啟動(dòng)子活性的影響,研究者使用含有甲基化或模擬甲基化SLC16A3啟動(dòng)子片段的不同啟動(dòng)子/報(bào)告基因融合質(zhì)粒進(jìn)行報(bào)告基因以及啟動(dòng)子的活性檢測.通過報(bào)告基因檢測結(jié)果表明,DNA甲基化對(duì)SLC16A3啟動(dòng)子的活性存在影響,含有模擬甲基化SLC16A3啟動(dòng)子片段的報(bào)告基因構(gòu)建的質(zhì)粒比含有甲基化SLC16A3啟動(dòng)子構(gòu)建的質(zhì)粒表現(xiàn)出明顯的啟動(dòng)子活性.即MCT4受SLC16A3啟動(dòng)子甲基化的調(diào)控[34].

腫瘤相關(guān)抗原CD147作為MCTs的伴侶分子參與腫瘤代謝轉(zhuǎn)化.在酸性腫瘤微環(huán)境中,CD147和MCT4之間的相互作用對(duì)乳酸的轉(zhuǎn)運(yùn)至關(guān)重要.同時(shí)也為腫瘤細(xì)胞的侵襲和增殖提供了優(yōu)勢[35].蛋白質(zhì)的甲基化是指將甲基通過特定的甲基轉(zhuǎn)移酶連接到蛋白質(zhì)的某個(gè)殘基上,通常是賴氨酸或精氨酸、組氨酸、半胱氨酸和天冬酰胺等.賴氨酸甲基化不會(huì)明顯改變蛋白質(zhì)的分子量,但會(huì)顯著改變賴氨酸側(cè)鏈的氫鍵結(jié)合能力和水合作用,從而影響蛋白質(zhì)之間的相互作用[36].在2021年的一篇報(bào)道中,WANG等[37]通過液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測16個(gè)非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)組織中CD147二甲基化,發(fā)現(xiàn)CD147蛋白在13個(gè)賴氨酸位點(diǎn)上有新的二甲基化修飾,其中9個(gè)位于CD147胞外結(jié)構(gòu)域(ECD)(賴氨酸殘基位點(diǎn)63、71、75、108、111、127、141、148、191),4個(gè)位于CD147胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域(ICD)(賴氨酸殘基位點(diǎn)234、250、259、261).CD147被賴氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶5A(KMT5A)二甲基化為CD147-K234me2.研究發(fā)現(xiàn)KMT5A過表達(dá)可以上調(diào)CD147-k234me2水平,進(jìn)一步促進(jìn)CD147與MCT4相互作用,促進(jìn)MCT4從胞質(zhì)轉(zhuǎn)位至質(zhì)膜,從而增強(qiáng)了NSCLC細(xì)胞的糖酵解和乳酸輸出.

MCT4的降解是依賴于泛素化介導(dǎo)的蛋白酶體降解途徑, CHOU等[38]表明NUMB4可以與結(jié)合MCT4和MCT1結(jié)合,進(jìn)而促進(jìn)MCT4和MCT1的泛素化.NUMB是一種銜接蛋白,在調(diào)節(jié)細(xì)胞功能方面發(fā)揮多方面的作用,包括神經(jīng)發(fā)生、干細(xì)胞自我更新過程中的對(duì)稱細(xì)胞分裂、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化和腫瘤發(fā)生等[39-40].MUMB通過與泛素連接酶Itch結(jié)合分解Notch或Gli[41-42].miR-31可以靶向NUMB進(jìn)而增強(qiáng)結(jié)直腸癌和頭頸部鱗狀細(xì)胞癌的致瘤性[43-44].該研究表明miR-31-NUMB-MCT1/MCT4信號(hào)軸在介導(dǎo)腫瘤發(fā)生和代謝轉(zhuǎn)換中發(fā)揮重要作用,中斷這一級(jí)聯(lián)反應(yīng)的可能會(huì)阻斷口腔癌的發(fā)展.

HU等[45]使用PhosphoSitePlus分析顯示MCT4 C端區(qū)域的不同Lys殘基是潛在的泛素化修飾位點(diǎn).且已有研究通過質(zhì)譜分析顯示C-端賴氨酸殘基(K448,K415,K428,K431和K453)是MCT4的泛素化位點(diǎn).E3泛素連接酶β-TRCP和FBW7分別在DSG-box和TPETS序列上與MCT4相互作用.然而MCT4的K448可以被E2結(jié)合酶UBC9進(jìn)行SUMO(Small Ubiquitin-like Modifiers)化修飾,抑制了其降解,穩(wěn)定了MCT4蛋白水平.SUMO化修飾是一個(gè)動(dòng)態(tài)、可逆的過程,參與DNA修復(fù)、膜蛋白定位和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等過程.與泛素化相似,SUMO化修飾的是賴氨酸殘基,SUMO化和泛素化位點(diǎn)在蛋白質(zhì)底物中的重疊率為24%～32%[46].因此SUMO化通常與泛素化競爭性結(jié)合賴氨酸殘基,從而抑制其泛素介導(dǎo)的蛋白酶體降解.

上文中已提及MCTs家族成員可以轉(zhuǎn)運(yùn)短鏈脂肪酸,丁酸作為短鏈脂肪酸的一種,是結(jié)腸上皮細(xì)胞細(xì)胞主要能量來源.阿魏酸在結(jié)腸中通過微生物水解產(chǎn)生,谷物中富含酚類化合物,其中阿魏酸是最豐富的酚類化合物之一[47].據(jù)報(bào)道[48],許多酚酸類物質(zhì)可作為抗炎劑并可以降低2型糖尿病的風(fēng)險(xiǎn).適量濃度的丁酸(1 000 mmol/L)處理Caco-2細(xì)胞能夠增加MCT1和MCT4蛋白和mRNA豐度,從而加快了阿魏酸進(jìn)入結(jié)腸細(xì)胞的吸收和基底外側(cè)的運(yùn)輸.MCT抑制劑根皮素的使用可以逆轉(zhuǎn)丁酸處理Caco2細(xì)胞導(dǎo)致的阿魏酸在攝取方面轉(zhuǎn)運(yùn)的增加,證明了MCT1參與阿魏酸的轉(zhuǎn)運(yùn).然而在沒有MCT1的情況下,阿魏酸的轉(zhuǎn)運(yùn)也會(huì)增加,表明有其他的MCT家族成員參與了阿魏酸的轉(zhuǎn)運(yùn).MCT4在結(jié)腸和Caco-2細(xì)胞中也高表達(dá),可被毛皮素抑制,且Caco-2細(xì)胞的免疫熒光染色顯示MCT4僅存在于基底外側(cè)質(zhì)膜,而MCT1在膜上的分布較為均勻.因此MCT1可能是阿魏酸攝取的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白,MCT4可能是阿魏酸在基底膜外側(cè)的外排蛋白.

2.4 MCT4抑制劑的研究進(jìn)展

針對(duì)MCTs家族的抑制劑能夠阻斷乳酸在細(xì)胞與細(xì)胞間以及細(xì)胞與微環(huán)境之間的傳輸,這為癌癥和纖維化等疾病的治療提供了新的思路.然而,過去研究的藥物多是非特異性的,或是MCT1的靶向抑制劑,例如,40-二異硫氰基-2,20-二苯二磺酸(DIDS)不可逆地與MCT1和MCT2上的賴氨酸殘基結(jié)合,從而使轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白失活,但并不抑制MCT4的活性[49].對(duì)氯苯磺酸(pCMBS)等有機(jī)汞化合物會(huì)破壞MCT-CD147的相互作用,從而對(duì)MCT1,MCT3和MCT4的表達(dá)和活性造成干擾.AZD3965對(duì)MCT1和MCT2均有抑制作用,但AZD3965對(duì)MCT1的抑制作用是對(duì)MCT2的6倍.AR-C155858直接與MCT1的TM7-10結(jié)合,但不與MCT2結(jié)合,除非MCT2與CD147相互作用引起構(gòu)象變化,由于MCT2優(yōu)先與gp70相互作用,因此ARC155858可以被合理地認(rèn)為是特異性MCT1抑制劑.

現(xiàn)階段一些針對(duì)MCT4的藥物也逐漸問世.Syrosingopine(Su 3118)是一種可以抑制MCT1和MCT4的雙重抑制劑.利用DARTS(Drug Affinity Responsive Target Stability)技術(shù)探究研究Syrosingopine類藥物與MCTs之間是否存在可能的結(jié)合.人結(jié)直腸癌HCT116細(xì)胞膜提取物被熱溶素限制性蛋白水解酶消化前使用抑制劑處理,結(jié)果顯示syrosingopine及其衍生物F3-syro處理HCT116細(xì)胞能夠保護(hù)MCT1和MCT4的部分肽段免受蛋白水解酶的切割.另外,作者也觀察到ARC155858對(duì)MCT1的肽段具有與Syrosingopine和F3-syro類似的作用.為了進(jìn)一步探索Syrosingopine如何通過破壞活性CD147-MCT復(fù)合物來抑制MCT1和MCT4的活性.CD147的免疫沉淀顯示,經(jīng)Syrosingopine處理后,MCT1或MCT4與CD147的關(guān)聯(lián)沒有改變.長時(shí)間的Syrosingopine處理也未導(dǎo)致CD147或MCT水平的變化.所以,Syrosingopine不是通過影響復(fù)合物的形成或穩(wěn)定性間接抑制MCT1和MCT4功能,而是可以直接抑制MCT1和MCT4的功能.VB124是由CLUNTUN等[50]研發(fā)的一種特異性的MCT4抑制劑,它對(duì)MCT4的選擇性高于MCT1,顯示出很少的MCT1抑制活性.且使用30 mg/kg的VB124,每天2次,對(duì)小鼠進(jìn)行為期180 d的處理,對(duì)鼠的身體、心臟、肝臟或肺的質(zhì)量無影響,說明沒有明顯的毒性.研究表明VB124的使用可以阻止肥厚心肌細(xì)胞的乳酸外排,并將糖酵解碳通量導(dǎo)向線粒體丙酮酸氧化,并可能逆轉(zhuǎn)肥厚表型.同樣,表明MCT4在肝癌組織中高表達(dá),與患者不良預(yù)后相關(guān).利用VB124抑制MCT4的表達(dá),通過增強(qiáng)CD8+殺傷性T細(xì)胞浸潤和細(xì)胞毒性,抑制了小鼠肝癌腫瘤生長.

3 結(jié)論與展望

近年來,乳酸及其相關(guān)單羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的研究取得了許多實(shí)質(zhì)性進(jìn)展,關(guān)于乳酸和MCT4在多項(xiàng)疾病發(fā)展過程中的作用也得以闡明.乳酸營造的酸性腫瘤微環(huán)境一方面有助于腫瘤細(xì)胞的侵襲、遷移、血管生成以及免疫逃逸;另一方面,MCT4作為關(guān)鍵乳酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白,為腫瘤細(xì)胞的代謝轉(zhuǎn)變和惡性腫瘤的發(fā)生提供了條件.然而,現(xiàn)有乳酸及MCT4的研究成果并不能完全闡明乳酸與癌癥的關(guān)系,仍有許多亟待解決的問題需要探索.

由Warburg effect產(chǎn)生的乳酸被分泌的細(xì)胞外后,能夠作為一種能源物質(zhì),通過氧化磷酸化供給ATP;乳酸同時(shí)又承擔(dān)著信號(hào)分子的功能,通過特異性的受體實(shí)現(xiàn)細(xì)胞間信號(hào)傳遞.常見的識(shí)別乳酸的受體有GPR81,GPR132等.在免疫抑制方面,乳酸也起著至關(guān)重要的作用.例如乳酸可以抑制T細(xì)胞,NK細(xì)胞等多種免疫細(xì)胞的功能.乳?；墙┠晷绿岢龅母拍詈托屡d的熱點(diǎn)話題,它屬于表觀遺傳學(xué)修飾的一種,組蛋白發(fā)生乙?；揎椊閷?dǎo)基因的表達(dá)調(diào)控.而非組蛋白的乙?；揎梽t影響正常蛋白的轉(zhuǎn)位及活性的維持[51].目前,靶向乳酸代謝途徑已逐漸成了癌癥治療的一門新的策略.除了單羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白之外,將丙酮酸還原成乳酸的乳酸脫氫酶A(LDH-A)也是一個(gè)有前途的研究靶點(diǎn).癌細(xì)胞會(huì)在上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)過程中將其上皮表型轉(zhuǎn)變?yōu)殚g充質(zhì)表型.既往對(duì)腎癌細(xì)胞的研究表明,LDH-A水平升高通過促進(jìn)EMT導(dǎo)致腫瘤轉(zhuǎn)移,而這一過程又被LDH-A草氨酸鹽抑制劑阻斷[52].乳酸通過TGF-β2依賴的基質(zhì)金屬蛋白酶-2促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的遷移,而這一現(xiàn)象被LDH-A的小干擾RNA抑制.LDH-A抑制劑除了直接的抗腫瘤作用外,還可以減少炎癥誘導(dǎo)的作用.雖然LDH-A抑制劑尚未進(jìn)入臨床,但幾種抑制劑在動(dòng)物模型中顯示出很有前景的抗癌活性,而抑制LDH-A也提高了傳統(tǒng)化療藥物的療效[53].

由基因SLC16A3編碼的跨膜蛋白MCT4,在糖酵解代謝活躍的組織中發(fā)揮H+/乳酸輸出的作用.MCT4/SLC16A3已被證明在許多惡性腫瘤中心的缺氧區(qū)域過度表達(dá)[54].本文簡要介紹了MCT4及其相關(guān)蛋白的結(jié)構(gòu)和功能.作為乳酸的轉(zhuǎn)運(yùn)體,MCT4在疾病中造成的不良反應(yīng)多數(shù)情況也與乳酸息息相關(guān),通過調(diào)控MCT4的上游[31,55]或者使用MCT4的抑制劑[50]處理,逆轉(zhuǎn)MCT4在疾病中的高表達(dá),進(jìn)而緩解多種相關(guān)疾病的進(jìn)展.針對(duì)MCT4的調(diào)控,已有多篇文章進(jìn)行了報(bào)道,如,在轉(zhuǎn)錄水平上,MCT4的啟動(dòng)子上存在HIF-1α和FBI-1的結(jié)合位點(diǎn),而病理?xiàng)l件下,FBI-1表達(dá)減少,而HIF-1α被誘導(dǎo)表達(dá),并于與MCT4的啟動(dòng)子結(jié)合增加;同時(shí)啟動(dòng)子區(qū)域DNA的甲基化也會(huì)影響MCT4的表達(dá);在MCT4的翻譯階段,miR-425-5p與MCT4的mRNA結(jié)合,進(jìn)而使MCT的翻譯收到抑制;在蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)的過程,MCT4的伴侶蛋白CD147在MCT4正確轉(zhuǎn)運(yùn)過程中起著必不可少的作用;MCT4的降解依賴于蛋白酶體的介導(dǎo)的泛素化途徑,這一過程可以被SUMO化修飾抑制.對(duì)于MCT4的特異性抑制劑的研究直到最近幾年才有少量文章進(jìn)行報(bào)道.VB124是2021年研制出來的針對(duì)MCT4的特異性抑制劑,然而該抑制劑的臨床效果以及是否存在不良預(yù)后結(jié)果仍未闡明.雖然現(xiàn)階段已經(jīng)在多種疾病模型中對(duì)MCT4進(jìn)行了深入探究,但是與臨床相關(guān)的研究卻鮮有報(bào)道.因此,迫切需要系統(tǒng)性地研究MCT4相關(guān)的信號(hào)通路以及抑制劑的臨床數(shù)據(jù),以便為揭示MCT4在人類疾病的重要作用提供理論基礎(chǔ).