李廷菊, 樊錦雅, 王成輝, 古 銳, 鐘世紅

(1.成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院, 成都 611137; 2.成都中醫(yī)藥大學(xué)民族醫(yī)藥學(xué)院, 成都 611137; 3.西南民族大學(xué)藥學(xué)院, 成都 610041)

獨一味[Lamiophlomisrotata(Benth.) Kudo],又稱達巴、嘎果拉、野秦艽, 是唇形科獨一味屬多年生草本植物,為《中華人民共和國藥典》2020年版一部所收載,為常用大宗藏藥材,具有活血止血,祛風(fēng)止痛之功效[1]。目前,以獨一味為原料的復(fù)方制劑涉及30余種,包括藏藥奇正消痛貼、獨一味丸、獨一味顆粒等。在市場需求日益龐大與野生資源逐漸萎縮的背景下,多地已經(jīng)開展人工種植探索[2]。獨一味主要依靠種子繁殖,但野生種子質(zhì)量卻參差不齊,導(dǎo)致種子萌發(fā)實驗耗時相對較長,為了快速了解種子質(zhì)量,開發(fā)快速檢測方法已成為亟待解決的問題。

種子的生活力是指種子的潛在發(fā)芽能力或者種胚所具有的生命力,是種子預(yù)期能夠長成正常幼苗的潛在能力[3]。四唑染色法測定種子生活力具有簡單、方便、快速而準(zhǔn)確的優(yōu)點,現(xiàn)已成為國際通用的種子檢測方法[4],但對獨一味種子生活力測定的方法優(yōu)化研究目前尚少見報道,胡瑩瑩等[5]僅對其生活力進行了初步研究,未摸索其最適染色條件。本研究采用單因素試驗和正交試驗對測定種子活力的5個相關(guān)影響因素進行研究,明確獨一味種子生活力檢測的最優(yōu)條件,以期能夠快速客觀地評價獨一味種子的萌發(fā)率,完善獨一味種子質(zhì)量檢測方法,為無土育苗的種子處理和育苗研究提供參考。

1 試驗材料和方法

1.1 試驗材料

供試獨一味種子于2021年9月初采自四川省阿壩藏族羌族自治州阿壩縣分水嶺,經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)民族醫(yī)藥學(xué)院古銳教授鑒定為唇形科植物獨一味的種子,用簸箕、撞籠、木棒等工具抖種子,采用水選法除去癟種子,選取健康飽滿、無病蟲害、無機械損傷的種子作為供試種子,千粒重為3.070 g,保存于4 ℃冰箱內(nèi)備用。

1.2 發(fā)芽率測定

取獨一味種子50粒,重復(fù)3次,用流水沖洗干凈后,放入0.5%高錳酸鉀溶液中消毒30 min,蒸餾水洗凈,用100 mg/L赤霉素(GA3)溶液浸泡24 h,然后置于直徑為90 mm的培養(yǎng)皿中,內(nèi)墊2層濾紙,蓋上皿蓋保濕,25 ℃恒溫培養(yǎng)箱萌發(fā)。每日記錄種子萌發(fā)情況及發(fā)芽粒數(shù),連續(xù)記錄直至連續(xù)7 d不再發(fā)芽為止。

1.3 TTC染色方法

1.3.1儀器和試劑

恒溫培養(yǎng)箱,培養(yǎng)皿,手術(shù)刀,鑷子,2,3,5-氯代三苯基四氮唑,pH=7.0磷酸緩沖液。

1.3.2TTC染色試劑的配制

磷酸緩沖溶液的配制參照雷慧霞等[6]的方法,先配制pH=7.0的磷酸緩沖溶液,再在此基礎(chǔ)上配制不同濃度的TTC溶液。

0.1% TTC溶液配制:稱取0.1 g 2,3,5-氯代三苯基四氮唑粉劑溶解于100 mL磷酸緩沖溶液,按此法分別配制0.1%、0.3%、0.5%、1.0%、2.0%TTC溶液,于棕色瓶中4 ℃冰箱避光保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3種子處理

取浸種后的種子25粒,3次重復(fù),用手術(shù)刀劃開胚乳,取出發(fā)育良好、完整無損傷的胚,置于直徑90 mm的培養(yǎng)皿中,倒入配制好的染色液,以浸沒為度,在各培養(yǎng)皿上標(biāo)記所用TTC溶液濃度,置于相應(yīng)溫度的烘箱中暗光進行染色反應(yīng)。待達到設(shè)定的培養(yǎng)時間時,取出培養(yǎng)皿,倒去染色液,用去離子水稍稍沖洗胚,然后將胚放置于濾紙上吸去多余水分,以白色濾紙為背景,根據(jù)胚染色深淺和面積大小判斷種子活力。

1.3.4最優(yōu)測定條件試驗

1) 單因素試驗

浸種溫度:采用浸種時間24 h,染色溫度25 ℃,染色時間6 h,TTC濃度為0.5%,浸種溫度分別設(shè)置20、25、30、35、40 ℃對種子進行染色,測定胚活力。

浸種時間:采用浸種溫度30 ℃,染色溫度25 ℃,染色時間6 h,TTC濃度為0.5%,浸種時間分別設(shè)置6、9、12、24、36 h對種子進行染色,測定胚活力。

染色溫度:采用浸種溫度30 ℃,浸種時間24 h,染色時間6 h,TTC濃度為0.5%,染色溫度分別設(shè)置20、25、30、35、40 ℃對種子進行染色,測定胚活力。

染色時間:采用浸種溫度30 ℃,浸種時間24 h,染色溫度25 ℃,TTC濃度為0.5%,染色時間分別設(shè)置1、3、6、9、12 h對種子進行染色,測定胚活力。

TTC溶液濃度:采用浸種溫度30 ℃,浸種時間24 h,染色溫度25 ℃,染色時間6 h,TTC溶液濃度分別為0.1%、0.3%、0.5%、1.0%、2.0%對種子進行染色,測定胚活力。

2) 正交試驗

采用L16(45)5因素4水平正交設(shè)計(見表1),試驗以單因素試驗結(jié)果為依據(jù),以浸種溫度、浸種時間、染色溫度、染色時間、TTC濃度等5個主要影響?yīng)氁晃斗N子染色的因素進行正交試驗,每個因素設(shè)置4個水平。每組25粒,3次重復(fù)。

1.3.5染色后觀察

按《國際種子檢驗規(guī)程》判斷種子是否有生活力[7]:胚全部或絕大部分染成鮮紅色或大紅色為有生活力種子,只有少部分胚染色或大部分染色為淡粉色為低活力或無生活力種子。

種子生活力/%=(有生活力的種子數(shù)/供試種子總數(shù))×100%。

表1 獨一味種子生活力測定正交試驗因素和水平Table 1 Determination of orthogonal test factors and levels by Lamiophlomis rotata viability

1.3.6數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2019和SPSS 26.0軟件進行數(shù)據(jù)處理分析,p<0.05表示差異顯著,p<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 種子發(fā)芽率測定結(jié)果

經(jīng)統(tǒng)計,獨一味種子萌發(fā)粒數(shù)分別為40粒、44粒、46粒,發(fā)芽率為86.67%。

2.2 單因素試驗結(jié)果

單因素試驗結(jié)果見表2。獨一味種子在不同浸種溫度下,胚的著色率隨浸種溫度升高而升高然后下降,在25 ℃時著色率最高,為80.0%,因此最佳浸種溫度為25 ℃;不同浸種時間處理時,胚的著色率依次為:浸種9 h>浸種24 h>浸種12 h>浸種6 h,即浸種9 h為最佳浸種時間;不同染色溫度處理時,胚的著色率隨染色溫度升高呈先增后減的趨勢,表明染色時染色溫度不宜過高,即適宜染色溫度為30 ℃(86.0%);不同染色時間處理時,胚的著色率隨染色時間的延長而增加,當(dāng)染色時間達到12 h時,胚的著色率最高(91.7%),因此最佳染色時間在12 h左右;TTC濃度為0.1%、0.3%、0.5%時胚的著色率非常接近,但是當(dāng)TTC濃度升到1.0%、2.0%時,著色率逐步降低,綜合考慮最佳TTC濃度應(yīng)為0.1%。綜上所述,單因素條件下,最佳染色條件為浸種溫度25 ℃、浸種時間9 h、染色溫度30 ℃、染色時間12 h、TTC濃度0.1%。

表2 種子生活力測定單因素試驗結(jié)果Table 2 Single factor test results of seed viability determination

2.3 正交試驗結(jié)果

正交試驗結(jié)果見表3。在不同因素與水平組合處理下,獨一味種子生活力介于59.3%～89.3%之間,存在較大差異,其中以處理組合6(25 ℃浸種9 h、0.1%TTC、40 ℃染色9 h)和處理組合11(30 ℃浸種12 h、0.1% TTC、30 ℃恒溫箱染色12 h)染色效果最好,而處理組合1(20 ℃浸種6 h、0.1% TTC、25 ℃染色3 h)的種子生活力最低,染色較淺,效果最差。

2.4 極差分析

對正交試驗數(shù)據(jù)進行極差分析(見表3),比較5個因素對獨一味種子胚生活力的影響大小。5個因素的極差值R分別為:R浸種溫度=7.97,R浸種時間=8.95,RTTC濃度=10.00,R染色溫度=13.68,R染色時間=14.45,即它們對獨一味種子胚生活力的影響依次為:染色時間>染色溫度>TTC濃度>浸種時間>浸種溫度,其中染色時間和染色溫度對胚生活力影響最大,浸種溫度影響最小。

用各因素對應(yīng)的極差最大值(Ⅰj、Ⅱj、Ⅲj、Ⅳj)來確定測定種子生活力的最適條件,值越大表示最適程度越高。浸種溫度對應(yīng)的Ⅰ1、Ⅱ1、Ⅲ1、Ⅳ1的值分別為75.08、81.20、73.23、80.13,可以看出Ⅱ2值最大,即25 ℃為最適浸種溫度;浸種時間對應(yīng)的Ⅰ2、Ⅱ2、Ⅲ2、Ⅳ2值中Ⅲ2最大,即最適浸種時間為12 h;同理可知最適的TTC濃度、染色溫度、染色時間依次為0.1% TTC、40 ℃恒溫箱染色12 h,無處理組合相對應(yīng),與正交實驗分析結(jié)果進行對比,出于節(jié)約時間和成本的考慮,處理組合6較為適宜,可為最佳染色條件。

表3 種子生活力測定正交試驗結(jié)果Table 3 Orthogonal test results of seed viability determination

2.5 方差分析

方差分析結(jié)果見表4。試驗設(shè)定的5個因素,即浸種溫度、浸種時間、染色溫度、染色時間、TTC濃度的p值均小于0.01,表明每個因素對種子生活力均有影響。

表4 方差分析Table 4 Variance analysis

3 結(jié)論與討論

TTC染色檢測種子生活力對快速檢驗植物種子的質(zhì)量具有重要的指導(dǎo)意義[7],因此,國際種子檢驗規(guī)程以及我國農(nóng)作物種子檢驗規(guī)程均將其作為檢測種子生活力及種子活力的重要參考。通過種子發(fā)芽率來判斷獨一味種子的質(zhì)量過程較長,從置盤至完全發(fā)芽需要15 d左右,而TTC染色能快速進行質(zhì)量檢驗,大大縮短時間成本。本實驗中,處理6和處理11染色效果相近,并與統(tǒng)計分析結(jié)果最佳處理方法有部分重合,因此,從節(jié)約時間和節(jié)約成本的角度考慮[6,8],選擇組合6作為最佳染色組合。王改花等[9]用0.09 g/mL+2 mL H2O牛糞水浸液、200 mg/L GA3、0.1%細胞分裂素濃度處理種子,發(fā)芽率分別為93.33%、73.33%、86.67%;羅桂花、金蘭[10]研究表明,種子千粒重5.03 g、溫度25 ℃、50 mg/L GA3浸種24 h,發(fā)芽率為90.67%;胡瑩瑩等[5]研究表明,蒸餾水浸種24 h,發(fā)芽率為82.67%;以上實驗及本實驗測定的發(fā)芽率(86.67%)和生活力測定(89.3%)均較為接近,其差異在于萌發(fā)實驗所用種子飽滿度各不相同,部分種子雖果實飽滿但胚乳已經(jīng)霉變,實際操作中不易發(fā)現(xiàn),經(jīng)激素處理后其發(fā)芽率有所增減,故采用TTC法快速測定獨一味質(zhì)量具有一定的指導(dǎo)意義,在育苗實踐中可作為參考。

正交試驗設(shè)計常被廣泛應(yīng)用于種子TTC染色的最佳因素和水平篩選優(yōu)化上。種子浸泡溫度、浸泡時間、TTC濃度、染色溫度和染色時間等5個因素均能顯著影響?yīng)氁晃斗N子染色效果,影響依次為:染色時間>染色溫度>TTC濃度>浸種時間>浸種溫度。其中染色溫度和染色時間為首要影響因素,表明這兩個因素是決定獨一味種子TTC染色效果最關(guān)鍵的因素。這一結(jié)果與王志威等[11]、朱思宇等[12]、吳紅等[13]對種子的生活力檢測結(jié)果有相似之處,即染色溫度和染色時間對于種子染色更為重要,后續(xù)可根據(jù)需要優(yōu)化檢測方法。