王祥雨，徐新奧，陳 鑫，詹婧嫻，祝方清

（湖北大學(xué)知行學(xué)院糧食與食品工程學(xué)院，湖北武漢 430011）

果膠作為一種天然的植物細(xì)胞壁多糖，占橙皮干質(zhì)量的10%~30%。其作為一種聚合物，通常以原果膠、果膠和果膠酸的形式存在于橙皮類水果中[1]。根據(jù)天然果膠酯化度的高低程度，其還可大致分為高酯果膠、低酯果膠和半低酯酰胺化度果膠[2]。果膠具有促進(jìn)體內(nèi)胃腸黏膜蠕動(dòng)、促進(jìn)胃腸營(yíng)養(yǎng)分解吸收等功能作用，對(duì)高血壓、腸癌、糖尿病癥和老年肥胖癥均有較好的調(diào)理效果[3]。在化妝品行業(yè)中，果膠還可保護(hù)皮膚免受陽(yáng)光紫外線輻射、愈合創(chuàng)口和美容美顏等功能。

橙皮是橙子罐頭制作中的主要副產(chǎn)物，占橙子的總質(zhì)量25%~40%。2022 年我國(guó)橙子總產(chǎn)量大約為750 萬(wàn)t，約占全球總產(chǎn)量的1/7。在橙皮當(dāng)中，含有豐富純天然的有益成分，如橙皮苷、果膠、檸檬酸等[4]。近年來(lái)，人們對(duì)天然產(chǎn)物資源的可持續(xù)發(fā)展觀正在不斷增強(qiáng)，橙皮的開(kāi)發(fā)利用受到了廣泛的重視。大部分橙皮可被用于動(dòng)物的飼養(yǎng)或者將其進(jìn)行填埋處理，但作為動(dòng)物飼料可能會(huì)發(fā)生霉變、腐爛或產(chǎn)生異味，填埋也將帶來(lái)嚴(yán)重的環(huán)境污染問(wèn)題。因此，副產(chǎn)物橙皮的加工利用需要進(jìn)一步探討和研究。值得注意的是，橙皮中的果膠具有膠凝、抗癌和抗腹瀉等功效。若可提取果膠成分，將帶動(dòng)整個(gè)相關(guān)產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，實(shí)現(xiàn)經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益的提升。

果膠的提取過(guò)程是一個(gè)非水溶性果膠轉(zhuǎn)化為水溶性果膠、水溶性果膠進(jìn)而向液相轉(zhuǎn)移的過(guò)程[5]。傳統(tǒng)的果膠提取方法有酸萃取法、堿萃取法、鹽析法、微生物法、微波的輔助提取法、酶法和離子交換樹(shù)脂法等[6-8]，其中，酸萃取法是提取果膠方法中效率最高的方法之一。同時(shí)，超聲波輔助法提取果膠的提取率可達(dá)20%及以上，容易控制提取條件且污染小，但國(guó)內(nèi)該方法研究仍有發(fā)展空間，目前有關(guān)超聲波輔助酶法提取果膠的工藝研究也正在逐漸受到業(yè)內(nèi)人士的關(guān)注和重視[9-10]。因此，利用超聲波法輔助酶法提取酸性果膠。

以橙子作為研究對(duì)象，采用超聲波輔助酶法提取天然果膠，采用單因素試驗(yàn)及正交試驗(yàn)探究其最優(yōu)的果膠提取工藝。單因素試驗(yàn)的四因素分別為料液比、溶劑pH 值、超聲波浸提溫度和超聲波浸提時(shí)間，在該條件下得出最優(yōu)果膠提取率，并繪制曲線圖。正交試驗(yàn)即建立于單因素試驗(yàn)之上，獲得最佳工藝參數(shù)下的果膠提取率。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

材料：橙子；95%乙醇、檸檬酸鈉（分析純），國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司提供；纖維素酶，南寧龐博生物工程有限公司提供。。

儀器：FA1104 型分析天平，上海精科天平有限公司產(chǎn)品；SHA-B 型雙功能水浴恒溫鍋，常州國(guó)華電器有限公司產(chǎn)品；TG16G 型臺(tái)式高速離心機(jī)，常州市金壇高科儀器廠產(chǎn)品；UP500H 型超聲波清洗儀，南京壘君達(dá)超聲電子設(shè)備有限公司產(chǎn)品；D2X-6020B 型真空干燥箱，上海?，攲?shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司產(chǎn)品。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 果膠提取工藝流程

橙子清洗去皮→橙皮預(yù)處理（沸水去酶→切粒后熱水漂洗除去糖分和色素→瀝水后置于60 ℃烘箱干燥至恒重→粉碎后過(guò)90 目篩，備用） →高溫滅酶處理→橙皮粉與溶劑料液比配置、稀鹽酸調(diào)節(jié)pH 值以及控制超聲波的溫度和時(shí)間→超聲波輔助酶法提取→高溫滅酶處理→高速旋轉(zhuǎn)離心過(guò)濾處理→沉淀分離→分離提純處理→60 ℃烘箱干燥至恒重→獲得果膠成品，即可稱量計(jì)算。

1.2.2 橙皮原材料的預(yù)處理

選取新鮮橙子后，對(duì)其進(jìn)行清水漂洗取橙皮，將干凈橙皮置于水浴鍋中，升溫至90 ℃保持10 min，利用沸水漂洗；隨后，將橙皮切成2~3 mm 小顆粒，用熱水漂洗數(shù)次直至水流無(wú)色，除去水溶性色素和糖分等；橙皮顆粒洗凈后瀝干水分，將其均勻分散地放入60 ℃烘箱中。烘干后，將其用粉碎機(jī)粉碎，90 目過(guò)篩，將橙皮粉置于干燥器中，備用。

1.2.3 超聲波輔助酶法處理

稱取10.0 g 干燥的橙皮粉，先加入一定的料液比，再加入適量的纖維素酶。攪拌均勻后，利用檸檬酸緩沖液調(diào)節(jié)其pH 值，并在特定溫度下進(jìn)行超聲波處理。隨后，將溶液置于85~90 ℃水浴鍋中進(jìn)行水浴滅酶10 min。在25 ℃條件下，以轉(zhuǎn)速4 000 r/min離心10 min。取上清液，在攪拌的狀態(tài)下加入95%的無(wú)水乙醇，靜置30 min，待其析出絮狀沉淀，再以轉(zhuǎn)速4 000 r/min 離心10 min。取下層膠狀沉淀物質(zhì)，并置于60 ℃烘箱中進(jìn)行干燥至恒質(zhì)量，計(jì)算其果膠提取率。

1.2.4 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

單因素試驗(yàn)為五因素五水平試驗(yàn)，對(duì)各個(gè)因素的不同水平下果膠提取率的變化進(jìn)行記錄，在固定的超聲波儀器功率下，選取5 個(gè)因素（橙皮粉與溶劑的料液比、加酶量、溶液的pH 值、超聲波的浸提溫度和超聲波的浸提時(shí)間） 探究料液比（1∶10，1∶15，1∶20，1∶25，1∶30）、加酶量（0.03，0.05，0.07，0.09，0.11 g）、溶劑pH 值（4.1，4.3，4.5，4.7，4.9）、超聲波提取溫度（35，40，45，50，55 ℃）、超聲波提取時(shí)間（30，35，40，45，50 min） 對(duì)果膠提取率的影響，并繪制曲線圖。根據(jù)料液比、pH 值、提取溫度和提取時(shí)間對(duì)果膠提取率的影響，得出每個(gè)因素的最優(yōu)條件。

（1） 料液比對(duì)果膠提取率的影響。稱取10 g 橙皮粉，將橙皮粉與蒸餾水的料液比進(jìn)行梯度稀釋，加入0.07 g 纖維素酶，并用稀鹽酸將pH 值調(diào)至4.5，超聲波提取溫度為45 ℃，超聲波提取時(shí)間為40 min。超聲完成后，將其進(jìn)行高速離心，取上清液加入乙醇。靜置30 min 后，將析出的沉淀再次高速離心，取膠狀物進(jìn)行烘干，稱量并計(jì)算。分析料液比為1∶10，1∶15，1∶20，1∶25，1∶30 對(duì)果膠提取率的影響，并繪制曲線圖。

（2） 加酶量對(duì)果膠提取率的影響。稱取10 g 橙皮粉，選取最佳料液比1∶20。高溫滅酶冷卻后，加入一定量的纖維素酶，并用稀鹽酸將pH 值調(diào)至4.5，超聲波提取溫度為45 ℃，超聲波提取時(shí)間為40 min。超聲完成后，將其進(jìn)行高速離心，取上清液加入乙醇。靜置30 min 后，將析出的沉淀再次高速離心，取膠狀物進(jìn)行烘干，稱量并計(jì)算。分析纖維素酶含量為0.03，0.05，0.07，0.09 g 以及0.11 g 對(duì)果膠提取率的影響，并繪制曲線圖。

（3） pH 值對(duì)果膠提取率的影響。稱取10 g 橙皮粉，選取最佳料液比1∶20。高溫滅酶冷卻后，加入0.07 g 纖維素酶。將溶液pH 值調(diào)至一定條件，超聲波提取溫度為45 ℃，超聲波提取時(shí)間為40 min。超聲完成后，將其進(jìn)行高速離心，取上清液加入乙醇。靜置30 min 后，將析出的沉淀再次高速離心，取膠狀物進(jìn)行烘干，稱量并計(jì)算。分析溶液pH 值為4.1，4.3，4.5，4.7，4.9 對(duì)果膠提取率的影響，并繪制曲線。

（4） 提取溫度對(duì)果膠提取率的影響。稱取10 g橙皮粉，選取最佳料液比1∶20。高溫滅酶冷卻后，加入0.07 g 纖維素酶，并用稀鹽酸將pH 值調(diào)至4.5。將超聲波浸提溫度調(diào)至一定條件，超聲40 min。超聲完成后，將其進(jìn)行高速離心，取上清液加入乙醇。靜置30 min 后，將析出的沉淀再次高速離心，取膠狀物進(jìn)行烘干，稱量并計(jì)算。分析超聲波提取溫度為35，40，45，50，55 ℃對(duì)果膠提取率的影響，并繪制曲線圖。

（5） 提取時(shí)間對(duì)果膠提取率的影響。稱取10 g橙皮粉，選取最佳料液比1∶20。高溫滅酶冷卻后，加入0.07 g 纖維素酶。將溶液pH 值調(diào)至4.5，超聲波提取溫度為45 ℃，超聲波浸提時(shí)間調(diào)至一定時(shí)間。超聲完成后，將其進(jìn)行高速離心，取上清液加入乙醇。靜置30 min 后，將析出的沉淀再次高速離心，取膠狀物進(jìn)行烘干，稱量并計(jì)算。分析超聲波提取時(shí)間為30，35，40，45，50 min 對(duì)果膠提取率的影響，并繪制曲線圖。

1.2.5 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)優(yōu)化的基礎(chǔ)上，利用四因素三水平正交表L9（34）對(duì)橙皮粉與溶劑的加酶量、pH 值、超聲波浸取溫度和超聲波浸取時(shí)間進(jìn)行正交試驗(yàn)。

稱取10 g 橙皮粉，按照表1 配制料液比（1∶15，1∶20，1∶25）、溶劑pH 值（1.5，2.0，2.5）、超聲波提取溫度（60，70，80 ℃） 和超聲波提取時(shí)間（40，50，60 min），探究在互相影響情況下4 個(gè)因素對(duì)果膠提取率的影響，確定最優(yōu)提取工藝。

表1 正交試驗(yàn)的組合因素與水平設(shè)計(jì)

正交試驗(yàn)的組合因素與水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

2 結(jié)果與分析

2.1 果膠提取單因素試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1.1 料液比對(duì)果膠提取率的影響

料液比對(duì)果膠提取率的影響見(jiàn)表2，料液比對(duì)果膠提取率的影響見(jiàn)圖1。

圖1 料液比對(duì)果膠提取率的影響

表2 料液比對(duì)果膠提取率的影響

由圖1 可知，料液比為1∶10~1∶20（g∶mL）時(shí)，隨著料液比增加提取率逐漸增加；料液比為1∶20（g∶mL） 時(shí)，果膠提取率達(dá)到最大值；料液比為1∶20~1∶50（g∶mL） 時(shí)，隨著料液比增加提取率反而逐漸減少。這主要是料液比越小，果膠提取液的黏度越高，提取液分子擴(kuò)散率將會(huì)越低，不利于超聲波傳導(dǎo)和果膠溶解。若料液比過(guò)低，則會(huì)導(dǎo)致果膠的提取液過(guò)于黏稠，使得果膠提取率過(guò)低，會(huì)大大增加果膠提取的工藝成本。當(dāng)適當(dāng)增加料液比時(shí)，可以提高纖維素酶對(duì)果膠的提取率。因此，選擇最優(yōu)料液比為1∶20（g∶mL）。

2.1.2 加酶量對(duì)果膠提取率的影響

加酶量對(duì)果膠提取率的影響見(jiàn)表3，加酶量對(duì)果膠提取率的影響見(jiàn)圖2。

圖2 加酶量對(duì)果膠提取率的影響

表3 加酶量對(duì)果膠提取率的影響

由圖2 可知，當(dāng)加酶量＜0.07 g 時(shí)，隨著纖維素酶的增加，果膠提取率逐漸升高；當(dāng)加酶量＞0.07 g 時(shí)，隨著纖維素酶的增加，果膠提取率逐漸下降。在通常情況下，酶的酶促反應(yīng)速率與酶的添加量呈正比關(guān)系。隨著纖維素酶含量的增加，果膠的提取率加快，因?yàn)槔w維素酶會(huì)破壞橙皮細(xì)胞的細(xì)胞壁，導(dǎo)致果膠從中溶解，從而提高提取率。但纖維素酶含量過(guò)高時(shí)，橙皮溶解物已經(jīng)完全與纖維素酶結(jié)合在一起，果膠提取率不會(huì)大幅度發(fā)生變化。因此，選取最優(yōu)加酶量為0.07 g。

2.1.3 pH 值對(duì)果膠提取率的影響

pH 值對(duì)果膠提取率的影響見(jiàn)表4，pH 值對(duì)橙皮果膠提取率的影響見(jiàn)圖3。

圖3 pH 值對(duì)橙皮果膠提取率的影響

表4 pH 值對(duì)果膠提取率的影響

由圖3 可知，pH 值為4.1~4.9 時(shí)，橙皮中果膠提取率隨著pH 值的增大，呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢(shì)；當(dāng)pH 值為4.5 時(shí)，果膠提取率達(dá)到最大值，這是由于pH 值低于4.5 時(shí)，溶液的酸性太強(qiáng)影響了纖維素酶的活性；pH 值高于4.5 時(shí)，提取液酸性減弱，使得橙皮中原果膠的水解程度隨著提取液pH 值的升高而降低，從而導(dǎo)致了纖維素酶提取果膠效率降低。因此提取液pH 值選為4.5。

2.1.4 提取時(shí)間對(duì)果膠提取率的影響

提取時(shí)間對(duì)果膠提取率的影響見(jiàn)表5，提取時(shí)間對(duì)果膠提取率的影響見(jiàn)圖4。

圖4 提取時(shí)間對(duì)果膠提取率的影響

表5 提取時(shí)間對(duì)果膠提取率的影響

由圖4 可知，當(dāng)提取時(shí)間為30~45 min 時(shí)，隨著超聲時(shí)間的增加，果膠提取率也逐漸增大。當(dāng)超聲波提取時(shí)間超過(guò)45 min 時(shí)，果膠提取率顯著下降。適當(dāng)?shù)某暷芰靠梢愿淖兝w維素酶的構(gòu)象，當(dāng)纖維素酶的構(gòu)象發(fā)生變化時(shí)，纖維素酶的活性中心就會(huì)暴露出來(lái)，這就增加了橙皮物質(zhì)與纖維素酶的活性中心結(jié)合在一起的機(jī)會(huì)，從而加快了酶反應(yīng)進(jìn)程。但是，超聲物理能量作用達(dá)到一定程度后，其作用有減弱的趨勢(shì)，超聲波作用時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，會(huì)導(dǎo)致橙皮物質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，與纖維素酶結(jié)合部位減少。因此提取時(shí)間選為40 min。

2.1.5 提取溫度對(duì)果膠提取率的影響

提取溫度對(duì)果膠提取率的影響見(jiàn)表6，提取溫度對(duì)果膠提取率的影響見(jiàn)圖5。

圖5 提取溫度對(duì)果膠提取率的影響

表6 提取溫度對(duì)果膠提取率的影響

由圖5 可知，提取溫度有先升高后降低的趨勢(shì)，當(dāng)提取溫度為45 ℃時(shí)，不能使果膠稀釋出，降低了果膠提取率。在45 ℃以上時(shí)，溶液中的纖維素酶活性下降，影響了果膠的提取。因此，提取溫度選擇45 ℃。

2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果與分析

通過(guò)單因素試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，加酶量、pH 值、提取溫度和提取時(shí)間對(duì)果膠提取效果有著較大影響，由此選用此四因素做正交試驗(yàn)，進(jìn)一步考查其影響因素。

果膠提取正交試驗(yàn)數(shù)據(jù)直觀分析見(jiàn)表7。

表7 果膠提取正交試驗(yàn)數(shù)據(jù)直觀分析

由表7 可知，4 個(gè)因素對(duì)果膠的提取率的影響分別是提取溫度（C） ＞加酶量（A） ＞提取時(shí)間（D） ＞pH 值（B）。根據(jù)擇優(yōu)選擇最高果膠提取率的原則，橙皮果膠的最佳提取水平是A1B1C2D1，加酶量為0.05，pH 值為4.3，提取溫度為50 ℃，提取時(shí)間為35 min。在此條件下，果膠提取率達(dá)到最高，為17.42%。

3 結(jié)論

在五因素五水平的單因素試驗(yàn)及正交試驗(yàn)中，提取溫度對(duì)果膠影響曲線圖坡度最大，其對(duì)提取率影響最大。因此，提取溫度是提取果膠成敗的關(guān)鍵因素。通過(guò)對(duì)果膠的提取率進(jìn)行分析，得出了超聲波輔助纖維素酶提取的最佳工藝條件。適當(dāng)?shù)某暡l件不僅有利于橙皮果膠的提取，還可以提高纖維素酶活力。在最優(yōu)條件為加酶量為0.05，pH 值為4.3，提取溫度50 ℃，提取時(shí)間為35 min 條件下，橙皮果膠的最佳提取率為17.42%。以超聲波輔助酶法提取橙皮果膠工藝的方法提取果膠不僅能縮短繁雜的工藝流程，還能顯著提升果膠的提取率，為日后超聲波輔助酶法提取果膠在食品工業(yè)領(lǐng)域的應(yīng)用提供理論依據(jù)。