李志強(qiáng), 吳 超, 耿建建, 馬 靜, 宮麗丹

(云南省熱帶作物科學(xué)研究所, 云南 景洪 666100)

澳洲堅(jiān)果(Macadamiaspp.)是山龍眼科(Proteaceae)澳洲堅(jiān)果屬(Macadamia F. Muell)植物,是重要的經(jīng)濟(jì)作物[1]。澳洲堅(jiān)果屬有4個種(M.integrifoliaMaiden &Betche,M.tetraphyllaL.A.S.Johnson,M.ternifoliaF.Muell 和M.janseniiC.L.Gross &P.H.Weston)。其中M.integrifolia,M.tetraphylla及其雜交種被廣泛用于商業(yè)生產(chǎn)中[2-3],M.jansenii和M.ternifolia的果仁較小且因氰化物含量高而尚未直接用于澳洲堅(jiān)果育種及生產(chǎn)中[4]。作為一個外來引進(jìn)樹種,我國大陸地區(qū)于20世紀(jì)80年代開始澳洲堅(jiān)果的引種試種[5],目前已是全世界澳洲堅(jiān)果種植面積最大的國家,種植區(qū)域主要分布在云南、廣西、廣東及貴州等省份。

種質(zhì)資源的遺傳多樣性分析是種質(zhì)資源創(chuàng)新與利用的基礎(chǔ)。國內(nèi)外學(xué)者對澳洲堅(jiān)果的分子遺傳多樣性已經(jīng)開展了大量的研究。同工酶最早被用于澳洲堅(jiān)果的遺傳變異分析[6-7]。隨后,Vithanage等[8]通過8對STS(Sequence Tagged Sites)引物分析了76份澳洲堅(jiān)果種質(zhì)的親緣關(guān)系,結(jié)果表明,A 16和A 4的遺傳距離較近,擁有共同的母本。Peace等[9]認(rèn)為,相對于同工酶、RAPD標(biāo)記和STMS標(biāo)記,RAMiFi(Randomly Amplified Microsatellite Fingerprinting)標(biāo)記在澳洲堅(jiān)果遺傳分析中更有優(yōu)勢。Steiger等[10]利用AFLP標(biāo)記分析了澳洲堅(jiān)果屬的3個種及1個近緣種,對三葉澳洲堅(jiān)果是全緣葉澳洲堅(jiān)果變種的觀點(diǎn)提出懷疑。AFLP標(biāo)記亦被用于肯尼亞的26份澳洲堅(jiān)果變異分析[11]。RAF標(biāo)記被用于分析代表南非澳洲堅(jiān)果遺傳多樣性的38份種質(zhì),更正了個別混淆的品種[12]。郭凌飛[13]利用 ISSR和SRAP標(biāo)記分析了123份澳洲堅(jiān)果種質(zhì)的遺傳多樣性。Machado等[14]利用RAPD標(biāo)記對巴西和澳大利亞兩個群體的遺傳變異進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)大多數(shù)的變異發(fā)生在群體內(nèi)部?；诟咄繙y序技術(shù)silicoDArT和SNP標(biāo)記亦被用于澳洲堅(jiān)果遺傳多樣性和群體結(jié)構(gòu)研究[15-17]。

SSR標(biāo)記被認(rèn)為是遺傳研究中最好的方法之一[18]?；赟SR標(biāo)記的澳洲堅(jiān)果遺傳分析亦有報(bào)道[19-21]。本研究利用本課題組開發(fā)的22對SSR引物,通過毛細(xì)管電泳檢測,分析前期收集保存的85份澳洲堅(jiān)果種質(zhì)資源的分子遺傳多樣性,這85份澳洲堅(jiān)果種質(zhì)資源材料主要包含從美國和澳大利亞引進(jìn)的種質(zhì),還包含國內(nèi)通過實(shí)生選種及雜交育種方法獲得的優(yōu)異單株。本研究通過揭示供試群體種質(zhì)的遺傳背景,以期為澳洲堅(jiān)果的雜交親本選擇及遺傳改良提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

供試的85份澳洲堅(jiān)果種質(zhì)葉片采自農(nóng)業(yè)部景洪澳洲堅(jiān)果種質(zhì)資源圃和云南省熱帶作物科學(xué)研究所澳洲堅(jiān)果品種試驗(yàn)基地(表1)。

1.2 DNA提取及SSR擴(kuò)增檢測

采用CTAB法提取DNA,提取后的DNA經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測后用于試驗(yàn)。22對SSR引物由本課題組設(shè)計(jì)并篩選所得(表2),在通用生物系統(tǒng)有限公司合成FAM標(biāo)記的熒光引物。PCR反應(yīng)體系:10×Buffer 2 μL,2.5 mmol/L dNTP 0.4 μL,正反引物各0.3 μL,DNA模板2 μL(20 ng/μL),5 UTaq0.2 μL,ddH2O 14.8 μL。PCR擴(kuò)增程序:94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性30 s,65 ℃到50 ℃降落復(fù)性30 s,72 ℃延伸40 s,35個循環(huán);最后72 ℃延伸3 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖電泳檢測后使用3730 XL測序儀進(jìn)行毛細(xì)管電泳檢測。

1.3 數(shù)據(jù)分析

利用Genemarker V 2.2.0軟件中的Fragment(Plant)片段對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,比較泳道內(nèi)分子量內(nèi)標(biāo)的位置與樣品峰值的位置,得到樣品的片段大小。將每個樣品在各引物的片段大小錄入到Excel中。使用POPGENE 32軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,計(jì)算多態(tài)位點(diǎn)百分率(P)、有效等位基因數(shù)(Ne)、觀測雜合度(Ho)、期望雜合度(He)等參數(shù)。通過POPGENE 32計(jì)算出群體的基因型頻率,再通過PIC_CALC計(jì)算多態(tài)性信息含量(PIC)?；谶z傳距離,使用MEGA 5軟件中UPGMA法進(jìn)行聚類分析,構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。使用STRUCTURE 2.3.3軟件分析群體遺傳結(jié)構(gòu),參數(shù)設(shè)置如下:Length of Burn-in period: 200 000;Number of MCMC Reps after Burnin:1 200 000;Set K:2-10;Number of Iterations:8。

2 結(jié)果與分析

2.1 SSR標(biāo)記分析

利用22對SSR引物對85份澳洲堅(jiān)果種質(zhì)進(jìn)行毛細(xì)管電泳檢測。共檢測到269個等位基因(見表3),平均每對引物12.2個,引物P 202等位基因數(shù)最低(6個),引物P 33等位基因數(shù)最高(18個),有15對引物檢測到10個以上的等位基因。有效等位基因數(shù)為1.987 9(P 15)～8.794 9(P 11),平均5.087 2個。Shannon指數(shù)(I)為1.020 9(P 15)～2.327 3(P 11),平均值為1.854 3。觀測雜合度(Ho)為0.117 6(P 238)～0.882 4(P 35),平均值為0.582 6。期望雜合度(He)為0.499 9(P 15)～0.891 5(P 11),平均值為0.784 5。Nei’s指數(shù)范圍為0.497～0.886 3,平均0.779。多態(tài)性信息含量為0.461 8(P 15)～0.875 4(P 11)。22對引物中,有21對引物屬于高多態(tài)位點(diǎn)(p>0.5),說明該批高效SSR引物可用于澳洲堅(jiān)果遺傳多樣性分析。

表1 試驗(yàn)材料Table 1 The trial materials

表2 22對SSR引物Table 2 22 SSR primers

2.2 群體間遺傳分析

將85份材料大致劃分為4個群體:從美國引進(jìn)種質(zhì)(pop A)、從澳大利亞引進(jìn)種質(zhì)(pop B)、國內(nèi)實(shí)生選種種質(zhì)(pop C)和國內(nèi)定向雜交育種種質(zhì)(pop D)。4個群體的觀測等位基因數(shù)為5.454 5～7.954 5,有效等位基因數(shù)為3.313 3～4.799 8,Shannon指數(shù)為1.342 6～1.732 8,Nei’s指數(shù)為0.659 3～0.770 6(表4)。相對于其他3個群體,澳大利亞種質(zhì)在觀測等位基因數(shù)、有效等位基因數(shù)、Shannon指數(shù)及Nei’s遺傳多樣性均為最高。說明澳大利亞群體的遺傳多樣性最為豐富。分析4個群體的遺傳距離和遺傳一致度(表5)。遺傳距離的變化范圍為0.157 5～0.298 6,遺傳一致度變化范圍為0.741 9～0.854 2。pop B與pop D的遺傳距離最小(0.157 5),遺傳一致度最高(0.854 2),表明兩個群體的遺傳關(guān)系最近。

2.3 UPGMA聚類及遺傳結(jié)構(gòu)分析

基于UPGMA 對85份材料進(jìn)行聚類(圖1),材料間未見有明顯的劃分規(guī)律。澳大利亞種質(zhì)及美國種質(zhì)沒有各自聚類在一起,分別被劃分到不同的組群中,表明聚類劃分與地理來源無明顯相關(guān)性。國內(nèi)實(shí)生選種種質(zhì)亦被劃在不同的組群中。定向雜交種質(zhì)多數(shù)與其親本之一劃為一組,如73號是以10號為母本的雜交優(yōu)株,26號是69號、83號、84號和85號的親本之一。

表3 SSR 標(biāo)記的遺傳多樣性參數(shù)Table 3 Genetic diversity parameters of SSR

表4 群體遺傳多樣性參數(shù)Table 4 Genetic diversity parameters of populations

應(yīng)用Structure軟件對85份澳洲堅(jiān)果種質(zhì)進(jìn)行群體結(jié)構(gòu)分析(圖3)。用ΔK來確定K值,當(dāng)K=6時,ΔK取得最大值(圖2),即群體結(jié)構(gòu)分析將85份種質(zhì)分為6個類群。類群1至類群6分別包含12、19、10、17、9、18份種質(zhì)。17份美國種質(zhì)被分在類群1、類群3、類型4、類群5中,16份澳大利亞種質(zhì)在6個類群中均有分布,23份國內(nèi)實(shí)生種質(zhì)被分在類群1、類群2、類群3和類群6中,雜交種質(zhì)被分在類群2、類群3、類群4中。劉麗華等[22]認(rèn)為,在群體遺傳結(jié)構(gòu)分析中,當(dāng)遺傳組分(Q值)≥0.6時,可認(rèn)為該材料的遺傳背景較為單一。分別統(tǒng)計(jì)分析各澳洲堅(jiān)果種質(zhì)在各類群中的Q值,85份材料中有51份(60%)種質(zhì)Q值大于等于0.6,34份(40%)供試種質(zhì)遺傳背景較為復(fù)雜。供試的17份雜交優(yōu)株中,有4份種質(zhì)顯示遺傳背景單一,分別為71號、72號、78號和82號。

表5 群體間遺傳相似系數(shù)和遺傳距離Table 5 Genetic similarity coefficient and genetic distance between populations

圖1 85份澳洲堅(jiān)果種質(zhì)的UPGMA 聚類圖Fig.1 UPGMA dendrogram of 85 Macadamia ssp. accessions

圖2 ΔK隨 K值的變化趨勢Fig.2 Trend of ΔK with K value

3 討論與結(jié)論

聚丙烯酰胺凝膠電泳銀染檢測和毛細(xì)管電泳熒光檢測是SSR標(biāo)記常見的檢測方法,兩種方法的檢測結(jié)果理論上是一致的。但在數(shù)據(jù)的讀取和檢測的效率上,毛細(xì)管電泳都更具優(yōu)勢[23-24]。該研究利用毛細(xì)管電泳及已篩選的高多態(tài)性SSR引物進(jìn)行檢測,保證了檢測的準(zhǔn)確性和快捷性。

圖3 85份澳洲堅(jiān)果種質(zhì)資源群體結(jié)構(gòu)圖Fig.3 Population structure diagram of 85 Macadamia ssp. germplasms

作為一個外來引進(jìn)物種,目前我國的澳洲堅(jiān)果種植面積居世界第一。優(yōu)良品種是澳洲堅(jiān)果產(chǎn)業(yè)穩(wěn)定發(fā)展的前提,而種質(zhì)資源收集是品種改良的物質(zhì)基礎(chǔ)。初期我國澳洲堅(jiān)果種質(zhì)資源收集以從國外引種為主,隨著各國對種質(zhì)資源保護(hù)工作的重視,目前從國外引進(jìn)新種質(zhì)十分困難?，F(xiàn)在國內(nèi)澳洲堅(jiān)果種質(zhì)資源收集方法逐漸轉(zhuǎn)為篩選國內(nèi)優(yōu)異單株和種質(zhì)創(chuàng)新。本次研究通過比較現(xiàn)有的澳大利亞引進(jìn)種質(zhì)、美國引進(jìn)種質(zhì)、國內(nèi)實(shí)生特異種質(zhì)及國內(nèi)定向雜交優(yōu)異種質(zhì)4個群體,研究結(jié)果表明,澳大利亞作為澳洲堅(jiān)果的發(fā)源地,其種質(zhì)群體有最豐富的遺傳變異,國內(nèi)實(shí)生特異種質(zhì)和定向雜交種質(zhì)均比美國引種種質(zhì)的遺傳多樣性高。表明今后對澳洲堅(jiān)果種質(zhì)資源的評價(jià),側(cè)重點(diǎn)應(yīng)在澳大利亞種質(zhì)及國內(nèi)優(yōu)異單株種質(zhì)群體上。遺傳多樣性分析有助于了解各種質(zhì)間的親緣關(guān)系。本次研究的聚類分析中,澳洲堅(jiān)果種質(zhì)246(5號)與種質(zhì)333(7號)、種質(zhì)A 4(24號)和種質(zhì)A 16(27號)劃分在一起,親緣關(guān)系較近,這與Aradhya等[7]和Peace等[9]結(jié)果一致,而種質(zhì)800(13號)未能與其聚類到一起。種質(zhì)741(11號)與種質(zhì)344(8號)親緣關(guān)系較遠(yuǎn),與Vithanage等[8]結(jié)果一致。不同標(biāo)記方法所揭示的遺傳多態(tài)性信息不同,可能得出不同的分析結(jié)果。SSR標(biāo)記以其共顯性、穩(wěn)定性被廣泛用于遺傳多樣性研究。本次研究利用22對高效SSR引物對85份澳洲堅(jiān)果種質(zhì)進(jìn)行評價(jià)分析,有助于了解不同群體種質(zhì)的遺傳背景,對澳洲堅(jiān)果種質(zhì)資源收集利用及品種改良有指導(dǎo)意義。