黃慧思，韓 超，石艷紅，齊春麗，熊愛華，張秋玲，梁慧玲

（1.廣州醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院，廣東 廣州 510000；2.暨南大學(xué)，廣東 廣州 510000）

咳嗽變異性哮喘（cough variant asthma，CVA）又名隱匿型哮喘，即以慢性干咳為惟一或重要癥狀的一種特定類別哮喘，為典型哮喘的前期狀態(tài)［1-3］。目前西醫(yī)上治療CVA 主要包括吸入型糖皮質(zhì)激素、支氣管擴張劑和白三烯受體拮抗劑等［4］，但多數(shù)患者對長期服用糖皮質(zhì)激素類藥物感到有負擔，且控制水平不理想，仍有部分患者進展為典型哮喘［5］。本院制造的翹芩清肺劑是根據(jù)臨床應(yīng)用多年的驗方改良的中藥濃縮袋泡茶，通過二十余年臨床應(yīng)用發(fā)現(xiàn)，其在防治急慢性支氣管炎、哮喘方面具有良好療效。目前研究發(fā)現(xiàn)，氣道神經(jīng)源性炎癥與CVA的發(fā)生發(fā)展聯(lián)系密切，據(jù)此，本實驗擬通過卵清白蛋白（OVA）誘致大鼠CVA 模型，以觀察翹芩清肺劑在CVA 中的防治作用，并初步探討其作用機制以及與氣道神經(jīng)源性炎癥的關(guān)聯(lián)，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 動物

SPF 級SD 大鼠共48 只，雌雄各半，平均體重約（150～180）g，自北京華阜康生物科技股份有限公司購入，合格證號：SCXK（京）2019-0008。于暨南大學(xué)實驗動物管理中心進行飼養(yǎng)，實驗單位使用許可證號：SYXK（粵）2017-0174。實驗室相對濕度為40%～70%、溫度（22±2）℃，明暗周期均為12 h。本實驗通過暨南大學(xué)實驗動物福利倫理委員會批準，批準編號：IACUC-20210824-08。

1.2 藥物及試劑

卵清白蛋白（美國sigma，Lot#SLCH2414）；氫氧化鋁（天津市大茂化學(xué)試劑廠，批號：20210104）；氯化鈉注射液（辰欣藥業(yè)股份有限公司，產(chǎn)品批號：2106250721）；孟魯司特鈉咀嚼片（石家莊石藥集團歐意藥業(yè)有限公司，國藥準字H20203047）；翹芩清肺劑（下簡稱翹芩，廣州醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院的制劑室供給，2.5 kg 生藥量/L）；大鼠神經(jīng)生長因子ELISA 試劑盒（博士德，產(chǎn)品編號：EK0471）；大鼠P物質(zhì) ELISA 試劑盒（華美，產(chǎn)品編號：CSB-E08358r）；兔抗 NGF Polyclonal Antibody（SAB 生物技術(shù)有限公司，產(chǎn)品編號：41239）；兔抗SP1 Antibody（SAB 生物技術(shù)有限公司，產(chǎn)品編號：37251）；SABC 免疫組化試劑盒（博士德，產(chǎn)品編號：SA1020）；DAB 試劑盒（博士德，商品編號：AR1027）。

1.3 主要儀器

海爾壓縮式醫(yī)用霧化器（皖械注準20192080049，型號：YS-06），分析天平（廣東華運儀生物工程有限公司，型號：BSA2202S），微樣全自動五分類動物血液分析儀（美國DREW Scientific，型號：HEMAVET 950FS），酶標儀（上海賽默飛世爾儀器有限公司，型號：Multiskan Mk3）。

1.4 模型建立

根據(jù)文獻報道及既往研究工作基礎(chǔ)建立動物模型［6-9］，SD 大鼠于安靜、干燥、通風的環(huán)境中適應(yīng)性飼養(yǎng)10 d 后，再采用OVA 聯(lián)合氫氧化鋁［Al（OH）3］致敏并多次反復(fù)激發(fā)的方法建立大鼠CVA模型。（1）致敏階段：各干預(yù)組和模型組大鼠在實驗開始時第1 天、第3 天、第5 天、第7 天及第11 天腹腔注射+皮下注射給予10%卵清白蛋白、氫氧化鋁混懸液1 mL（腹腔注射0.5 mL，余下0.5 mL 背部皮下多點注射），空白組給予等量的生理鹽水進行腹腔注射。（2）激發(fā)階段：第15 天將各干預(yù)組和模型組大鼠放置于有機的封閉玻璃箱內(nèi)超聲霧化來誘發(fā)哮喘，霧化濃度為1% OVA 溶液，時間30 min，每日1次哮喘激發(fā)，連續(xù)2 周。空白組大鼠霧化等量、等時間的生理鹽水。以模型組大鼠出現(xiàn)腹肌收縮、呼吸急促、咳嗽等情況并且血液中嗜酸性粒細胞百分比顯著高于空白組，從而確定模型成功（P＜0.05）。

1.5 分組、給藥及取材

將48 只SD 大鼠隨機分為6 組：空白組、模型組、孟魯司特鈉組和翹芩高、中、低劑量組，每組8只。從致敏第2 天開始，翹芩高、中、低劑量組分別予翹芩清肺劑26、13、6.5 g/kg 灌胃，孟魯司特鈉組給予孟魯司特鈉混懸液1.05 mg/kg 灌胃，空白組和模型組灌胃給予等體積蒸餾水，每日1 次，持續(xù)干預(yù)28 d。動物連續(xù)處理4 周后，安樂死前12 h 禁食、不禁水，次晨再次予相應(yīng)的受試物干預(yù)40 min 后，稱取大鼠體重，予戊巴比妥鈉45 mg/kg 腹腔注射進行麻醉，將其仰臥固定在手術(shù)臺，腹主動脈取1 mL 血置于EDTA 抗凝管內(nèi)，用于血液分析檢測；暴露胸腔，每只大鼠行左肺支氣管肺泡灌洗術(shù)，取生理鹽水3 mL 注入氣管內(nèi)，并反復(fù)抽吸，提取出肺泡灌洗液（BALF），于4 ℃、4 000 r/min 下離心10 min，再取上清液，-80 ℃保存待測；迅速剝離右肺，取右肺組織，置于10% 甲醛溶液中固定，供蘇木精-伊紅（HE）染色和免疫組化檢測應(yīng)用。

1.6 HE 染色法觀察肺組織的病理改變

取用10%甲醛溶液固定后的大鼠右肺上葉組織，經(jīng)脫水、透明、石蠟包埋、切片后，進行HE 染色。于光學(xué)顯微鏡下觀察各組大鼠肺組織的病理學(xué)變化。

1.7 ELISA 法測定肺泡灌洗液的NGF、SP 含量

采用雙抗體夾心ABC-ELISA 法，根據(jù)NGF、SP 試劑盒的說明方法予以檢測。反應(yīng)終止后，在450 nm 波長處用酶標儀依次測定各孔的光密度（OD 值），以標準品的濃度及對應(yīng)的OD 值，并繪制標準曲線圖，再根據(jù)樣品OD 值于該曲線圖上計算相應(yīng)的大鼠NGF、SP 的含量。

1.8 免疫組織化學(xué)法檢測肺組織中NGF、SP 的蛋白表達水平

取大鼠右肺中葉組織切片，并脫蠟至水后，經(jīng)過抗原修復(fù)、封閉，于37 ℃下孵育一抗1 h；孵育二抗30 min，經(jīng)DAB 顯色、蘇木素復(fù)染和脫水封片后，在光學(xué)顯微鏡下觀察、照相，棕黃色為陽性染色。每張片子中選取5 個區(qū)域拍攝，并采用Image-Pro Plus v6.0 病理圖象分析，從而測定各組中免疫陽性產(chǎn)物的光密度OD 值，再取平均數(shù)，得出該動物的肺組織中NGF、SP 蛋白表達水平。

1.9 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 26.0 統(tǒng)計軟件來分析數(shù)據(jù)；連續(xù)型資料以均數(shù)±標準差（±s）表示；服從正態(tài)分布的用t檢驗，不服從正態(tài)分布的用Mann-WhitneyU檢驗；P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 翹芩清肺劑對咳嗽變異性哮喘模型大鼠血液嗜酸性粒細胞數(shù)量及百分比的影響

與空白組比較，模型組大鼠血液嗜酸性粒細胞數(shù)量及百分比增加，差異有顯著性（P＜0.01）。與模型組比較，孟魯斯特鈉明顯降低大鼠血液嗜酸性粒細胞數(shù)量及百分比（P＜0.05），翹芩清肺劑中、低劑量組亦可降低嗜酸性粒細胞數(shù)量及百分比，可見明顯統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05）。綜上，以模型組大鼠出現(xiàn)腹肌收縮、呼吸急促、咳嗽等情況并且血液中嗜酸性粒細胞百分比顯著高于空白組，從而確定模型成功（P＜0.05）。見表1。

表1 翹芩清肺劑對咳嗽變異性哮喘大鼠血液嗜酸性粒細胞數(shù)量及百分比的影響（±s，n=8）Tab 1 Effects of Qiaoqin Qingfei agent on the number and percentage of blood eosinophils in cough variant asthma model rats （±s，n=8）

表1 翹芩清肺劑對咳嗽變異性哮喘大鼠血液嗜酸性粒細胞數(shù)量及百分比的影響（±s，n=8）Tab 1 Effects of Qiaoqin Qingfei agent on the number and percentage of blood eosinophils in cough variant asthma model rats （±s，n=8）

注：與空白組比較：#P＜0.05，##P＜0.01；與模型組比較：*P＜0.05，**P＜0.01。

嗜酸性粒細胞百分比/(%)組別劑量/(g/kg)嗜酸性粒細胞數(shù)量/(×109/L)0.35±0.19**0.98±0.40##0.58±0.15#*0.72±0.34#0.46±0.09**0.57±0.26*5.559 0.001空白組模型組孟魯司特鈉組翹芩高劑量組翹芩中劑量組翹芩低劑量組--1.05 mg/kg 26.0 13.0 6.5 FP 0.02±0.01**0.06±0.03##0.04±0.01##*0.05±0.03##0.03±0.01#**0.03±0.01**6.908 0.000

2.2 翹芩清肺劑對咳嗽變異性哮喘大鼠肺組織病理變化的影響

空白組大鼠肺氣管上皮細胞整齊排列有規(guī)則，管腔內(nèi)見少量上皮細胞脫落，氣管壁未見浸潤的炎癥細胞，肺泡未見擴張，肺泡中未見上皮細胞和炎癥細胞壞死脫落，肺血管未見充血，管壁未見明顯的炎癥細胞浸潤，肺泡壁未見增厚。與空白組比較，模型組大鼠的肺血管壁周圍出現(xiàn)大量炎癥細胞浸潤，血管壁結(jié)構(gòu)疏松，水腫明顯，肺泡壁有些增厚，肺泡壁中出現(xiàn)炎癥細胞浸潤，肺氣管中可見上皮細胞壞死脫落。各藥物干預(yù)組，其中，孟魯司特鈉組大鼠肺氣管有些壞死脫落的上皮細胞，氣管壁中出現(xiàn)少量炎癥細胞浸潤，肺泡壁輕微增厚，泡壁中可見少許炎癥細胞浸潤，但肺泡未見明顯擴張，血管有些輕微的充血；翹芩清肺劑組大鼠肺組織病理學(xué)改變均有不同程度的減輕，上皮細胞壞死脫落減少，氣管壁周圍炎癥細胞浸潤明顯減輕，未見肺泡壁明顯增厚，也未見肺泡擴張，其中又以翹芩高劑量組的改善程度最顯著，翹芩中、低劑量組次之。見圖1、2。

圖1 翹芩清肺劑對咳嗽變異性哮喘大鼠肺組織病理變化的影響（HE 染色，×100）Fig 1 Effects of Qiaoqin Qingfei agent on pathological changes of lung tissue in cough variant asthma model rats（HE staining，×100）

圖2 翹芩清肺劑對咳嗽變異性哮喘大鼠肺組織病理變化的影響（HE 染色，×400）Fig 2 Effects of Qiaoqin Qingfei agent on pathological changes of lung tissue in cough variant asthma model rats（HE staining，×400）

2.3 翹芩清肺劑對咳嗽變異性哮喘大鼠肺泡灌洗液中NGF、SP 含量的影響

與空白組比較，模型組大鼠中肺泡灌洗液的NGF、SP 含量均升高，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；與模型組比較，翹芩清肺劑高、中、低劑量組和孟魯司特鈉組肺泡灌洗液中的NGF、SP 含量均顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表2。

表2 翹芩清肺劑對咳嗽變異性哮喘大鼠肺泡灌洗液中NGF、SP 含量的影響（±s，n=8）Tab 2 Effects of Qiaoqin Qingfei agent on the contents of NGF and SP in alveolar lavage solution of cough variant asthma rats（±s，n=8)

表2 翹芩清肺劑對咳嗽變異性哮喘大鼠肺泡灌洗液中NGF、SP 含量的影響（±s，n=8）Tab 2 Effects of Qiaoqin Qingfei agent on the contents of NGF and SP in alveolar lavage solution of cough variant asthma rats（±s，n=8)

注：與空白組比較：#P＜0.05，##P＜0.01；與模型組比較：*P＜0.05，**P＜0.01。

SP/(pg/mL)18.76±14.07 35.64±29.63 8.41±5.48*8.23±4.05*9.08±6.48*9.40±9.87*4.535 0.002組別空白組模型組孟魯司特鈉組翹芩高劑量組翹芩中劑量組翹芩低劑量組劑量/(g/kg)--1.05 mg/kg 26.0 13.0 6.5 FP NGF/(pg/mL)7.27±3.92 10.47±6.03 2.99±1.12#*2.69±0.65#**3.10±1.18#*3.21±1.21#*8.746 0.000

2.4 翹芩清肺劑對咳嗽變異性哮喘大鼠肺組織中NGF、SP 蛋白表達的影響

與空白組相比，模型組大鼠的肺組織中NGF、SP 的蛋白表達水平升高明顯，差異具有顯著性（P＜0.01）；與模型組相比，翹芩清肺劑高、中、低劑量組和孟魯司特鈉組肺組織中NGF、SP 的蛋白表達水平顯著降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。見圖3、4 及表3。

圖3 翹芩清肺劑對咳嗽變異性哮喘大鼠肺組織中NGF 蛋白表達的影響（免疫組化，×400）Fig 3 Effects of Qiaoqin Qingfei agent on the expression of NGF protein in lung tissue in cough variant asthma model rats（IHC，×400）

圖4 翹芩清肺劑對咳嗽變異性哮喘大鼠肺組織中SP 蛋白表達的影響（免疫組化，×400）Fig 4 Effects of Qiaoqin Qingfei agent on the expression of SP protein in lung tissue in cough variant asthma model rats（IHC，×400）

表3 翹芩清肺劑對咳嗽變異性哮喘大鼠肺組織中NGF、SP 蛋白表達的影響（±s，n=8）Tab 3 Effects of Qiaoqin Qingfei agent on the expression of NGF and SP protein in lung tissue in cough variant asthma model rats （±s，n=8）

表3 翹芩清肺劑對咳嗽變異性哮喘大鼠肺組織中NGF、SP 蛋白表達的影響（±s，n=8）Tab 3 Effects of Qiaoqin Qingfei agent on the expression of NGF and SP protein in lung tissue in cough variant asthma model rats （±s，n=8）

注：與空白組比較：#P＜0.05，##P＜0.01；與模型組比較：*P＜0.05，**P＜0.01。

SP/(OD 值)0.228±0.006**0.292±0.016##0.248±0.004##**0.244±0.005##**0.261±0.007##**0.273±0.006##**61.123 0.000組別空白組模型組孟魯司特鈉組翹芩高劑量組翹芩中劑量組翹芩低劑量組劑量/(g/kg)--1.05 mg/kg 26.00 13.00 6.50 FP NGF/(OD 值)0.219±0.007**0.290±0.008##0.250±0.005##**0.235±0.004##**0.253±0.006##**0.271±0.006##**136.759 0.000

3 討論

CVA 的發(fā)病機制復(fù)雜，是由免疫、環(huán)境、遺傳等諸多因素聯(lián)合影響的結(jié)果，包括氣道慢性炎癥、氣道高反應(yīng)性、氣道重塑及遺傳因素是其最主要的發(fā)病機理。近年，人們逐漸重視由感覺性神經(jīng)末梢所分泌的神經(jīng)肽調(diào)節(jié)引起的氣道神經(jīng)源性炎癥［10］。由感覺性神經(jīng)末梢分泌的速激肽而產(chǎn)生的各種生理學(xué)改變?nèi)缥⒀芡ㄍ感蕴岣?、黏液分泌增多、氣道平滑肌收縮、咳嗽和促進白細胞黏附等效應(yīng)被稱之為“氣道神經(jīng)源性炎癥”。目前，相關(guān)研究表明，神經(jīng)源性炎癥可能是CVA 的一個重要發(fā)病機制，而氣道神經(jīng)源性炎癥的出現(xiàn)也是咳嗽敏感性升高、干咳纏綿難愈的重要原因［11］。

NGF 是調(diào)控神經(jīng)源性炎癥的關(guān)鍵細胞因子，可通過神經(jīng)和免疫系統(tǒng)而放大氣道炎癥，在氣道神經(jīng)源性炎癥中起到重要影響［12］。有研究表明其可能參與了哮喘的氣道平滑肌收縮和神經(jīng)源性炎癥等多種病理反應(yīng)，并與氣道炎癥的形成、發(fā)展密切相關(guān)，從而在哮喘氣道慢性炎癥、氣道高反應(yīng)性以及氣道重塑等過程中承擔著重要的調(diào)控作用［13-15］。國外研究顯示，NGF 可促進速激肽在神經(jīng)細胞中的分泌，使速激肽受體的表達上調(diào)，誘發(fā)神經(jīng)源性炎癥而參與哮喘的發(fā)病機理［16］。

SP 為速激肽類神經(jīng)介質(zhì)中的一類，是非腎上腺素能非膽堿能神經(jīng)系統(tǒng)釋放的一種感覺神經(jīng)肽，在氣道炎癥中可被誘導(dǎo)表達，并對神經(jīng)源性炎癥具有重要的調(diào)節(jié)作用［17］。SP 在支氣管壁和肺泡壁中廣泛存在，與黏液分泌增多、支氣管平滑肌收縮等密切相關(guān)，可使血管通透性升高、血漿滲出、引發(fā)組織水腫等病理變化，于CVA 中體現(xiàn)為氣道神經(jīng)源性炎癥［18-21］。SP 具有強大的致炎作用，可通過誘導(dǎo)炎癥細胞浸潤從而參與氣道高反應(yīng)性和氣道炎癥的形成［22］，增強血管的通透性，導(dǎo)致炎性滲出，趨化中性粒細胞、單核-巨噬細胞，從而加重氣道炎癥反應(yīng)，形成惡性循環(huán)［23-25］。

祖國醫(yī)學(xué)并無與CVA 完全對應(yīng)的病名，但多數(shù)中醫(yī)學(xué)專家都主張本病與哮喘的病因病機相類似，是“伏痰遇感而發(fā)”，屬“哮咳”、“風咳”、“頑咳”、“痙咳”之類別。中醫(yī)對該病的治則為固本扶正、消風止咳。翹芩清肺劑是純中藥復(fù)方制劑，我院已經(jīng)臨床使用多年，由連翹、黃芩、板藍根、玄參、前胡、薄荷、荊芥、桔梗、苦杏仁、甘草等中藥組成。全方清瀉肺熱，利咽止咳。課題組前期研究已證明了翹芩清肺劑對哮喘具有良好的預(yù)防及治療作用［26，27］。據(jù)此，本實驗擬進一步通過觀察NGF、SP 這兩個關(guān)鍵介質(zhì)在CVA 大鼠肺組織中的表達，初步探討氣道神經(jīng)源性炎癥與CVA 發(fā)病的相關(guān)性及翹芩清肺劑是否通過調(diào)節(jié)氣道神經(jīng)源性炎癥而防治CVA，為臨床防治CVA 提供實驗室依據(jù)。

據(jù)文獻報道，NGF、SP 與CVA 的發(fā)病過程及氣道神經(jīng)源性炎癥的發(fā)生有著緊密的聯(lián)系，可通過調(diào)控氣道神經(jīng)源性炎癥，參與CVA 的發(fā)病機制。本實驗結(jié)果顯示，與空白組相比，模型組大鼠的NGF、SP 水平顯著增高，提示在CVA 狀態(tài)下，NGF、SP 水平升高，證實了NGF、SP 參與了CVA的發(fā)生、發(fā)展過程，并可能通過誘導(dǎo)炎癥細胞因子釋放而加重氣道炎癥反應(yīng)。藥物組干預(yù)后顯示，與模型組比較，各組肺組織的炎癥反應(yīng)均有不同程度減輕，NGF、SP 的蛋白表達水平和肺泡灌洗液中的NGF、SP 含量均明顯降低。

國內(nèi)外研究顯示，MAPK 和ERK 通路均為神經(jīng)源性炎癥發(fā)生過程中的重要信號傳導(dǎo)途徑，其中ERK 信號通路可被NGF 活化［26］。在本實驗的前期研究中，已證實翹芩清肺劑可明顯降低哮喘大鼠肺組織p38 MAPK 蛋白表達和ERK1/2 mRNA 的表達，有效調(diào)節(jié)HMGB-MAPK-ERK 信號通路的傳導(dǎo)［26，27］。由此推測翹芩清肺劑可能通過調(diào)節(jié)氣道神經(jīng)源性炎癥中NGF、SP 的蛋白表達水平，從而介導(dǎo)并調(diào)控MAPK 及ERK 等炎癥通路，減輕氣道炎癥，并減緩了咳嗽變異性哮喘的發(fā)展進程。

實驗的肺組織病理結(jié)果顯示，CVA 大鼠模型組肺組織已有明顯炎癥病理變化，NGF、SP 的蛋白表達水平明顯升高，但在肺泡灌洗液的檢測中卻未能印證這一改變。這一結(jié)果提示CVA 是一個長期發(fā)展的慢性疾病，有時候檢測的方式手段、檢測部位及檢測指標并不一定能及時反映病情早期的真實情況，由此更應(yīng)該重視早期控制氣道神經(jīng)源性炎癥發(fā)生發(fā)展的重要性，從而達到未病先防，減緩甚至阻斷CVA 的進程，以期達到早期防治CVA 向哮喘轉(zhuǎn)變的目的。

綜上所述，翹芩清肺劑可有效調(diào)節(jié)肺組織中的NGF、SP 的蛋白表達水平，降低CVA 狀態(tài)下異常升高的NGF、SP 水平，從而減輕了氣道炎癥的一系列瀑布效應(yīng)，干預(yù)了氣道炎癥的發(fā)生與發(fā)展，從而有效地緩解咳嗽變異性哮喘，但具體的靶點仍有待進一步探討。

作者貢獻度說明：

黃慧思：實驗研究、指標檢測、分析數(shù)據(jù)、撰寫論文；韓超、石艷紅：實驗設(shè)計與指導(dǎo)、資金獲取、論文審閱；齊春麗、熊愛華：建立模型、取材、指標檢測；張秋玲、梁慧玲：指標檢測、資金獲取。

所有作者聲明不存在利益沖突關(guān)系。