馬嘯,劉浩楠,呂帝,崔永征,韓正祥

在世界范圍內(nèi),乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤[1],是女性健康的主要威脅之一。其中三陰性乳腺癌(triple-negative breast cancer,TNBC)是指乳腺癌組織中免疫組化結(jié)果為雌激素受體(estrogen receptor,ER)、孕激素受體(progesterone receptor,PR)、人類表皮生長因子受體-2(human epidermal growth factor receptor 2,HER-2)均為陰性的特殊類型乳腺癌[2]。TNBC約占所有乳腺癌病理類型的15%～20%[3]。傳統(tǒng)的內(nèi)分泌治療及抗HER-2治療均無效且其具有侵襲性強(qiáng)、復(fù)發(fā)性高等生物學(xué)特性[4-5],因此預(yù)后極差,尋找有效的治療手段迫在眉睫。

近年來隨著免疫治療不斷發(fā)展,免疫檢查點(diǎn)抑制劑藥物在許多晚期惡性腫瘤中的廣泛應(yīng)用為TNBC的治療帶來了曙光[6]。神經(jīng)纖毛蛋白-1(neuropilin-1,NRP-1)是一種非酪氨酸激酶跨膜糖蛋白受體,同時(shí)也是血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)的共受體,在神經(jīng)發(fā)育、血管生成、腫瘤的增殖和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用[7]。研究發(fā)現(xiàn),NRP-1在淋巴瘤、卵巢癌、黑色素瘤、胃腸道腫瘤等多種人類腫瘤組織中均過表達(dá),但在相應(yīng)的正常組織中表達(dá)較低,并與腫瘤的預(yù)后相關(guān)[8-10]。在TNBC中尚無關(guān)于NRP-1、PD-L1表達(dá)水平的相關(guān)性研究。因此本研究通過檢測TNBC組織標(biāo)本中NRP-1和PD-L1的表達(dá)水平,分析其相關(guān)性及與預(yù)后的關(guān)系,以為TNBC的診斷、個(gè)體化治療、預(yù)后評估等提供新策略,報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 收集2012年3月—2014年12月行手術(shù)治療的TNBC患者40例的癌組織及10例對應(yīng)的癌旁組織(組織芯片均購自上海芯超生物科技有限公司),患者均為女性,中位年齡53(28～84)歲?；颊咝g(shù)前均未行放、化療或其他針對腫瘤的治療。依據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)乳腺腫瘤分類標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分類分級:G2級22例,G3級18例;TNM臨床分期:0期4例,Ⅰ～Ⅱ期25例,Ⅲ～Ⅳ期11例。本研究于2019年10月11日通過上海芯超生物科技有限公司倫理委員會的批準(zhǔn)(YB M-05-02),患者及家屬知情同意并簽署知情同意書。

1.2 NRP-1和PD-L1表達(dá)檢測 采用免疫組化方法檢測,將組織芯片放入烘箱中,烘蠟1 h,脫蠟。將玻片進(jìn)行修復(fù),而后放在室溫的蒸餾水中,使其自然冷卻>10 min,PBS緩沖液沖洗;加入稀釋好的一抗工作液,4℃度冰箱過夜。冰箱取出玻片,室溫復(fù)溫45 min,PBS緩沖液清洗玻片;玻片放入DAKO全自動免疫組化儀,按照“Autostainer Link 48使用指南”選擇相應(yīng)程序運(yùn)行阻斷、二抗結(jié)合、DAB顯色程序;蘇木素染色1 min,在0.25%的鹽酸酒精(70%酒精400 ml+濃鹽酸1 ml)中浸沒約10 s,自來水沖洗5 min;室溫晾干玻片,中性樹脂封片;免疫組化染色均采用EnVision法,NRP-1抗體(鼠單克隆抗體,稀釋比1∶1 000)和PD-L1抗體(鼠單克隆抗體,稀釋比1∶1 000)購自南京肽迪生物技術(shù)中心。具體操作步驟嚴(yán)格按試劑盒說明書進(jìn)行。

1.3 結(jié)果判斷 NRP-1蛋白主要表達(dá)于細(xì)胞漿,PD-L1主要表達(dá)于細(xì)胞膜和細(xì)胞漿。以細(xì)胞相應(yīng)部位呈棕色或棕黃色判定為陽性染色,根據(jù)細(xì)胞染色強(qiáng)度進(jìn)行評分,分別記為0分(陰性),0.5分(±),1分(+),2分(++),3分(+++);根據(jù)陽性細(xì)胞占腫瘤細(xì)胞總數(shù)的百分比,將染色陽性率評分記為0～100%。免疫組化總評分為“染色強(qiáng)度評分”與“染色陽性率”的乘積,分值范圍為0～300%。胞漿NRP-1:總評分≤160%為低表達(dá),>160%為高表達(dá);胞漿 PD-L1:總評分≤15%為低表達(dá),>15%為高表達(dá)。

2 結(jié) 果

2.1 TNBC癌組織及癌旁組織NRP-1和PD-L1表達(dá)比較 TNBC中PD-L1陽性定位于細(xì)胞膜和細(xì)胞漿上,NRP-1定位于細(xì)胞漿,見圖1。PD-L1在TNBC癌組織和癌旁組織的陽性率分別為80%和20%;NRP-1在TNBC癌組織和癌旁組織的陽性率分別為80%和20%。NRP-1蛋白、PD-L1蛋白在癌組織中的表達(dá)水平顯著高于癌旁組織(P<0.01),見表1、圖2。

2.2 TNBC癌組織NRP-1與PD-L1表達(dá)的相關(guān)性 根據(jù)Spearman檢驗(yàn)可知, NRP-1與PD-L1的表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.570,P<0.001) 。GEPIA 數(shù)據(jù)庫(http://gepia. cancer-pku.cn/)分析顯示,NRP-1與PD-L1表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.065,P=0.016),與上述結(jié)果一致。

2.3 NRP-1和PD-L1的表達(dá)與臨床/病理特征的相關(guān)性 NRP-1的表達(dá)與病理分級、腫瘤直徑明顯相關(guān)(P<0.05);PD-L1的表達(dá)與病理分級、Ki67水平明顯相關(guān)(P<0.05),見表2。

2.4 NRP-1和PD-L1表達(dá)與患者預(yù)后關(guān)系分析 Kaplan-Meier生存曲線顯示,PD-L1高表達(dá)患者的中位OS短于PD-L1低表達(dá)患者(13.1個(gè)月 vs. 15.1個(gè)月,χ2=9.641,P=0.001);NRP-1高表達(dá)患者中位OS短于低表達(dá)患者(13.6個(gè)月 vs. 15.2個(gè)月,χ2=14.510,P=0.002);PD-L1和NRP-1均高表達(dá)患者中位OS顯著短于PD-L1和NRP-1均低表達(dá)患者(13.5個(gè)月 vs. 15.2個(gè)月,χ2=15.940,P=0.001)。

表1 PD-L1和NRP-1在三陰性乳腺癌組織和癌旁組織表達(dá)比較 [例(%)]

2.5 TNBC患者預(yù)后影響因素的Cox回歸模型分析 以TNBC患者預(yù)后為因變量,上述結(jié)果P<0.05因素為自變量進(jìn)行Cox回歸模型分析,結(jié)果顯示,PD-L1表達(dá)水平高是影響患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P=0.021),而年齡、病理分級、腫瘤直徑、TNM分期、Ki67水平和NRP-1表達(dá)水平不是影響患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P>0.05),見表3。Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫(https: //kmplot.com/analysis/)分析結(jié)果也顯示,NRP-1高表達(dá)患者較低表達(dá)患者風(fēng)險(xiǎn)比例高60%(圖3A),PD-L1高表達(dá)患者較低表達(dá)患者風(fēng)險(xiǎn)比例高36%(圖3B)。

注:A.PD-L1高表達(dá);B.PD-L1低表達(dá);C.NRP-1高表達(dá);D.NRP-1低表達(dá)

表2 NRP-1和PD-L1的表達(dá)與臨床/病理特征的相關(guān)性 [例(%)]

表3 三陰性乳腺癌患者預(yù)后影響因素的Cox回歸模型分析

3 討 論

由于生活壓力的增加、生育模式及生活環(huán)境的改變,乳腺癌發(fā)病率逐年升高,并呈現(xiàn)出年輕化的趨勢[11]。隨著精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)的不斷發(fā)展,盡管內(nèi)分泌治療、化學(xué)治療、放射治療、靶向治療及免疫治療提高了乳腺癌患者的生存率[12],但TNBC由于自身生物學(xué)特性,治療方式有限且預(yù)后差,因此目前迫切需要能夠找到在TNBC中表達(dá)且與腫瘤進(jìn)展和預(yù)后有關(guān)的分子,為TNBC患者提供更有效、更特異的治療方案。

PD-L1是一種Ⅰ型跨膜蛋白,屬于B7共刺激分子家族,可稱為CD274[13]。它在多種腫瘤細(xì)胞表面表達(dá),在體內(nèi)與腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞(tumor infiltrating lymphocyte, TIL)上的PD-1進(jìn)行結(jié)合,傳導(dǎo)免疫抑制的信號,抑制TIL的增生和活化,并阻止抗原特異性CD8+

圖3 Kaplan-Meier Plotter 在線數(shù)據(jù)庫中NRP-1和PD-L1的表達(dá)與患者預(yù)后關(guān)系

T淋巴細(xì)胞消除腫瘤細(xì)胞,從而使TIL處于失活的狀態(tài),最終誘導(dǎo)免疫逃逸[14]。黃淅睿等[15]報(bào)道PD-L1在TNBC患者中過表達(dá),其機(jī)制尚不清楚,但它被認(rèn)為與更強(qiáng)的侵襲力和較差的預(yù)后有關(guān)。一些針對PD-L1的單克隆抗體,能夠競爭性地與人體內(nèi)的PD-L1結(jié)合,從而影響到PD-1和PD-L1的結(jié)合,故而能夠解除PD-1和PD-L1結(jié)合所介導(dǎo)的免疫功能抑制,使人體內(nèi)CD8+T細(xì)胞被重新激活[16]。在腫瘤微環(huán)境(tumor microenvironment, TME)中會有活化的T細(xì)胞大量聚集,從而啟動人體的抗腫瘤免疫反應(yīng)[17]。

NRP-1是一類非酪氨酸激酶跨膜多功能糖蛋白,它可以與血管內(nèi)皮生長因子受體2(vascular endothelial cell growth factor receptor 2,VEGFR2)一起作為VEGF的共受體,通過增強(qiáng)VEGF165(vascular endothelial cell growth factor 165)與VEGFR2結(jié)合,增加血管內(nèi)皮的趨化性、誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞的遷移,促進(jìn)腫瘤血管的生成[18-19]。在TME中,可通過調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Tregs)上表達(dá)的NRP-1起作用,腫瘤衍生的VEGF吸引NRP-1+Treg向腫瘤組織募集[20],增強(qiáng)腫瘤的免疫逃逸;Tregs還可通過與NRP-1的相互作用,弱化樹突狀細(xì)胞(DC)活化效應(yīng)性T細(xì)胞的功能,最終使效應(yīng)性T淋巴細(xì)胞活化不足。胸腺來源的Tregs可表達(dá)PD-1,PD-1/PD-L1相互作用有助于使CD4+T細(xì)胞轉(zhuǎn)化成Treg細(xì)胞,Treg細(xì)胞上表達(dá)的PD-1還可以與T細(xì)胞上表達(dá)的PD-L1相互作用,以介導(dǎo)免疫抑制,在抗原識別過程中,NRP-1表達(dá)促進(jìn)Treg與DC的相互作用,從而抑制T細(xì)胞活化[21-22]。但NRP-1與PD-L1相互作用的機(jī)制仍不明確。

本研究發(fā)現(xiàn),在TNBC癌組織中PD-L1和NRP-1的表達(dá)水平高于癌旁組織,且二者表達(dá)存在正相關(guān)性。進(jìn)一步探討發(fā)現(xiàn)PD-L1和NRP-1均高表達(dá)的患者預(yù)后較差,基于這一結(jié)果,對于臨床中出現(xiàn)雙基因高表達(dá)患者可以進(jìn)行早期發(fā)現(xiàn),及時(shí)干預(yù),避免癌癥終末期事件發(fā)生。而針對性調(diào)節(jié)NRP-1表達(dá)的分子也使得這一目的發(fā)現(xiàn)成為可能。Hang等[23]觀察到NRP-1的表達(dá)與microRNA分子的表達(dá)之間存在相關(guān)性。過表達(dá)miR-9-5p可降低NRP-1的表達(dá),還可以導(dǎo)致間質(zhì)標(biāo)志物N-鈣黏蛋白(N-cadherin)和波形蛋白(vimentin)表達(dá)上調(diào),上皮標(biāo)志物E-鈣黏蛋白(E-cadherin)和β-連環(huán)蛋白(β-catenin)表達(dá)下調(diào)。在胃癌(GC)發(fā)生過程中,過表達(dá)miR-9-5p可抑制細(xì)胞增殖、遷移和侵襲。miR-9-5p的過表達(dá)使GC細(xì)胞對廣泛使用的抗癌藥物順鉑具有更高的敏感性。

目前,抗PD-1/PD-L1藥物對腫瘤具有一定緩解作用,但單獨(dú)療效并不顯著,只有10%～30%的患者在接受抗PD-1/PD-L1藥物后可產(chǎn)生持續(xù)療效[24]。Checkmate-648項(xiàng)目作為全球最大的隨機(jī)Ⅲ期藥物試驗(yàn),納入970例全球各地晚期食管癌患者。結(jié)果表明,PD-1抑制劑+CTLA-4抑制劑雙重免疫治療相較于化療可獲得更好的中位總生存率。而在晚期腎細(xì)胞癌及黑色素瘤中,也得到了類似的結(jié)論,尼武單抗聯(lián)合伊匹單抗的治療相較于單藥免疫治療療效顯著[25-26]。目前,已有研究顯示,免疫聯(lián)合治療能夠使TNBC患者獲得更好的腫瘤緩解率,使生存周期明顯延長[27-28]。基于這一現(xiàn)狀,可以大膽推測PD-L1和NRP-1的聯(lián)合免疫治療有利于推動分子精準(zhǔn)醫(yī)療的發(fā)展。

綜上所述,PD-L1與NRP-1在TNBC的發(fā)生發(fā)展中起到促進(jìn)作用,推測NRP-1可能參與PD-L1的表達(dá)調(diào)控,促進(jìn)腫瘤具有更強(qiáng)的轉(zhuǎn)移和侵襲能力,并進(jìn)一步參與腫瘤的免疫逃逸。因此NRP-1和PD-L1有望成為治療TNBC的潛在靶點(diǎn),二者的聯(lián)合治療能有效改善預(yù)后。但是二者之間具體調(diào)控機(jī)制有待后續(xù)基礎(chǔ)研究深入探討。本研究將PD-L1與NRP-1表達(dá)水平進(jìn)行綜合分析,探討其與TNBC發(fā)生、發(fā)展的相關(guān)性。但由于本試驗(yàn)所取的樣本量較少,可能存在一定的偏倚,還需積累更多病例進(jìn)一步分析。

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明

馬嘯:提出研究思路,論文撰寫;劉浩楠:病例資料收集;呂帝:統(tǒng)計(jì)學(xué)分析處理;崔永征:數(shù)據(jù)分析;韓正祥:指導(dǎo)寫作,文章審核