蘇慧　肖喜悅　郭利榮　張廣成　王麗燕

摘要 為研究中華絨螯蟹血細胞的體外培養(yǎng)方法，分別從培養(yǎng)基、滲透壓、胎牛血清和添加生長因子等培養(yǎng)條件進行探討。結(jié)果表明，在23 ℃、2.5% CO2條件下，在L-15培養(yǎng)基中添加200 IU/mL雙抗和1‰葡萄糖，400～600 mOsm/kg滲透壓，4～5 d半換液，中華絨螯蟹血細胞可存活10 d以上。該研究建立了中華絨螯蟹血細胞體外原代培養(yǎng)體系，為深入研究中華絨螯蟹血細胞分子免疫機制研究奠定了理論和技術(shù)基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞甲殼動物；中華絨螯蟹；血細胞；細胞培養(yǎng)

中圖分類號S96文獻標識碼A

文章編號0517-6611（2023）08-0086-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2023.08.020開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Study on the Primary Cell Culture Conditions of Hemocytes from Eriochier sinensis in vitro

SU Hui XIAO Xi-yue GUO Li-rong et al（1.School of Life Sciences，Tianjin Normal University，Tianjin 300387;2.Tianjin Normal University/Tianjin Key Laboratory of Animal and Plant Resistance，Tianjin 300387）

AbstractThe method of culturing Eriocheir sinensis hemocytes in vitro was studied from the aspects of culture medium，osmotic pressure，fetal bovine serum and adding growth factors.The results showed that E.sinensis hemocytes could survive for more than 10 days under the culture conditions of 23 ℃，2.5% CO2，using L-15 culture medium，adding 200 IU/mL double antibody and 1‰ glucose，change 50% of the liquid after 4-5 days at the osmotic pressure of 400-600 mOsm/kg.The primary culture system of E.sinensis hemocytes in vitro was established，which laid the theoretical and technical foundation for further research on the molecular immune mechanism of E.sinensis hemocytes.

Key wordsCrustacean;Eriocheir sinensis;Hemocytes;Cell culture

甲殼類動物是全球水產(chǎn)養(yǎng)殖系統(tǒng)的重要組成部分，每年銷售額超過100億美元［1］。中華絨螯蟹是一種具有重要經(jīng)濟價值的蟹種［2］。過去幾十年，由于養(yǎng)殖密度過高和各種疾病暴發(fā)造成了甲殼類水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的巨大損失［3］。因此，防控疾病發(fā)生至關(guān)重要，其中細胞體外培養(yǎng)技術(shù)可為其提供基礎(chǔ)理論和實驗研究平臺，然而目前尚無甲殼動物細胞系成功建立的報道。

甲殼動物細胞體外培養(yǎng)研究目前主要集中在細胞培養(yǎng)組織、培養(yǎng)基的選擇與優(yōu)化、培養(yǎng)條件的改善等方面。其中培養(yǎng)較好的是斑節(jié)對蝦卵巢和心臟組織，Owens等［4］和Fraser等［5］分別采用Grace培養(yǎng)基和 L-15 培養(yǎng)基對其進行體外培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)斑節(jié)對蝦卵巢的上皮樣細胞在Grace培養(yǎng)基中的生存期可達2個月，成纖維樣細胞在L-15培養(yǎng)基中可生存3～9個月。在淡水龍蝦造血干細胞體外培養(yǎng)過程中，Sderhll 等［6］研究發(fā)現(xiàn)添加造血因子后其在體外的生存期可達1個月。目前，甲殼動物在體外培養(yǎng)過程中存在傳代困難等問題。

由于缺乏獲得性免疫力，甲殼類動物只有先天免疫力，其血細胞在免疫過程中起著重要作用。當外來病原體侵入機體時，血淋巴將通過吞噬、包囊等細胞免疫反應，產(chǎn)生一些體液免疫分子，如活性氧（ROS）、一氧化氮（NO）等，來響應免疫應答反應［7-8］。研究機體的分子免疫機制、提高物種的免疫力和抗病力已成為甲殼類動物研究領(lǐng)域關(guān)注的重心［9］。中華絨螯蟹（Eriochier sinensis）是弓蟹科絨螯蟹屬甲殼類動物，又名河蟹、大閘蟹，是中國傳統(tǒng)水產(chǎn)珍品。中華絨螯蟹在不同生活環(huán)境、不同生存壓力下其血細胞的分類存在較大差異，所需的培養(yǎng)條件也不同。筆者通過探究中華絨螯蟹血細胞的體外培養(yǎng)條件，以期獲得中華絨螯蟹血細胞體外培養(yǎng)體系，為深入研究中華絨螯蟹血細胞分化和分子免疫機制奠定理論和技術(shù)基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1試驗材料

1.1.1試驗動物。中華絨螯蟹取自天津市王頂?shù)毯ｕr批發(fā)市場，體質(zhì)量（9.9±0.8） g的小螃蟹和體質(zhì)量（72.2±3.2） g的大螃蟹試驗前置于深缸中淡水養(yǎng)殖；體質(zhì)量（125.0±1.5） g的中華絨螯蟹試驗前置于鹽度21‰的海水中養(yǎng)殖，養(yǎng)殖溫度為22 ℃，每天喂食1次，使其適應環(huán)境。試驗時選擇健康、有活力的中華絨螯蟹用于試驗，所有細胞培養(yǎng)試驗所用動物均為淡水飼養(yǎng)。

1.1.2試驗試劑。L-15培養(yǎng)基、DMEM/F12培養(yǎng)基、M199培養(yǎng)基、MEM培養(yǎng)基，購自西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司；FBS，購自Thermo Fisher公司；Human EGF、Human FGF-basic，購自PeproTech公司；PBS，購自上海生工生物工程有限公司；抗凝劑為29.6 mmol/L檸檬酸鈉、167.7 mmol/L NaCl、100 mmol/L葡萄糖、30 mmol/L檸檬酸、10 mmol/L EDTA-2Na，pH 7.2。所有試劑均為進口或國產(chǎn)分析純。

1.1.3試驗儀器與耗材。超低溫冰箱（Thermo）、超凈工作臺（AIRTECH）、移液槍（Eppendorf）、離心機（Eppendorf）、恒溫培養(yǎng)箱（常州諾基儀器有限公司）、高壓滅菌鍋（TsaoHisn）、注射器、解剖器、細胞培養(yǎng)板及細胞爬片等。

1.2試驗方法

1.2.1中華絨螯蟹滲透壓和pH的測定。選取狀態(tài)良好的中華絨螯蟹，測定體長、體寬、體高、體質(zhì)量，酒精棉球（含75%乙醇）消毒處理。用一次性注射器從中華絨螯蟹的最后一對附屬肢處抽取0.5 mL血淋巴，立即置于冰上預冷好的1.5 mL無酶EP管中，使用 Fiske冰點滲透壓儀測量血淋巴滲透壓，重復3次，取平均值。同時，利用pH計測定血漿pH。

1.2.2不同滲透壓培養(yǎng)。取合適的中華絨螯蟹，用酒精棉球（含75%乙醇）消毒處理。用一次性注射器從中華絨螯蟹最后一對附屬肢處抽取0.5 mL血淋巴，與相同體積抗凝劑混合均勻。4 ℃ 2 000 r/min離心5 min，得到血細胞沉淀；再用PBS清洗沉淀的血細胞3次，2 000 r/min 離心5 min，收集血細胞。通過高濃度的生理鹽水將 L-15培養(yǎng)基滲透壓分別調(diào)整為400、600、800和1 000 mOsm/kg，將收集的血細胞分別重懸于這4種滲透壓的培養(yǎng)基中，吹吸混勻，對細胞進行計數(shù)，按照5×10 cells/mL的細胞密度接種至96孔細胞培養(yǎng)板中，每孔100 μL培養(yǎng)基，置于23 ℃培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)液pH為7.5。

1.2.3不同培養(yǎng)基培養(yǎng)。根據(jù)前面的試驗結(jié)果，選擇合適的滲透壓。將收集的血細胞分別重懸于M199、DMEM/F12、L-15和MEM培養(yǎng)基中，吹吸混勻，按照5×105cells/mL的細胞密度接種至96孔細胞培養(yǎng)板中，每孔100 μL培養(yǎng)基，置于23 ℃培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)液pH為7.5。

1.2.4不同濃度胎牛血清培養(yǎng)。選取合適的培養(yǎng)基和滲透壓，在該培養(yǎng)基中分別添加0、5%、10%、15%和20% FBS，吹吸混勻，按照5×10cells/mL的細胞密度接種至96孔細胞培養(yǎng)板中，每孔100 μL培養(yǎng)基，置于23 ℃培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)液pH為7.5。

1.2.5添加生長因子培養(yǎng)。在以上最適的培養(yǎng)條件下，在血細胞的培養(yǎng)過程中添加10 ng/mL b-FGF和EGF生長因子，通過存活率和細胞形態(tài)來觀察添加生長因子對血細胞培養(yǎng)的影響。

2結(jié)果與分析

2.1中華絨螯蟹血細胞滲透壓測定使用冰點滲透壓儀測得體質(zhì)量（9.9±0.8） g的小螃蟹血淋巴滲透壓為600 mOsm/kg，體質(zhì)量（72.2±3.2） g的大螃蟹血淋巴滲透壓為440 mOsm/kg，而體質(zhì)量（125.0±1.5） g的海水養(yǎng)殖中華絨螯蟹血淋巴滲透壓為1 018 mOsm/kg。3種中華絨螯蟹血淋巴pH相差不大，均為7.4～7.6。

2.2不同滲透壓對中華絨螯蟹血細胞培養(yǎng)的影響為確定體外培養(yǎng)中華絨螯蟹血細胞的最佳滲透壓，根據(jù)中華絨螯蟹血淋巴滲透壓的測定結(jié)果，設定滲透壓為400～1 000 mOsm/kg，結(jié)果顯示體外培養(yǎng)3 d的中華絨螯蟹血細胞在滲透壓400～600 mOsm/kg 條件下細胞貼壁良好，形態(tài)完整，細胞脫顆粒和破裂現(xiàn)象較少；當滲透壓在800 mOsm/kg 以上時，細胞開始皺縮成圓形，經(jīng)臺盼藍染色發(fā)現(xiàn)當滲透壓在800 mOsm/kg以上時培養(yǎng)的血細胞基本死亡（圖1）。

2.3不同培養(yǎng)基培養(yǎng)對中華絨螯蟹血細胞培養(yǎng)的影響選擇M199、DMEM/F12、L-15、MEM培養(yǎng)基分別進行中華絨螯蟹血細胞的體外培養(yǎng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在不同培養(yǎng)基中培養(yǎng)12 h時血細胞均貼壁；培養(yǎng)3 d時DMEM/F12和 M199培養(yǎng)基培養(yǎng)的血細胞出現(xiàn)明顯的細胞碎片和細胞破碎現(xiàn)象（圖2）。L-15和MEM 培養(yǎng)基中的血細胞則能保持較好的形態(tài)和細胞活力，但MEM培養(yǎng)基中的血細胞存活時間較短，培養(yǎng)4～6 d 細胞基本喪失活力，細胞破碎比較明顯。

2.4不同胎牛血清濃度對中華絨螯蟹血細胞培養(yǎng)的影響胎牛血清（FBS）在細胞培養(yǎng)的過程中經(jīng)常被作為一種重要的營養(yǎng)物質(zhì)。在中華絨螯蟹血細胞的培養(yǎng)過程中，添加胎牛血清后培養(yǎng)的血細胞易聚集成團，更早出現(xiàn)細胞破裂、顆粒散逸的現(xiàn)象，細胞碎片增多，且這種現(xiàn)象隨著胎牛血清濃度的增加而變得更加明顯（圖3）。因此，在體外培養(yǎng)中華絨螯蟹血細胞的過程中并不適合添加胎牛血清。

2.5添加生長因子對中華絨螯蟹血細胞培養(yǎng)的影響生長因子作為一種調(diào)節(jié)細胞分裂增殖的多肽類物質(zhì)，可以促進DNA合成和細胞有絲分裂，從而使細胞增殖。在最適條件下培養(yǎng)的中華絨螯蟹血細胞中添加EGF和b-FGF 2種混合生長因子，結(jié)果發(fā)現(xiàn)血細胞的存活和增殖情況與生長因子的添加與否沒有明顯關(guān)聯(lián)性（圖4）。

2.6最適條件下培養(yǎng)中華絨螯蟹血細胞體外培養(yǎng)中華絨螯蟹血細胞的最適培養(yǎng)條件如下：在L-15培養(yǎng)基中，調(diào)節(jié)滲透壓為400～600 mOsm/kg，不添加胎牛血清，添加200 IU/mL雙抗和1‰葡萄糖，4～5 d半換液，在23 ℃、2.5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)的血細胞可存活10 d以上（圖5）。

3討論

無論是高等哺乳動物還是低等無脊椎動物，基因功能的深入研究離不開體外細胞培養(yǎng)［10］，因此建立甲殼動物永生細胞系是當前迫切需要的。甲殼動物一般為變滲動物，在不同生活環(huán)境和不同生長階段甲殼動物體內(nèi)的滲透壓都可能會發(fā)生變化。為探討中華絨螯蟹血細胞體外培養(yǎng)的最佳滲透壓，筆者對不同個體大小的中華絨螯蟹血淋巴滲透壓進行測定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在淡水養(yǎng)殖中體質(zhì)量（72.2±3.2） g的大螃蟹血淋巴滲透壓為440 mOsm/kg，體質(zhì)量（9.9±0.8） g的小螃蟹血淋巴滲透壓為600 mOsm/kg，而體質(zhì)量（125.0±1.5） g的海水養(yǎng)殖中華絨螯蟹血淋巴滲透壓為1 018 mOsm/kg。鑒于不同規(guī)格中華絨螯蟹的滲透壓情況，對培養(yǎng)的中華絨螯蟹血細胞滲透壓進行比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在滲透壓400～600 mOsm/kg下血細胞生長狀態(tài)良好，這與淡水養(yǎng)殖大螃蟹血淋巴滲透壓大小基本一致。同樣地，在斑節(jié)對蝦淋巴器官體外培養(yǎng)的過程中，在滲透壓470～500 mmol/kg下培養(yǎng)的細胞貼壁和生長最好［11］。楊鶴等［10］研究發(fā)現(xiàn)中華絨螯蟹血細胞在滲透壓991 mOsm/kg條件下生長狀態(tài)較好，養(yǎng)殖環(huán)境和螃蟹個體大小等可能對體外培養(yǎng)細胞的滲透壓造成影響。因此，不同動物不同組織細胞的體外培養(yǎng)應選擇合適的滲透壓條件。

細胞培養(yǎng)基的選擇對體外細胞培養(yǎng)至關(guān)重要。目前尚沒有針對水產(chǎn)動物細胞的專用培養(yǎng)基。L-15、DMEM、M199等培養(yǎng)基在甲殼動物的細胞培養(yǎng)中成功培養(yǎng)了原代細胞［5，8，12］。該研究選取了甲殼動物細胞體外培養(yǎng)過程中常見的幾種培養(yǎng)基，包括L-15培養(yǎng)基、M199培養(yǎng)基、MEM培養(yǎng)基和DMEM/F12培養(yǎng)基，研究發(fā)現(xiàn)L-15培養(yǎng)基中培養(yǎng)的中華絨螯蟹血細胞狀態(tài)更好。L-15培養(yǎng)基一般被認為是最適宜甲殼動物細胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基［13］，在紅螯螯蝦（Cherax quadricarinatus）、凡納濱對蝦（Litopenaeus vannamei）、擬穴青蟹（Scylla paramamosain）和克氏原螯蝦（Procambarus clarkii）血細胞原代培養(yǎng)中均表現(xiàn)出較好的培養(yǎng)效果［14-17］。M199培養(yǎng)基在日本對蝦（Penaeus japonicus）血細胞培養(yǎng)中得到了應用［18］。

胎牛血清對于高等動物細胞培養(yǎng)是不可或缺的，是細胞培養(yǎng)中重要的添加物之一［19-21］，但也有學者認為添加胎牛血清會對細胞培養(yǎng)產(chǎn)生不利影響［22-23］。筆者在中華絨螯蟹血細胞體外培養(yǎng)過程中添加不同濃度的胎牛血清（0、5%、10%、15%、20%），結(jié)果發(fā)現(xiàn)添加胎牛血清后的血細胞比未添加胎牛血清的血細胞更早出現(xiàn)細胞破裂、顆?；痊F(xiàn)象，這與洪宇航等［24］的研究結(jié)果相似。由此可見，中華絨螯蟹血細胞體外培養(yǎng)不適合添加胎牛血清。盡管胎牛血清在許多研究中已被用于甲殼類細胞培養(yǎng)，但它不會誘導長期細胞存活或刺激細胞分裂，甚至可能對細胞生長產(chǎn)生不利的影響［25］，這種現(xiàn)象可能是由于不同物種間的巨大差異所致。細胞因子的添加對于細胞增殖也具有促進效果。例如，基礎(chǔ)成纖維生長因子在斑節(jié)對蝦細胞培養(yǎng)中具有明顯效果［11］。但是，在中華絨螯蟹血細胞中添加b-FGF和EGF后血細胞的存活和增殖情況并沒有明顯的變化。

筆者研究了4種培養(yǎng)基（M199、DMEM/F12、L-15、MEM）、不同滲透壓（400、600、800、1 000 mOsm/kg）、不同胎牛血清濃度（0、5%、10%、15%、20%）以及添加2種生長因子EGF和b-FGF條件下中華絨螯蟹血細胞的培養(yǎng)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在L-15培養(yǎng)基中，調(diào)節(jié)滲透壓為400～600 mOsm/kg，不添加胎牛血清，添加200 IU/mL 雙抗和1‰葡萄糖，4～5 d半換液，在23 ℃、2.5% CO2的培養(yǎng)箱中中華絨螯蟹血細胞可存活10 d以上。該研究結(jié)果為連續(xù)性體外細胞培養(yǎng)條件的建立奠定了基礎(chǔ)。

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