代麗鳳，蔣潔琳，官興麗*，鄒小林，楊 智，符宗林，羅 賽

（1. 云南省普洱茶發(fā)酵工程研究中心，云南 昆明 650217； 2. 云南大益微生物技術(shù)有限公司，云南 昆明 650217； 3. 勐海茶業(yè)有限責(zé)任公司，云南 勐海 666200）

0 引言

【研究意義】普洱熟茶是以云南大葉種曬青茶（Camellia sinensisvar.assamica）為原料，通過渥堆發(fā)酵而成，含有豐富的茶褐素和沒食子酸[1]，具有降血脂[2]、降血糖[3]、抗肥胖[4]、調(diào)節(jié)腸道菌群[5-7]、抗炎[8,9]、抗氧化[10]、抗癌[11]等生物活性。玫瑰（Rosa rugosaThunb.）為薔薇科薔薇屬植物，富含多酚、多糖及花青素類物質(zhì)[12]，具有抗氧化、抑菌、抗癌和免疫調(diào)節(jié)等生理活性[13-16]。墨紅玫瑰具有香味濃郁、花期長、產(chǎn)量高等特點，其中作為食用玫瑰的主要品種在云南廣泛種植[17]。葡萄籽是葡萄科葡萄屬葡萄（Vitis viniferaL.）的種子，富含原花青素、白藜蘆醇、葡萄籽油等營養(yǎng)物質(zhì)[18]，具有防止氧化損傷、抗糖尿病、抗腫瘤、抗輻射、抗肥胖、保護心血管等諸多功效[19-22]，因而常被用于保健食品的制作，功能聲稱多為抗氧化、祛黃褐斑和增強免疫力等?！厩叭搜芯窟M展】自GB/T 22111—2008《地理標(biāo)志產(chǎn)品 普洱茶》實施以來，速溶茶粉、液態(tài)飲料等普洱茶深加工產(chǎn)品日益增多[23]，但多以口味和便攜性為賣點，較少體現(xiàn)茶飲的功能屬性。與中國紅一號、滇紅、大馬士革相比，墨紅玫瑰多酚含量最高，為 198.07±5.78 mg·g-1，是大馬士革的1.92倍，且清除DPPH（1,1-二苯基-2-苦基肼）自由基的能力最強，具有良好的抗氧化活性[24]。云南食用玫瑰花目前仍以鮮花、干花等初加工產(chǎn)品形式為主，深加工產(chǎn)品較少[25]，未充分發(fā)揮玫瑰的營養(yǎng)與藥用價值。含葡萄籽的普通食品主要包括油、粉、固體飲料、果汁飲品、壓片糖果等產(chǎn)品。全國葡萄籽可利用產(chǎn)量約5 000～6 000 t，但在葡萄酒釀制過程中，葡萄籽常作為廢渣被丟棄[26]，造成資源浪費?！颈狙芯壳腥朦c】普洱茶作為云南省地理標(biāo)志產(chǎn)品，目前仍以傳統(tǒng)原葉茶為主要形式在市場流通，深加工產(chǎn)品較為缺乏，且未見普洱茶與葡萄籽共同搭配研制的食飲品。【擬解決的關(guān)鍵問題】以普洱熟茶、云南墨紅玫瑰、葡萄籽為主要原料，復(fù)配藥食同源材料枸杞及山楂，通過單因素和響應(yīng)面試驗對飲料最佳配比工藝進行優(yōu)化，利用原材料特性開發(fā)抗氧化新產(chǎn)品，旨在推動云南高原特色產(chǎn)業(yè)普洱茶和玫瑰花的深化發(fā)展，同時加強對葡萄籽廢物利用，助推綠色低碳經(jīng)濟發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

普洱熟茶（益原素發(fā)酵茶），勐海茶業(yè)有限責(zé)任公司提供；墨紅玫瑰、葡萄籽、山楂、枸杞均為市售。

主要試劑：甲醇（色譜純，天津市富宇精細(xì)化工有限公司）；DPPH（純度＞97.0%，梯希愛（上海）化成工業(yè)發(fā)展有限公司）；ABTS（2,2'-聯(lián)氮雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二銨鹽，純度≥98%，北京索萊寶科技有限公司）；過硫酸鉀（純度99.99%，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；維生素C（純度≥99%，上海源葉生物科技有限公司）。

主要儀器：TB-215D型電子天平［賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司］；RY-UHT-20L型超高溫殺菌機（上海銳元機械設(shè)備有限公司）；AMR-100型酶標(biāo)儀、MB100-2A型微孔板恒溫振蕩器（杭州奧盛儀器有限公司）；E2695高效液相色譜儀（配置2998二極管陣列檢測器，美國Waters公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 工藝流程

1.2.2 操作要點

浸提液制備：均按料水比1∶10（g∶mL），恒溫浸提2次，每次30 min，過濾冷卻后離心備用。其中普洱茶與葡萄籽浸提溫度為90℃，山楂浸提溫度為80℃，枸杞浸提溫度為70℃。

玫瑰花冷萃液制備：粉碎，按玫瑰花、冰水混合物比1∶10（g∶g），4℃恒溫浸提2次，每次3 h，過濾，離心備用。

離心：4 500 r·min-1，離心 15 min。

滅菌：采用超高溫瞬時滅菌（UHT），130℃滅菌15 s。

灌裝：無菌瓶灌裝飲料。

1.3 單因素試驗

以200 mL為基準(zhǔn)，各因素水平分別設(shè)置為普洱茶浸提液5%、10%、15%、20%、25%；玫瑰花冷萃液1%、2%、3%、4%、5%；葡萄籽浸提液3%、4%、5%、6%、7%；山楂浸提液0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%；枸杞浸提液1%、2%、3%、4%、5%，均為體積分?jǐn)?shù)。加水定容，混勻，感官評分，以確定各因素的最佳添加量。

1.4 響應(yīng)面試驗

以單因素試驗為基礎(chǔ)，選取普洱茶浸提液、玫瑰花冷萃液、葡萄籽浸提液、山楂浸提液4個因素，利用Design Expert 13軟件，設(shè)計4因素3水平Box-Behnken中心組合試驗，設(shè)置復(fù)合飲料的感官評分為評價指標(biāo)，響應(yīng)面試驗因素及水平設(shè)計見表1。

表1 Box-Behnken試驗設(shè)計因素與水平Table 1 Factors and levels in Box-Benhnken experiment

1.5 感官品質(zhì)評定

審評人員共10名，男女各5名，均具備一定的審評專業(yè)知識與味覺敏感性，并于審評前統(tǒng)一培訓(xùn)，明確評分準(zhǔn)則。參考GB/T 21733—2008《茶飲料》，根據(jù)飲料的色澤、狀態(tài)、氣味、滋味4個指標(biāo)對飲料進行感官評定，評分標(biāo)準(zhǔn)如表2所示，總分為100分。

表2 普洱茶玫瑰花葡萄籽復(fù)合飲料感官評價標(biāo)準(zhǔn)Table 2 Sensory evaluation of pu-erh tea rose grape seed compound beverage

1.6 質(zhì)量指標(biāo)測定

1.6.1 理化指標(biāo)

參照NY/T 3675—2020《紅茶中茶紅素和茶褐素含量的測定 分光光度法》測定茶褐素含量；采用GB/T 21733—2008《茶飲料》規(guī)定的方法測定茶多酚含量；按GB 5009.139—2014《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 飲料中咖啡因的測定》對咖啡因含量進行測定；高效液相色譜法測定沒食子酸[27]；苯酚-濃硫酸法測定多糖[28]；三氯化鋁法測定黃酮[29]。

1.6.2 微生物指標(biāo)

菌落總數(shù)、霉菌和酵母、大腸菌群等微生物指標(biāo)，分別參照GB 4789.2—2022《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗 菌落總數(shù)測定》、GB 4789.15—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗 霉菌和酵母計數(shù)》、GB 4789.3—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗 大腸菌群計數(shù)》進行測定。

1.7 抗氧化性能測定

1.7.1 DPPH法

主要參照CHENG Z H等[30]的方法。DPPH貯備液需現(xiàn)配現(xiàn)用，精準(zhǔn)稱取7.2 mg DPPH溶解于25 mL甲醇中，避光保存待用。取1 mL DPPH貯備液加甲醇稀釋至5 mL，即為DPPH工作液。將100 μL稀釋20倍的樣品溶液添加至96孔板中，對照孔中加入100 μL甲醇，然后每組加入100 μL DPPH工作液，蓋上蓋子，放入恒溫振蕩器振蕩均勻，常溫下避光反應(yīng)20 min。以甲醇為空白對照，20 μg·mL-1維生素C為陽性對照。將96孔板置于酶標(biāo)儀內(nèi)，于517 nm波長下檢測吸光值（A）。DPPH自由基的清除率按式（1）計算：

1.7.2 ABTS法

主要參照THAIPONG K等[31]的方法。將7.4 mmol·L-1ABTS 溶液和 2.6 mmol·L-1過硫酸鉀溶液等體積混合，室溫下避光反應(yīng)12 h，作為ABTS貯備液。350 μL ABTS 貯備液用甲醇稀釋至3 mL，使其在734 nm下的吸光值為0.8±0.02，即為工作液。將100 μL稀釋20倍的樣品溶液添加至96孔板中，對照孔中加入100 μL甲醇，然后每組加入100 μL ABTS工作液，蓋上蓋子，放入恒溫振蕩器振蕩均勻，常溫下避光反應(yīng)20 min。以甲醇為空白對照，20 μg·mL-1維生素C為陽性對照。將96孔板置于酶標(biāo)儀內(nèi)，于734 nm波長下檢測其吸光值（A）。ABTS自由基的清除率按式（2）計算：

1.8 數(shù)據(jù)處理

采用Origin 9.1制圖、SPSS 25處理單因素試驗數(shù)據(jù)、Design Expert 13分析響應(yīng)面試驗數(shù)據(jù)。每個試驗重復(fù)3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 普洱茶浸提液添加量

由圖1可知，普洱茶浸提液添加量對復(fù)合飲料感官評分有明顯影響，在15%的添加量下，復(fù)合飲料感官評分最高，且與其他添加量相比具有顯著差異（P＜0.05）。此時的飲料茶湯紅亮，澄清透明，滋味豐富，具有復(fù)合飲料的風(fēng)味。普洱茶浸提液添加量低于15%，飲料呈棕紅色，滋味單薄、稍顯寡淡。普洱茶浸提液添加量高于15%，飲料呈暗褐色，花香黯淡，滋味苦澀。綜合分析，確定普洱茶浸提液添加量為15%。

圖1 普洱茶浸提液添加量對復(fù)合飲料感官評價的影響Fig. 1 Effect of Pu-erh tea extract on sensory quality of experimental beverage

2.1.2 玫瑰花冷萃液添加量

玫瑰花冷萃液添加量對復(fù)合飲料感官評價的影響由圖2可知，隨著玫瑰花冷萃液添加量的增加，復(fù)合飲料的感官評分呈先增后降趨勢。玫瑰花冷萃液添加量為3%，復(fù)合飲料的感官評分最高，與2%和4%相比，具有顯著差異（P＜0.05），此時飲料玫瑰花香濃郁，澄清透明，滋味爽口。玫瑰花冷萃液添加量少于3%，普洱茶陳香較為突出，玫瑰花香不夠顯著，玫瑰花冷萃液添加量高于3%，玫瑰花香顯著，但滋味苦澀，不夠愉悅。綜合分析，確定玫瑰花冷萃液添加量為3%。

圖2 玫瑰花冷萃液添加量對復(fù)合飲料感官評價的影響Fig. 2 Effect of rose cold extract on sensory quality of experimental beverage

2.1.3 葡萄籽浸提液添加量

葡萄籽浸提液添加量對復(fù)合飲料感官評價的影響由圖3可知，在5%的添加量下，其感官評分最高，與4%和6%相比，具有顯著差異（P＜0.05），此時的飲料花香與茶香搭配協(xié)調(diào)，澄清透明，滋味豐富。隨著葡萄籽浸提液添加量繼續(xù)增加，飲料熟悶味逐漸加重，澀味逐漸變強。綜合分析，確定葡萄籽浸提液添加量為3%。

圖3 葡萄籽浸提液添加量對復(fù)合飲料感官評價的影響Fig. 3 Effect of grape seed extract on sensory quality of experimental beverage

2.1.4 山楂浸提液添加量

山楂浸提液添加量對復(fù)合飲料感官評價的影響由圖4可知，山楂浸提液添加量為1%感官評分最高，與0.5%和1.5%相比，具有顯著差異（P＜0.05）。此時的飲料澄清透明，酸甜適口，具有復(fù)合飲料的風(fēng)味。山楂浸提液添加量低于1%，飲料滋味不夠豐富，整體稍顯平淡。山楂浸提液添加量高于1%，飲料山楂味明顯，掩蓋花香，酸味突出，口感協(xié)調(diào)性下降。綜合分析，確定山楂浸提液添加量為1%。

圖4 山楂浸提液添加量對復(fù)合飲料感官評價的影響Fig. 4 Effect of hawthorn extract on sensory quality of experimental beverage

2.1.5 枸杞浸提液添加量

枸杞浸提液添加量對復(fù)合飲料感官評價的影響由圖5可知，枸杞浸提液添加量為3%，感官評分最高，但與2%相比，不具顯著差異（P＜0.05）。枸杞浸提液添加量低于3%，飲料偏苦，但整體滋味較為協(xié)調(diào)。枸杞浸提液添加量高于3%，飲料枸杞味明顯，掩蓋花香，且澀味明顯。綜合考慮，確定枸杞浸提液添加量為3%。

圖5 枸杞浸提液添加量對復(fù)合飲料感官評價的影響Fig. 5 Effect of wolfberry extract on sensory quality of experimental beverage

2.2 響應(yīng)面試驗設(shè)計與結(jié)果

根據(jù)單因素試驗的結(jié)果，以普洱茶浸提液添加量、玫瑰花冷萃液添加量、葡萄籽浸提液添加量、山楂浸提液添加量為自變量，以復(fù)合飲料的感官評分為響應(yīng)值，進行4因素3水平響應(yīng)面試驗，研究設(shè)計及結(jié)果見表3。

通過Box-Behnken對表3中的數(shù)據(jù)進行多元回歸分析，得出試驗因素對感官評分之間的擬合方程為：

表3 Box-Behnken設(shè)計及結(jié)果Table 3 Design and results of Box-Behnken experiment

Y=-278.12+12.95A+50.72B+66.28C+62.07D-0.13AB+0.03AC+0.02AD-0.20BC-0.80BD-2.9CD-0.45A2-7.31B2-6.48C2-24.73D2。并對模型進行方差分析，分析結(jié)果見表4。從表4可知，此模型F=73.52，P＜0.000 1，回歸模型極顯著。失擬項F=2.76，P=0.170 3＞0.05，不顯著，表明此模型與純誤差沒有顯著關(guān)聯(lián)。決定系數(shù)R2=0.986 6，校正系數(shù)R2adj=0.973 2，說明感官評分的實測值與預(yù)測值之間具有較好的一致性，得到的回歸方程適于分析和預(yù)測復(fù)合飲料的感官評分。

表4 回歸模型方差分析結(jié)果Table 4 Analysis of variance on regression model

回歸模型中A（普洱茶浸提液添加量）、B（玫瑰花冷萃液添加量）、C（葡萄籽浸提液添加量）、D（山楂浸提液添加量）對產(chǎn)品感官評分的影響極其顯著（P＜0.01）。4個因素的F值表明，影響復(fù)合飲料感官評分的因素依次為A＞C＞B＞D，即普洱茶浸提液添加量對飲料感官評分的影響最大，其次是葡萄籽浸提液添加量，山楂浸提液添加量的影響最小。

2.3 響應(yīng)面交互作用分析

通過回歸分析得出復(fù)合飲料感官評價中各因素相互作用的響應(yīng)面和等高線圖，見圖6-圖11。根據(jù)響應(yīng)面圖可以觀測到各影響因素之間的相互關(guān)系，響應(yīng)面的斜率越大，相互作用越明顯，響應(yīng)面的斜率越平滑，相互作用越弱[32]。同樣，等高線圖也能反映各因素之間的交互作用，圓形等高線表示弱交互作用，橢圓形等高線表示強交互作用[33]。

由圖6所示，普洱茶浸提液添加量與玫瑰花冷萃液添加量的交互作用對復(fù)合飲料感官評分影響呈先上升后下降的趨勢，響應(yīng)曲面呈弧形。以普洱茶添加量15%和玫瑰花冷萃液添加量3%，感官品質(zhì)最佳。等高線近似圓形，說明普洱茶浸提液添加量與玫瑰花冷萃液添加量（AB）交互作用對復(fù)合飲料的感官評分沒有明顯影響。普洱茶添加過多，飲料茶味凸顯，掩蓋花香，造成滋味苦澀。普洱茶添加過少，飲料滋味單薄，缺乏豐富性。玫瑰花添加量過多，香味過于突出，與茶香搭配不協(xié)調(diào)，且澀味明顯；玫瑰花添加量過少，飲料香味以發(fā)酵味為主，缺乏復(fù)合飲料特征香味。由圖7可知，隨著普洱茶浸提液添加量和葡萄籽浸提液添加量的增多，復(fù)合飲料感官評分先增加，后減小。普洱茶添加量15%、葡萄籽浸提液添加量5%時，感官評分為85分。兩因素等高線近似圓形，表明普洱茶浸提液添加量與葡萄籽浸提液添加量（AC）交互作用對復(fù)合飲料感官評分的影響不顯著。葡萄籽添加過多，飲料悶熟味明顯、澀味突出；葡萄籽添加過少，飲料滋味不夠飽滿。由圖8可知，等高線呈近圓形，表明普洱茶浸提液添加量與山楂浸提液添加量（AD）交互作用對復(fù)合飲料感官評分無明顯影響。山楂添加過多，飲料酸味突出，適口性差；山楂添加過少，飲料滋味不夠豐富，稍顯單薄。由圖9可知，等高線呈近圓形，表明玫瑰花冷萃液添加量與葡萄籽浸提液添加量（BC）交互作用對復(fù)合飲料感官評分的影響不顯著。由圖10可知，等高線近似橢圓形，說明玫瑰花冷萃液添加量與山楂浸提液添加量（BD）交互作用對復(fù)合飲料感官評分的影響優(yōu)于AB、AC、AD、BC，但效果仍不顯著。由圖11可知，葡萄籽浸提液添加量和山楂浸提液添加量等高線呈橢圓形，表明葡萄籽浸提液添加量與山楂浸提液添加量（CD）交互作用對復(fù)合飲料感官評分的影響顯著。

圖6 普洱茶浸提液和玫瑰花冷萃液添加量對復(fù)合飲料感官評分影響的響應(yīng)曲面及等高線Fig. 6 Response surface contour lines on sensory score of experimental beverage affected by Pu-erh tea extract and rose cold extract

圖7 普洱茶浸提液和葡萄籽浸提液添加量對復(fù)合飲料感官評分影響的響應(yīng)曲面及等高線Fig. 7 Response surface contour lines on sensory score of experimental beverage affected by Pu-erh tea and grape seed extracts

圖8 普洱茶浸提液和山楂浸提液添加量對復(fù)合飲料感官評分影響的響應(yīng)曲面及等高線Fig. 8 Response surface contour lines on sensory score of experimental beverage affected by Pu-erh tea and hawthorn extracts

圖9 玫瑰花冷萃液和葡萄籽浸提液添加量對復(fù)合飲料感官評分影響的響應(yīng)曲面及等高線Fig. 9 Response surface contour lines on sensory score of experimental beverage affected by rose cold extract and grape seed extract

圖10 玫瑰花冷萃液和山楂浸提液添加量對復(fù)合飲料感官評分影響的響應(yīng)曲面及等高線Fig. 10 Response surface contour lines on sensory score of experimental beverage affected by rose cold extract and hawthorn extract

圖11 葡萄籽浸提液和山楂浸提液添加量對復(fù)合飲料感官評分影響的響應(yīng)曲面及等高線Fig. 11 Response surface contour lines on sensory score of experimental beverage affected by grape seed and hawthorn extracts

2.4 最佳配方的確定及驗證試驗

經(jīng)過Design-Expert 13軟件分析，得出復(fù)合飲料最佳配方為普洱茶浸提液添加量14.09%，玫瑰花冷萃液添加量3.23%，葡萄籽浸提液添加量4.89%，山楂浸提液添加量0.92%，感官評分預(yù)測值為85.56分。為驗證所建立多元回歸模型的準(zhǔn)確性，同時確保試驗的可操作性，對配方進行如下修正：普洱茶浸提液添加量14.1%，玫瑰花冷萃液添加量3.2%，葡萄籽浸提液添加量4.9%，山楂浸提液添加量0.9%。通過3組平行試驗，得到復(fù)合飲料的感官評分平均值為85.6分，接近于預(yù)測值，說明該模型具有較高的預(yù)測準(zhǔn)確度。

2.5 質(zhì)量指標(biāo)檢測結(jié)果

2.5.1 感官分析結(jié)果

優(yōu)化后的復(fù)合飲料表現(xiàn)出色澤紅色，均勻明亮；狀態(tài)澄清透明，無沉淀、無異物；玫瑰花香顯著，與茶香融合，無異味；滋味酸甜適中，豐富協(xié)調(diào)。

2.5.2 理化指標(biāo)與微生物指標(biāo)

普洱茶玫瑰花葡萄籽復(fù)合飲料的理化指標(biāo)及微生物指標(biāo)如表5所示。其中復(fù)合飲料茶多酚含量為 327.75±7.10 mg·kg-1，咖啡因含量為 204.15±1.72 mg·kg-1，均符合 GB/T 21733—2008《茶飲料》中復(fù)合茶飲料規(guī)定；微生物指標(biāo)符合GB 7101—2015《飲料》中微生物限量。

表5 普洱茶玫瑰花葡萄籽復(fù)合飲料理化指標(biāo)及微生物指標(biāo)測定結(jié)果Table 5 Detection results of physical and chemical indexes and microbial indexes of Pu-erh tea rose grape seed compound beverage

2.6 抗氧化活性分析

普洱茶玫瑰花葡萄籽復(fù)合飲料的抗氧化活性如表6所示。其對DPPH自由基的清除能力達(dá)到65.17±1.28%，其清除ABTS自由基的能力與維生素C相當(dāng)，為98.78±0.15%。

表6 普洱茶玫瑰花葡萄籽復(fù)合飲料對2種自由基的清除率Table 6 The scavenging rate of Pu-erh tea rose grape seed compound beverage against two kinds of oxygen radicals

3 結(jié)論

通過單因素試驗和響應(yīng)面試驗對普洱茶玫瑰花葡萄籽復(fù)合飲料的配方工藝進行研究，結(jié)果表明最佳配比為普洱茶浸提液添加量14.1%、玫瑰花冷萃液添加量3.2%、葡萄籽浸提液添加量4.9%、枸杞浸提液添加量3%、山楂浸提液添加量0.9%。在此配比下，復(fù)合飲料色澤紅亮、澄清透明、花香顯著、酸甜適中，具有良好的風(fēng)味，感官評分達(dá) 85.6，茶褐素含量為 1 132.90±15.82 mg·kg-1，茶多酚含量為 327.75±7.10 mg·kg-1，咖啡因含量為204.15±1.72 mg·kg-1，沒食子酸含量為 18.10±0.02 mg·kg-1，多糖含量為 214.47±1.45 mg·kg-1，黃酮含量為 39.26±1.71 mg·kg-1。DPPH 自由基清除率65.17±1.28%，ABTS自由基清除率98.78±0.15%，具有較好的抗氧化活性。