孫天馳，董詩(shī)慧，余佳琰，裘芳瓊，秦路平，朱 波

（浙江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，浙江 杭州 311402）

白術(shù)為菊科蒼術(shù)屬多年生草本植物白術(shù)（Atractylodes macrocephalaKoidz.）的干燥根莖，是常用大宗中藥材，浙江著名道地藥材“浙八味”之一，白術(shù)味甘、微辛，歸脾、胃經(jīng)，功效為健脾益氣，燥濕利水，止汗，安胎[1]。現(xiàn)代藥理研究表明，白術(shù)富含白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ，蒼術(shù)酮以及多糖類等多種活性成分，對(duì)抗腫瘤、抗炎、胃腸調(diào)節(jié)功能和降低胰島素水平等方面具有積極作用[2]。白術(shù)在臨床藥理上有著廣闊的開發(fā)前景與應(yīng)用市場(chǎng)。

植物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)是指將植物的細(xì)胞聚集體懸浮在液體培養(yǎng)基中進(jìn)行體外培養(yǎng)的技術(shù)[3]，與栽培植物相比，植物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)具有生產(chǎn)可控、無(wú)污染、產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)[4]。目前，國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)部分藥用植物進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，獲得了重要的藥用成分，如小蘗堿、丹參酮、喜樹堿等[5]。

真菌誘導(dǎo)子是一類能誘導(dǎo)植物細(xì)胞產(chǎn)生次生代謝產(chǎn)物的活性物質(zhì)，誘導(dǎo)子通過信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，引起相關(guān)基因表達(dá)發(fā)生變化，從而調(diào)節(jié)次級(jí)代謝產(chǎn)物合成途徑中相關(guān)酶活性，誘導(dǎo)特定次級(jí)代謝產(chǎn)物積累[6]。張長(zhǎng)平等[7]將尖孢鐮刀菌胞壁成分的粗提物接入南方紅豆杉中，誘導(dǎo)后第4 天，紫杉醇（Taxol）產(chǎn)量提高了5倍左右，達(dá)到67 mg/L。張順倉(cāng)等[8]對(duì)丹參接入誘導(dǎo)子后使其顯著提高了酚酸類、丹參酮類物質(zhì)含量。劉瑞等[9]在大豆懸浮培養(yǎng)細(xì)胞中接入青霉和黑曲霉誘導(dǎo)子后，其異黃酮含量發(fā)生了明顯變化。KHOSROUSHAHI 等[10]通過誘導(dǎo)因子的組合分析發(fā)現(xiàn)，采用分階段培養(yǎng)和混合誘導(dǎo)的方式可大幅度提高紫杉醇的含量。目前，未見對(duì)于內(nèi)生真菌誘導(dǎo)子促進(jìn)白術(shù)懸浮細(xì)胞生長(zhǎng)和次生代謝產(chǎn)物積累的研究報(bào)道。鑒于此，擬通過構(gòu)建白術(shù)懸浮細(xì)胞培養(yǎng)體系，以白術(shù)內(nèi)生真菌為誘導(dǎo)子，研究其對(duì)白術(shù)懸浮細(xì)胞中活性成分積累的影響，為其擴(kuò)大化生產(chǎn)提供參考。

1 材料和方法

1.1 白術(shù)無(wú)菌苗制備

白術(shù)種子采自浙江省紹興市新昌縣。將白術(shù)種子在黑暗條件下用無(wú)菌水浸泡12 h，剝?nèi)ネ夥N皮并包入滅菌紗布中，依次用75%乙醇浸泡1 min、用2.5%次氯酸鈉浸泡3 min、用75%乙醇浸泡30 s，再用無(wú)菌水清洗4～5 次，至洗滌后的無(wú)菌水不再呈黃綠色。取出白術(shù)種子置于無(wú)菌濾紙上，吸干水分置于MS 培養(yǎng)基，在（25±1）℃、光照/黑暗為16 h/8 h、光照強(qiáng)度2 500 lx的無(wú)菌室中培養(yǎng)，獲得白術(shù)無(wú)菌苗。

1.2 白術(shù)愈傷組織誘導(dǎo)

以莖尖為外植體，分別接種到激素配比為編號(hào)1[6-BA（6-芐氨基嘌呤）1.0 mg/L+NAA（1-萘乙酸）0.5 mg/L]、編號(hào)2 [6-KT（6-糠氨基嘌呤）1.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L] 和編號(hào)3（6-BA 0.5 mg/L+6-KT 0.5 mg/L+NAA 0.5 mg/L）的MS 固體培養(yǎng)基，每瓶接種3塊外植體，在（25±1）℃、光照/黑暗為16 h/8 h、光照強(qiáng)度2 500 lx 下培養(yǎng)，接種41 d 后統(tǒng)計(jì)愈傷組織生長(zhǎng)情況，計(jì)算誘導(dǎo)率（誘導(dǎo)出的愈傷數(shù)/接種的外植體數(shù)×100%）。

1.3 白術(shù)愈傷組織增殖培養(yǎng)基篩選

將誘導(dǎo)的愈傷組織均勻切分，稱質(zhì)量并分別放入A（6-BA 0.1 mg/L+NAA 0.1 mg/L）、B（6-BA 0.1 mg/L+NAA 0.2 mg/L）、C（6-BA 0.1 mg/L+NAA 0.5 mg/L）、D（6-BA 0.5 mg/L）+NAA 0.1 mg/L）、E（6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.2 mg/L）、F（6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.5 mg/L）、G（6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L）、H（6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L）、I（6-BA 2.0 mg/L+NAA 1.0 mg/L）共9 組增殖培養(yǎng)基中。每瓶接種3塊愈傷組織，在（25±1）℃、光照/黑暗為16 h/8 h、光照強(qiáng)度2 500 lx 條件下增殖培養(yǎng)，繼代21 d 后觀察愈傷組織大小、疏松度，以“-、+、++、+++”表示褐化程度，并稱質(zhì)量，計(jì)算增殖系數(shù)（繼代后成活愈傷鮮質(zhì)量/初代愈傷鮮質(zhì)量）、褐化率（褐化愈傷組織塊數(shù)/愈傷組織總塊數(shù)）。

1.4 白術(shù)懸浮細(xì)胞培養(yǎng)體系構(gòu)建

以MS 液體培養(yǎng)基（不含瓊脂）為基本培養(yǎng)基，加入前期篩選得到的白術(shù)愈傷增殖的最佳激素配方，將pH 值調(diào)至5.8，滅菌備用。選取6 次繼代后疏松、白透的愈傷組織，無(wú)菌條件下將其用鑷子和解剖刀剪碎，接入MS 液體培養(yǎng)基，于25 ℃、110 r/min條件下振蕩暗培養(yǎng)。每3 d 取出適量懸浮細(xì)胞用孔徑0.45 mm 篩網(wǎng)過濾，烘干后稱取干質(zhì)量，并測(cè)定培養(yǎng)液pH值，試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5 真菌誘導(dǎo)子制備

以浙江中醫(yī)藥大學(xué)植物內(nèi)生菌課題組保存的白術(shù)內(nèi)生真菌AM60、AM229、AM288、AM393、AM450、AM474、AM478、AM481、AM569 為菌種材料，將菌株接種于PDA 培養(yǎng)基（馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基）活化5～7 d后，每個(gè)菌株打孔10個(gè)菌餅并接種到經(jīng)120 ℃高壓滅菌20 min 的PDB 培養(yǎng)基（馬鈴薯葡萄糖水培養(yǎng)基）中，以26 ℃、150 r/min搖床振蕩培養(yǎng)至濃稠。取出培養(yǎng)物進(jìn)行減壓抽濾，得到菌絲提取物。用無(wú)菌水清洗菌絲提取物，在50 ℃烘干后用勻漿機(jī)粉碎，加入適量無(wú)菌水懸浮，用無(wú)菌過濾器過濾，配制成終質(zhì)量濃度為2 mg/mL 的無(wú)菌誘導(dǎo)子溶液，待用。以不接種為空白對(duì)照（CK）。

1.6 懸浮細(xì)胞鮮質(zhì)量與次生代謝產(chǎn)物含量測(cè)定

將無(wú)菌誘導(dǎo)子溶液添加至白術(shù)懸浮細(xì)胞體系，接種量為1 mg/mL，以26 ℃、150 r/min 振蕩培養(yǎng)15 d后取出。用純水將懸浮細(xì)胞充分清洗，去除殘留培養(yǎng)液，減壓抽濾，在濾紙上吸干表面水分，稱質(zhì)量。將懸浮細(xì)胞于60 ℃烘干至恒質(zhì)量。用研缽碾成粉末，并稱取樣品各5 mg，加200 μL 甲醇，靜置30 min，稱質(zhì)量。26 ℃恒溫超聲提取30 min，用甲醇補(bǔ)足差質(zhì)量，過濾，取適量濾液過0.45 μm 微孔濾膜，待測(cè)。白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、白術(shù)內(nèi)脂Ⅲ與蒼術(shù)酮含量測(cè)定參考丁逸雪等[11]的方法。

1.7 數(shù)據(jù)處理

使用Excel 2010、SPSS 25 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析和繪圖，采用Duncan’s新復(fù)極差法進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 激素對(duì)白術(shù)愈傷組織培養(yǎng)的影響

以MS 為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，比較6-BA、6-KT、NAA 3種激素及其不同質(zhì)量濃度配比對(duì)白術(shù)愈傷組織培養(yǎng)的影響發(fā)現(xiàn)，MS + 6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L的配比優(yōu)于其他組合，愈傷組織誘導(dǎo)率最高，達(dá)46.88%，詳見表1。同時(shí)，以MS作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，比較6-BA、NAA 2種激素在不同質(zhì)量濃度組合下對(duì)愈傷組織增殖的影響（表2）發(fā)現(xiàn)，6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.5 mg/L處理效果最好，增殖系數(shù)達(dá)到4.51，與大多數(shù)處理存在顯著差異且培育出的愈傷組織較疏松、顆粒狀，其余處理在21 d 內(nèi)的增殖效果不明顯或褐化率較高。

表1 不同激素對(duì)白術(shù)愈傷組織誘導(dǎo)的影響Tab.1 Effect of different hormones on callus induction ofAtractylodes macrocephala

表2 不同激素對(duì)白術(shù)愈傷組織增殖的影響Tab.2 Effect of different hormones on the proliferation ofAtractylodes macrocephalacallus

2.2 白術(shù)懸浮細(xì)胞體系生長(zhǎng)曲線

培養(yǎng)期內(nèi)，白術(shù)懸浮細(xì)胞干質(zhì)量表現(xiàn)為S 形曲線趨勢(shì)，表明白術(shù)懸浮細(xì)胞生長(zhǎng)呈現(xiàn)S 形特征（圖1）。其中，0～6 d 為白術(shù)懸浮細(xì)胞緩慢生長(zhǎng)期；6～21 d為白術(shù)懸浮細(xì)胞對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期；培養(yǎng)至24 d，形成穩(wěn)定的懸浮細(xì)胞體系，白術(shù)懸浮細(xì)胞進(jìn)入生長(zhǎng)穩(wěn)定期。

圖1 白術(shù)懸浮細(xì)胞生長(zhǎng)曲線Fig.1 Growth curve ofAtractylodes macrocephalasuspension cells

白術(shù)懸浮細(xì)胞培養(yǎng)液的初始pH 值為5.8，在剛接入懸浮細(xì)胞時(shí)pH 值呈下降趨勢(shì)，在6～21 d 對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期間，pH 值保持在4.8～5.0。在24 d 懸浮細(xì)胞生長(zhǎng)進(jìn)入生長(zhǎng)穩(wěn)定期后，pH值緩慢上升后趨于穩(wěn)定（圖2）。

圖2 白術(shù)懸浮細(xì)胞培養(yǎng)液pH值變化Fig.2 Change of pH value in culture medium ofAtractylodes macrocephalasuspension cells

2.3 不同誘導(dǎo)子對(duì)白術(shù)懸浮細(xì)胞生長(zhǎng)的影響

真菌誘導(dǎo)子處理下白術(shù)懸浮細(xì)胞生長(zhǎng)情況存在差異（表3）。與CK 相比，AM478誘導(dǎo)子對(duì)白術(shù)懸浮細(xì)胞生長(zhǎng)促進(jìn)作用最為顯著，愈傷組織鮮質(zhì)量達(dá)0.054 9 g，是CK 的2.19倍，整體培養(yǎng)液呈淡黃色，澄清，懸浮細(xì)胞黃褐色，生長(zhǎng)勢(shì)較好；其次是AM393誘導(dǎo)子處理，愈傷組織鮮質(zhì)量達(dá)0.045 0 g，是CK 的1.79倍。

表3 不同誘導(dǎo)子處理組白術(shù)懸浮細(xì)胞鮮質(zhì)量與有效成分含量比較Tab.3 Comparison of fresh weight and active ingredients inAtractylodes macrocephalasuspension cells after treated by different elicitors

2.4 不同誘導(dǎo)子對(duì)白術(shù)懸浮細(xì)胞次生代謝的影響

供試誘導(dǎo)子對(duì)白術(shù)懸浮細(xì)胞白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ含量積累沒有顯著性影響，但對(duì)白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ與蒼術(shù)酮含量積累具有顯著促進(jìn)作用（表3）。與CK 相比，AM569 誘導(dǎo)子顯著促進(jìn)白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ積累，含量達(dá)0.023 5 mg/g。與CK 相比，AM60、AM229、AM450、AM474、AM478、AM481、AM569 對(duì)白術(shù)懸浮細(xì)胞蒼術(shù)酮均有顯著促進(jìn)作用，其中AM474 促進(jìn)效果最好，其蒼術(shù)酮含量達(dá)0.673 8 mg/g，是CK 的1.62 倍；其次為AM478 與AM569，分別為CK 的1.53、1.45倍。綜上，AM569 誘導(dǎo)子處理效果最好，可作為后續(xù)白術(shù)懸浮細(xì)胞生物轉(zhuǎn)化的備選誘導(dǎo)子。

3 結(jié)論與討論

白術(shù)是傳統(tǒng)大宗藥材，藥用價(jià)值較高，臨床應(yīng)用廣泛，具有改善潰瘍性結(jié)腸炎[12]、免疫調(diào)節(jié)[13]、促進(jìn)糖脂代謝[14]、抗腫瘤[15]等多種藥理活性。白術(shù)的廣泛應(yīng)用對(duì)藥材本身質(zhì)量和有效成分產(chǎn)量有一定要求，如何提高白術(shù)有效成分積累成為關(guān)鍵點(diǎn)。本研究基于白術(shù)懸浮細(xì)胞培養(yǎng)體系，探討不同真菌誘導(dǎo)子對(duì)白術(shù)懸浮細(xì)胞生長(zhǎng)及其次生代謝產(chǎn)物積累的影響，為白術(shù)藥效成分的獲得及遺傳轉(zhuǎn)化體系建立提供參考依據(jù)。

生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素的種類及濃度是誘導(dǎo)愈傷組織的關(guān)鍵因素[16]。本研究結(jié)果表明，含6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L 的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基愈傷組織誘導(dǎo)率高。同時(shí)，選擇細(xì)胞分裂素6-BA 和生長(zhǎng)素NAA 進(jìn)行不同質(zhì)量濃度配比試驗(yàn)，根據(jù)愈傷組織狀態(tài)、增殖系數(shù)、褐化狀態(tài)和褐化率，6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.5 mg/L 處理增殖效果最佳，愈傷呈綠色、增殖系數(shù)最高為4.51 且無(wú)褐化現(xiàn)象。在該激素配比下，懸浮培養(yǎng)的白術(shù)細(xì)胞生長(zhǎng)呈S 形曲線增長(zhǎng)，0～6 d 為緩慢生長(zhǎng)期，6～21 d 為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，21～30 d 為生長(zhǎng)穩(wěn)定期。在粗毛淫羊藿[17]、白及[18]、金蕎麥[19]的研究中，由懸浮細(xì)胞干質(zhì)量繪制而成的生長(zhǎng)曲線均為S形曲線，與本研究結(jié)果一致。

培養(yǎng)液的pH 值是反映細(xì)胞生長(zhǎng)的另一個(gè)重要指標(biāo)。細(xì)胞緩慢生長(zhǎng)期pH 值下降，對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期pH值穩(wěn)定、波動(dòng)小，生長(zhǎng)穩(wěn)定期pH 值上升。吳良等[20]關(guān)于劍麻懸浮細(xì)胞的研究中，pH值的變化與白術(shù)懸浮細(xì)胞pH 值的變化相似，在緩慢生長(zhǎng)期和生長(zhǎng)穩(wěn)定期都處于較高值，對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期先下降后緩慢上升，處于較低值。丁蘭等[21]關(guān)于半夏懸浮細(xì)胞的研究結(jié)果與本研究結(jié)果不同，半夏懸浮細(xì)胞是在細(xì)胞密度上升期pH 值升高，隨著細(xì)胞衰老代謝緩慢，細(xì)胞密度下降期pH 值也相應(yīng)下降。郭紫娟[22]關(guān)于白背三七懸浮細(xì)胞的研究中，pH值先短時(shí)間內(nèi)下降然后緩慢上升，這可能是由于該懸浮細(xì)胞在培養(yǎng)后期分泌堿性次生代謝產(chǎn)物所致。

真菌誘導(dǎo)子可以對(duì)懸浮細(xì)胞培養(yǎng)物、植物無(wú)菌苗等生長(zhǎng)產(chǎn)生顯著影響，可以誘導(dǎo)培養(yǎng)物中積累次生代謝產(chǎn)物[23]。揮發(fā)油是白術(shù)主要藥用成分，揮發(fā)油含量的高低在一定程度上影響白術(shù)的藥用價(jià)值[24]。本研究結(jié)果表明，與CK 相比，AM478 真菌誘導(dǎo)子和AM393 真菌誘導(dǎo)子對(duì)懸浮細(xì)胞生長(zhǎng)具有顯著促進(jìn)作用，AM569 真菌誘導(dǎo)子對(duì)白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ與蒼術(shù)酮的含量積累具有顯著促進(jìn)作用。綜合考量，AM569 真菌誘導(dǎo)子可作為白術(shù)懸浮細(xì)胞次生代謝產(chǎn)物生物合成的候選誘導(dǎo)子，具有較大的開發(fā)應(yīng)用價(jià)值。