趙玉紅，張磊，古彩喆，張東姣，楊衛(wèi)振

作者單位：1中國(guó)人民解放軍第八十二集團(tuán)軍醫(yī)院消化內(nèi)科，河北 保定 071000；2保定市第一中心醫(yī)院普外二科，河北 保定071000

結(jié)直腸癌其發(fā)病率和病死率在消化系統(tǒng)惡性腫瘤中一直居高不下，嚴(yán)重危害病人健康［1］。大量研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展受多種基因、多個(gè)因子共同調(diào)節(jié)［2-4］，探討結(jié)直腸癌生物標(biāo)志物表達(dá)水平與病人臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系，有助于盡早診斷結(jié)直腸癌，并采取針對(duì)性治療措施，改善預(yù)后。Y染色體性別決定區(qū)相關(guān)高速泳動(dòng)族框因子9（SOX9）是一種與人體早期胚胎發(fā)育有關(guān)的重要轉(zhuǎn)錄因子，越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn)其異常表達(dá)與人類(lèi)多種腫瘤如胃癌［5-6］、口腔鱗癌［7］等的發(fā)生發(fā)展及預(yù)后有關(guān)。通常認(rèn)為，腫瘤的發(fā)生與癌基因的激活、抑癌因子抑制或失活有關(guān)，其最終均體現(xiàn)在細(xì)胞周期異常上。周期素依賴性激酶4（CDK4）是細(xì)胞周期調(diào)控機(jī)制的重要相關(guān)蛋白，被認(rèn)為是治療惡性腫瘤的一個(gè)重要靶點(diǎn)，且具有一定特異性［8-9］。研究發(fā)現(xiàn)，CDK4 的激活依賴于細(xì)胞周期蛋白（cyclins），當(dāng)細(xì)胞異?；罨瘯r(shí)，細(xì)胞周期失控，癌細(xì)胞出現(xiàn)失控性增長(zhǎng)［10］。還有研究發(fā)現(xiàn)，SOX9 可通過(guò)影響CDK4的表達(dá)參與肺腺癌的發(fā)展過(guò)程［11］。但關(guān)于SOX9、CDK4 表達(dá)與結(jié)直腸癌的關(guān)系研究報(bào)道甚少，因此，本研究檢測(cè)SOX9、CDK4 在結(jié)直腸癌的表達(dá)情況，分析二者表達(dá)情況及與臨床病理的關(guān)系，討論其臨床意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料選取中國(guó)人民解放軍第八十二集團(tuán)軍醫(yī)院2015 年1 月至2017 年6 月收治的結(jié)直腸癌病人病理組織標(biāo)本（結(jié)直腸癌組）94 例及癌旁正常結(jié)直腸組織（正常結(jié)直腸組）39 例，另取同時(shí)期結(jié)直腸息肉病人結(jié)直腸息肉組織（結(jié)直腸息肉組）51例，所有組織標(biāo)本均用4%中性甲醛固定，常規(guī)脫水，采用石蠟包埋。納入標(biāo)準(zhǔn)：①均接受根治術(shù)治療；②結(jié)直腸癌病人術(shù)前均未接受放、化療；③臨床資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并其他惡性腫瘤；②合并急、慢性感染性疾??；③合并免疫系統(tǒng)疾病病人。94例結(jié)直腸癌中，男61例，女33例；年齡范圍39～80歲，中位年齡64 歲，＜60 歲41 例，≥60 歲53 例；結(jié)腸癌46例，直腸癌48例；低分化癌32例，中、高分化癌62 例；腫瘤分期Ⅰ+Ⅱ期39 例，Ⅲ+Ⅳ期55 例；合并淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移52 例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移42 例。結(jié)直腸息肉病人中，男32 例，女19 例；年齡范圍40～78 歲，中位年齡62歲。結(jié)直腸癌和結(jié)直腸息肉病人的性別、年齡比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。病人或其近親屬知情同意并簽署知情同意書(shū)，本研究經(jīng)中國(guó)人民解放軍第八十二集團(tuán)軍醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核通過(guò)（批號(hào)14001251）。

1.2 主要試劑和方法兔抗人多克隆抗體SOX9（美國(guó)R&D 公司），一抗工作濃度為1∶200；兔抗人抗體CDK4（北京百奧萊博科技有限公司），稀釋濃度1∶100。將組織以4 μm 切片，充分烘烤后采用免疫組織化學(xué)SP染色法檢測(cè)結(jié)直腸癌組織、結(jié)直腸息肉組織和正常結(jié)直腸組織SOX9、CDK4 的表達(dá)。免疫組化Envision 染色法按照試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟進(jìn)行。利用磷酸緩沖鹽溶液代替一抗作為陰性對(duì)照。

1.3 結(jié)果判定SOX9 陽(yáng)性表達(dá)主要定位于細(xì)胞核，CDK4 陽(yáng)性表達(dá)主要定位于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)，以細(xì)胞染色強(qiáng)度和陽(yáng)性表達(dá)百分比得分乘積進(jìn)行判定。隨機(jī)選取5個(gè)高倍鏡視野進(jìn)行評(píng)分：（1）按細(xì)胞染色強(qiáng)度評(píng)分：細(xì)胞不著色為0 分，淡黃色為1 分，黃色或黃棕色為2 分，棕褐色為3 分；（2）按陽(yáng)性細(xì)胞所占百分比評(píng)分：陽(yáng)性細(xì)胞＜5%為0分，陽(yáng)性細(xì)胞≥5%～25%為1分，陽(yáng)性細(xì)胞≥25%～50%為2分，陽(yáng)性細(xì)胞≥50%為3分。兩項(xiàng)評(píng)分的乘積即為最終得分，若得分≥3 則認(rèn)為表達(dá)陽(yáng)性（+），否則判斷為陰性（-）。同時(shí)將得分≥4 分定義為高表達(dá)，＜4 分定義為低表達(dá)。

1.4 蛋白質(zhì)印跡法分析加入苯甲基磺酰氟（PMSF）：放射免疫沉淀法裂解液（天津?yàn)榭粕锛夹g(shù)有限公司，稀釋濃度1∶250）裂解組織，從組織中提取蛋白質(zhì)。在離心機(jī)中離心（12 000g，4 ℃）10 min 后，通過(guò)12%的聚丙烯酰胺凝膠電泳分離上清液，并轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上，轉(zhuǎn)膜結(jié)束后封閉、洗膜，隨后加入兔抗人SOX9、CDK4、β 肌動(dòng)蛋白（β-actin）抗體（稀釋濃度1∶800）4 ℃孵育過(guò)夜，再次洗膜后加入二抗（稀釋濃度1∶5 000）室溫孵育1 h，洗滌后曝光、顯色。使用Quantity One 軟件評(píng)估SOX9、CDK4 蛋白的表達(dá)水平。

1.5 隨訪復(fù)查對(duì)于臨床病理診斷早期病人在術(shù)后3、6、12個(gè)月進(jìn)行定期復(fù)查隨訪，之后每年進(jìn)行一次；中晚期病人術(shù)后每3個(gè)月進(jìn)行一次復(fù)查隨訪，完成3 年隨訪后可每6 個(gè)月一次。本研究隨訪時(shí)間從確診之日起，到2020年7月1日止，中位隨訪時(shí)間為23 個(gè)月。比較不同SOX9、CDK4 表達(dá)情況結(jié)直腸癌病人生存情況。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法利用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)錄入與分析，計(jì)量資料用表示，三組間比較行單因素方差分析，有差異時(shí)采用SNK-q檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料用例（%）表示，行χ2檢驗(yàn)。結(jié)直腸癌組織中SOX9、CDK4 表達(dá)相關(guān)性用Pearson 法；生存分析用Kaplan-Meier 法，組間生存曲線差別用對(duì)數(shù)秩檢驗(yàn)（log-rank test）。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SOX9、CDK4 免疫組化染色結(jié)果SOX9、CDK4 在正常結(jié)直腸組織、結(jié)直腸息肉組織和結(jié)直腸癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)率分別為10.26%（4∕39）、27.45%（14∕51）、76.59%（72∕94），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表1。

表1 SOX9、CDK4在正常結(jié)直腸組織、結(jié)直腸息肉組織和結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)情況∕例（%）

2.2 SOX9、CDK4 蛋白表達(dá)水平比較正常結(jié)直腸組織中SOX9、CDK4 蛋白表達(dá)水平低于結(jié)直腸息肉組織、結(jié)直腸癌組織（P＜0.05），結(jié)直腸息肉組織中SOX9、CDK4 蛋白表達(dá)水平低于結(jié)直腸癌組織（P＜0.05）。見(jiàn)表2。

表2 SOX9、CDK4蛋白在正常結(jié)直腸組織、結(jié)直腸息肉組織和結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)情況∕例（%）

2.3 SOX9、CDK4 表達(dá)與結(jié)直腸癌病人臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系結(jié)直腸癌病人病理組織SOX9、CDK4 表達(dá)與病人年齡、性別、腫瘤類(lèi)型差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），與腫瘤分化程度、臨床分期、是否合并淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)（P＜0.05），見(jiàn)表3。

表3 SOX9、CDK4表達(dá)與結(jié)直腸癌病人臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系∕例

2.4 結(jié)直腸癌組織中SOX9、CDK4 表達(dá)相關(guān)性結(jié)直腸癌組織中SOX9 與CDK4 表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.58，P＜0.001），見(jiàn)圖1。由TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)檢索結(jié)直腸癌組織SOX9、CDK4 基因表達(dá)相關(guān)性顯示，二者之間亦呈正相關(guān)（r=0.40，P＜0.001），見(jiàn)圖2。

圖1 結(jié)直腸癌組織中SOX9（Y染色體性別決定區(qū)相關(guān)高速泳動(dòng)族框因子9）、CDK4（周期素依賴性激酶4）表達(dá)相關(guān)性

圖2 TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中結(jié)直腸癌組織SOX9（Y染色體性別決定區(qū)相關(guān)高速泳動(dòng)族框因子9）、CDK4（周期素依賴性激酶4）基因表達(dá)相關(guān)性

2.5 SOX9、CDK4 不同表達(dá)情況的結(jié)直腸癌病人生存分析94 例結(jié)直腸癌生存50 例，死亡44 例。繪制術(shù)后1～36 個(gè)月SOX9、CDK4 高表達(dá)、低表達(dá)病人的生存曲線。SOX9 高表達(dá)病人術(shù)后3 年累積生存率為44.6%，低表達(dá)病人術(shù)后3 年累積生存率為72.4%，兩組比較Log-rank 檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=8.31，P=0.004）。CDK4 高表達(dá)病人術(shù)后3 年累積生存率為25.6%，低表達(dá)病人術(shù)后3 年累積生存率為76.5%，兩組比較Log-rank 檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=36.36，P＜0.001）。

3 討論

近年來(lái)，中國(guó)居民結(jié)直腸癌的發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)，每年新發(fā)病例近37.6 萬(wàn)人，大城市增加尤為明顯［12］。臨床研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)直腸癌在初診時(shí)約20%～25%已發(fā)展為伴有轉(zhuǎn)移的晚期結(jié)直腸癌，嚴(yán)重威脅病人生命［13］。早期診斷、及時(shí)手術(shù)是改善結(jié)直腸癌病人生存率的重要途徑。尋找早期預(yù)測(cè)結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展的生物學(xué)指標(biāo)是目前研究的熱點(diǎn)。多項(xiàng)研究報(bào)道稱［14-15］，SOX9 在多種癌癥中均有差異性表達(dá)，被稱為癌基因，并且其在癌組織中表達(dá)上調(diào)提示預(yù)后不良［16］。本研究結(jié)果顯示，在結(jié)腸癌組織、結(jié)腸息肉組織和正常結(jié)腸組織中，SOX9 表達(dá)依次降低，表明高表達(dá)SOX9 與癌癥發(fā)生有關(guān)。臨床病理參數(shù)結(jié)果顯示，腫瘤分化程度低、臨床分期Ⅲ+Ⅳ、合并淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的結(jié)直腸癌病人腫瘤組織中SOX9 高表達(dá)比例較高，提示SOX9 可能參與結(jié)直腸癌分化、轉(zhuǎn)移進(jìn)程。生存分析結(jié)果顯示，SOX9 高表達(dá)病人3年累積生存率明顯低于低表達(dá)，提示SOX9高表達(dá)病人預(yù)后差，與其他學(xué)者發(fā)現(xiàn)一致［17］。最近有研究發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)鏈非編碼RNA（LncRNA）肺腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子（MALAT1）可通過(guò)下調(diào)miRNA-145（miR-145）和上調(diào)SOX9 來(lái)促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移，揭示了LncRNA MALAT1∕miR-145∕SOX9 軸在結(jié)直腸癌中的調(diào)控作用［18］。另有報(bào)道稱，癌基因SOX9 通過(guò)直接與叉頭盒轉(zhuǎn)錄因子K2（FOXK2）啟動(dòng)子結(jié)合調(diào)控FOXK2 上調(diào)，而FOXK2在結(jié)直腸癌組織中轉(zhuǎn)錄激活，其高表達(dá)與生存率低顯著相關(guān)［19］。因此，推測(cè)SOX9 可能通過(guò)參與或激活某種通路基因表達(dá)來(lái)參與結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展進(jìn)程，并與病人預(yù)后不良有關(guān)。

大量研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞周期進(jìn)程受一系列細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶（CDKs）及其激活因子Cyclins 的調(diào)控［20］。CDK4 作為CDKs 家族中的一員，通過(guò)與CyclinD1 結(jié)合形成CyclinD1-CDK4 復(fù)合物，參與抑制Rb蛋白磷酸化進(jìn)程，在細(xì)胞周期進(jìn)展過(guò)程中起重要調(diào)控作用［21-22］。本研究結(jié)果顯示，CDK4在結(jié)直腸癌組織、結(jié)直腸息肉組織及結(jié)直腸正常組織中表達(dá)逐漸降低，其表達(dá)水平與結(jié)直腸癌病人腫瘤分化程度、臨床分期、是否合并淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，提示CDK4 可能參與結(jié)直腸癌細(xì)胞分化、侵襲過(guò)程，且高表達(dá)與病人預(yù)后差有關(guān)。國(guó)外學(xué)者Rahman 等［23］從基因綜合表達(dá)的兩個(gè)微陣列數(shù)據(jù)集中篩選診斷結(jié)直腸癌的分子生物標(biāo)志物及藥物靶向定位，其中CDK4 是10 個(gè)中樞蛋白之一，同時(shí)也是9 個(gè)有針對(duì)性的藥物靶標(biāo)之一。另有研究發(fā)現(xiàn)［24］，CDK4 是miR-142-3p 的潛在靶點(diǎn)，細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證實(shí)miR-142-3p模擬物和抑制物可分別降低和升高結(jié)直腸癌細(xì)胞中的CDK4蛋白表達(dá)，表明miR-142-3p可靶向CDK4抑制結(jié)直腸癌腫瘤細(xì)胞的增殖。報(bào)道稱，p16-CDK4∕6-Rb-E2F 通路失調(diào)是癌癥發(fā)生的標(biāo)志，CDK4和CDK6 是該通路中的致癌激酶，被證實(shí)為抗癌靶點(diǎn)，任何原因?qū)е缕洚惓８弑磉_(dá)時(shí)，均會(huì)引起細(xì)胞周期失控，導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生及惡化［25］。根據(jù)上述觀點(diǎn)總結(jié)認(rèn)為，CDK4 可能通過(guò)參與激活腫瘤通路或者受miRNA 靶向作用調(diào)控結(jié)直腸癌的發(fā)生、進(jìn)展。研究顯示，SOX9 和CDK4 在肺腺癌腫瘤組織中均升高，SOX9 可通過(guò)正調(diào)節(jié)CDK4 在腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)中發(fā)揮協(xié)同作用［11］。本研究相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，結(jié)直腸癌組織中SOX9 與CDK4 表達(dá)呈正相關(guān)，且經(jīng)TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)檢索結(jié)果發(fā)現(xiàn)，結(jié)直腸癌組織中SOX9、CDK4基因表達(dá)亦呈正相關(guān)，提示二者可能通過(guò)不同途徑作用參與腫瘤的病理進(jìn)程，具體作用方式及機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，SOX9、CDK4在結(jié)直腸癌組織中均呈高表達(dá)，二者表達(dá)水平與腫瘤分化程度、臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況及病人預(yù)后有關(guān)，表明SOX9、CDK4參與結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程，可能成為臨床評(píng)價(jià)結(jié)直腸癌病情及預(yù)后的潛在生物指標(biāo)。結(jié)直腸癌的發(fā)生受多種因子、多個(gè)通路共同影響，后續(xù)還需通過(guò)細(xì)胞或動(dòng)物等基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步探討其具體作用機(jī)制。