李 爽, 劉哲睿, 趙 琦, 陸蔭英

1 北京大學(xué)三〇二臨床醫(yī)學(xué)院, 北京 100039; 2 解放軍總醫(yī)院第五醫(yī)學(xué)中心肝病醫(yī)學(xué)部, 北京 100039;3 澳門大學(xué)健康科學(xué)院, 澳門特別行政區(qū) 999078

原發(fā)性肝癌是中國乃至全世界較為常見的惡性腫瘤,發(fā)病率居于世界第七(4.7%),死亡率位于全世界第三(8.3%)[1],由于原發(fā)性肝癌起病隱匿且早期診斷困難,大多數(shù)患者確診時(shí)已經(jīng)是中晚期,常規(guī)治療手段有限,患者5年生存率較差[1]。近年來,腫瘤免疫治療憑借其在體內(nèi)產(chǎn)生的強(qiáng)大且持久的抗腫瘤作用受到廣泛關(guān)注,其中免疫檢查點(diǎn)抑制劑、過繼免疫細(xì)胞治療、腫瘤疫苗等腫瘤免疫療法逐漸應(yīng)用于原發(fā)性肝癌的臨床治療實(shí)踐當(dāng)中。

嵌合抗原受體(chimeric antigen receptor, CAR)T細(xì)胞是一種經(jīng)基因編輯修飾的T淋巴細(xì)胞,能夠識別腫瘤特異性抗原并活化T淋巴細(xì)胞,使T淋巴細(xì)胞發(fā)揮腫瘤殺傷作用,作為一種過繼性免疫細(xì)胞療法,其突出的安全性及有效性已在多種血液腫瘤治療中展現(xiàn)。截至目前,已有六款自體 CAR-T 細(xì)胞產(chǎn)品獲 FDA 批準(zhǔn)上市,其中四款靶向 CD19,另有兩款靶向 BCMA;2021 年6月和9月,中國國家藥品監(jiān)督管理局(national medical products administration, NMPA)也先后批準(zhǔn)兩款靶向 CD19 的 CAR-T細(xì)胞產(chǎn)品(復(fù)興凱特,倍諾達(dá))上市,均為血液腫瘤的適應(yīng)證[2-3]。隨著 CAR-T 細(xì)胞療法在血液腫瘤領(lǐng)域“一次性治愈”式的革新,細(xì)胞免疫治療也激發(fā)了業(yè)界對 CAR-T 細(xì)胞療法應(yīng)用于實(shí)體瘤的研究熱情。作為發(fā)病率和死亡率均居前列的原發(fā)性肝癌也成為了關(guān)注的焦點(diǎn),近年來已有多個(gè)針對肝細(xì)胞癌(HCC)特異性靶點(diǎn)的CAR-T細(xì)胞療法完成早期臨床試驗(yàn),眾多新型CAR-T細(xì)胞療法也正在研發(fā),同時(shí)CAR-T細(xì)胞與其他療法聯(lián)合治療的研究也陸續(xù)被推出,成為原發(fā)性肝癌免疫治療研究的新熱點(diǎn);本文將從多角度對CAR-T細(xì)胞治療原發(fā)性肝癌臨床研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 CAR-T細(xì)胞治療腫瘤的作用機(jī)制以及發(fā)展

1.1 CAR-T細(xì)胞結(jié)構(gòu)以及作用機(jī)制 CAR-T細(xì)胞是由單克隆抗體的單鏈可變區(qū)(single chain antibody fragment, scFv)和T淋巴細(xì)胞信號傳導(dǎo)區(qū)連接而成,針對不同的腫瘤細(xì)胞抗原構(gòu)建不同的單克隆抗體代替T淋巴細(xì)胞抗原受體(T cell receptor, TCR)中的互補(bǔ)決定區(qū),避免主要組織相容性復(fù)合體(major histocompatibility complex, MHC)限制性,CAR中svFv通過特異性的識別腫瘤特異性抗原直接將信號傳到T淋巴細(xì)胞內(nèi),使T淋巴細(xì)胞活化,分泌細(xì)胞因子,殺滅腫瘤細(xì)胞[4-5]。與TCR相比,CAR抗體能夠識別更廣泛的腫瘤細(xì)胞抗原,以MHC非限制性方式使T淋巴細(xì)胞活化,進(jìn)而發(fā)揮高效性和特異性的抗腫瘤效應(yīng)。CAR作為CART的核心,其結(jié)構(gòu)主要由胞外區(qū)、鉸鏈區(qū)、跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)四部分組成。胞外區(qū)通常由針對腫瘤相關(guān)抗原(tumor associated antigen, TAA)的單克隆抗體的輕鏈及重鏈連接而成。鉸鏈區(qū)需針對不同TAA調(diào)整其長度,以便更好發(fā)揮靶向結(jié)合能力[6]。跨膜區(qū)常由CD3、CD8、CD28的跨膜區(qū)構(gòu)建,在T淋巴細(xì)胞活化中發(fā)揮重要作用。胞內(nèi)信號區(qū)主要由如CD28、CD134、CD137等組成。CAR大體結(jié)構(gòu)由膜外段和膜內(nèi)段組成,膜外段主要是結(jié)合特異性抗原的單克隆抗體可變區(qū),膜內(nèi)段由刺激結(jié)構(gòu)域和共刺激結(jié)構(gòu)域組成。目標(biāo)靶抗原的選擇是CAR特異性的關(guān)鍵性因素,隨著CAR-T細(xì)胞的廣泛應(yīng)用,其結(jié)構(gòu)也在不斷優(yōu)化迭代[7]。

1.2 CAR-T細(xì)胞殺傷腫瘤細(xì)胞的分子機(jī)制 T淋巴細(xì)胞加入(嵌合)特定抗原的受體,以使T淋巴細(xì)胞行使特異的殺傷功能。T淋巴細(xì)胞識別腫瘤抗原后,激活T淋巴細(xì)胞免疫通路,相關(guān)基因表達(dá)上調(diào),分泌顆粒酶、穿孔素直接介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞溶解,同時(shí)也分泌細(xì)胞因子介導(dǎo)固有免疫系統(tǒng)殺傷腫瘤細(xì)胞,一是通過直接靶向殺傷表達(dá)特異性抗原的腫瘤細(xì)胞, 二是通過誘導(dǎo)自亡殺傷抗原丟失的腫瘤細(xì)胞[8]。

1.3 CAR-T細(xì)胞發(fā)展

1.3.1 第一代 最初版本的CAR設(shè)計(jì)成只有CD3 TCR或Fc受體(Fc receptor, FcR)的CD3鏈,與外部scFv相連,給T淋巴細(xì)胞一個(gè)激活的信號,同時(shí)由于這些區(qū)域連接簡單,缺乏T淋巴細(xì)胞活化所必須的第二信號,導(dǎo)致其激活效率較低,不足以產(chǎn)生高效的T淋巴細(xì)胞反應(yīng)或持續(xù)的細(xì)胞因子。因此第一代CAR-T并未在臨床應(yīng)用中獲得預(yù)期效果[9]。

1.3.2 第二代 第二代CAR-T細(xì)胞在第一代CAR-T細(xì)胞的基礎(chǔ)上,在胞內(nèi)段添加了一個(gè)來自共刺激分子CD28、OX40或者CD137(4-1BB)的免疫受體酪氨酸活化基序(immunoreceptor tyrosine-based activation motif, ITAM)結(jié)構(gòu)域。這些細(xì)胞內(nèi)信號域的存在在臨床前模型中提高了T淋巴細(xì)胞的持久性、細(xì)胞因子的分泌以及抗腫瘤的功效,胞外的抗原識別區(qū)與靶抗原結(jié)合后,可使T淋巴細(xì)胞同時(shí)獲得抗體刺激信號及共刺激信號。這使得第二代CAR-T細(xì)胞的活化能力遠(yuǎn)遠(yuǎn)強(qiáng)于第一代,相關(guān)臨床試驗(yàn)[5]證實(shí)了第二代CAR-T對B細(xì)胞急性淋巴細(xì)胞白血病和非霍奇金淋巴瘤患者有很強(qiáng)的抗腫瘤功效。

1.3.3 第三代 第三代CAR主要結(jié)構(gòu)同二代CAR相似,但其使用慢病毒作為轉(zhuǎn)染載體,可攜帶更大的基因片段進(jìn)入T淋巴細(xì)胞,因此三代CAR-T在其胞內(nèi)段攜帶了多個(gè)共刺激域,如CD28-41BB或CD28-OX40,來提高CAR-T細(xì)胞的殺傷效能,使其產(chǎn)生更多的細(xì)胞因子,更強(qiáng)大的抗腫瘤能力,并能夠增加T淋巴細(xì)胞的增殖。此外,一些第三代CAR的臨床前研究報(bào)告顯示,與第二代CAR相比,第三代CAR在臨床上療效更好、更易增殖,可產(chǎn)生更多的細(xì)胞因子。然而,關(guān)于第二代及第三代CAR-T細(xì)胞療效問題,目前仍然存在爭議[10]。

1.3.4 第四代 第四代CAR-T細(xì)胞,也稱為精準(zhǔn)CAR-T細(xì)胞。其結(jié)構(gòu)與前三代不同,引入了促炎癥細(xì)胞因子和共刺激配體,主要目的是克服抑制性的腫瘤免疫微環(huán)境。第四代CAR-T包括自殺基因、整合表達(dá)免疫因子、整合共刺激因子配體等精確調(diào)控方式的加入,可能有含CD28的3個(gè)不同的共同刺激因子加入。第四代CAR-T在胞內(nèi)區(qū)進(jìn)一步加入自殺基因或促炎細(xì)胞因子,以此增強(qiáng)對T淋巴細(xì)胞反應(yīng)調(diào)控或通過釋放不同的細(xì)胞因子來招募其他的免疫細(xì)胞至腫瘤部位,產(chǎn)生不依賴于T淋巴細(xì)胞的殺傷作用[11]。

1.3.5 第五代 第五代CAR-T細(xì)胞即通用型CAR-T,是指從健康志愿者獲取T淋巴細(xì)胞并進(jìn)行基因編輯敲除相關(guān)基因,然后轉(zhuǎn)入CAR基因制成的CAR-T細(xì)胞,最主要的優(yōu)勢在于不需要從患者體內(nèi)獲取T淋巴細(xì)胞進(jìn)行定制,而是可以做到現(xiàn)貨供應(yīng),從而節(jié)約時(shí)間和治療花費(fèi)[12]。

2 CAR-T細(xì)胞臨床研究現(xiàn)狀

2.1 CAR-T總體研究現(xiàn)狀 截至2023年初,中國登記注冊了800余項(xiàng)關(guān)于CAR-T細(xì)胞的臨床研究,其中三分之二在ClinicalTrials.gov登記注冊,三分之一在Chinese ClinicalTrial Registry登記注冊。2021年開始,中美CAR-T臨床試驗(yàn)注冊總數(shù)出現(xiàn)了下滑,而在前幾年一直是增加的態(tài)勢。在地區(qū)分布方面,中國CAR-T細(xì)胞治療臨床研究主要分布在北京、江蘇、上海、浙江和廣東等醫(yī)療資源集中、科研水平較高和經(jīng)濟(jì)較發(fā)達(dá)地區(qū)。從試驗(yàn)進(jìn)度來看,CAR-T細(xì)胞療法的臨床試驗(yàn)集中處在早期臨床和phaseⅠ、PhaseⅠ/Ⅱ,有不到10%的管線處在phaseⅡ以及之后的階段[2](表1)。

2.2 CAR-T研究適應(yīng)證 在適應(yīng)證方面,在2022年正在進(jìn)行的三百余項(xiàng)臨床試驗(yàn)中,血液腫瘤占絕大多數(shù),尤其是B淋巴細(xì)胞惡性腫瘤。有23%試驗(yàn)適應(yīng)證為實(shí)體瘤,其中最常見實(shí)體瘤包括肝癌、胰腺癌和腦癌。目前已經(jīng)有部分企業(yè)在做腫瘤之外的適應(yīng)證,并且比例有所增加,疾病涵蓋范圍較為廣泛,包括自身免疫性疾病、傳染病等[13]。

具體來說,針對自身免疫性疾病的CAR-T細(xì)胞試驗(yàn)包括系統(tǒng)性紅斑狼瘡、硬皮病、腎炎、干燥綜合征、視神經(jīng)脊髓炎譜系障礙,傳染病則包括艾滋病、慢性活動性Epstein-Barr病毒感染和COVID-19[14-16]。雖然國內(nèi)開展的臨床試驗(yàn)項(xiàng)目較多,獲批開展臨床的CAR-T項(xiàng)目超過了40項(xiàng),但獲NMPA批準(zhǔn)上市的只有兩款,說明CAR-T研究前景遠(yuǎn)大,并且仍然需要探索。

3 CAR-T細(xì)胞在肝癌中臨床研究現(xiàn)狀

3.1 磷脂酰肌醇蛋白聚糖3 (GPC3) CAR-T細(xì)胞

3.1.1 GPC3生物學(xué)原理 GPC3是一個(gè)65 kD的糖基磷脂酰肌醇(GPI)錨定的580個(gè)氨基酸的硫酸肝素蛋白多糖,它通過激活Wnt途徑在腫瘤發(fā)生中起作用,提示預(yù)后不良[17]。并且GPC3在非腫瘤組織表達(dá)很少。53%的HCC患者中發(fā)現(xiàn)可溶性GPC3,可以作為生物標(biāo)志物,在HCC的發(fā)展和預(yù)后中均發(fā)揮作用。與對照組相比,HCC細(xì)胞中的GPC3表達(dá)降低導(dǎo)致腫瘤增殖減少,凋亡增加,腫瘤細(xì)胞遷移受損。因此GPC3成為肝細(xì)胞癌CAR-T細(xì)胞治療的熱門靶標(biāo)。

3.1.2 GPC3靶向CAR-T細(xì)胞的臨床前研究及臨床研究 為了提高GPC3-CART在實(shí)體瘤中的功能,Kolluri等[18]在2022年美國臨床腫瘤學(xué)會(ASCO)年會上報(bào)告了對GPC3進(jìn)行了VH區(qū)域改造,檢測了9種結(jié)構(gòu)域,發(fā)現(xiàn)工程化的HN3 CAR-T細(xì)胞療法在治療由Wnt失調(diào)引起的侵襲性HCC方面顯示出強(qiáng)大的能力。除了針對改造CAR-T細(xì)胞已增加侵襲性以外,還可以增加GPC3-CAR-T細(xì)胞的增殖以及運(yùn)送,如增加實(shí)體瘤中的IL-2穩(wěn)定表達(dá),以促進(jìn)CAR-T細(xì)胞增殖以及運(yùn)送,Aspuria等[19]在2022年構(gòu)建了一個(gè)人類正交(orthogonal)配體/受體系統(tǒng),包括一個(gè)IL-2(STK-009)和一個(gè)突變的IL-2受體β(orthoIL-2Rβ),動物實(shí)驗(yàn)證明上述系統(tǒng)能夠增強(qiáng)GPC3的CAR-T細(xì)胞的抗腫瘤活性和持久性。在臨床研究中,目前報(bào)道了兩項(xiàng)自體第二代41BBζ GPC3-CART在晚期HCC成人中的連續(xù)Ⅰ期試驗(yàn)(NCT 02395250,NCT03146234)。第一項(xiàng)研究在環(huán)磷酰胺和基于氟達(dá)拉賓藥經(jīng)淋巴排泄后,輸注GPC3靶向的CAR-T細(xì)胞。共入組13例患者,9例出現(xiàn)細(xì)胞因子釋放綜合征(CRS),未出現(xiàn)3級或4級神經(jīng)毒性。3年的總生存率為10.5%,1年為42%,6個(gè)月為50.3%。試驗(yàn)中1例患者病情持續(xù)穩(wěn)定,在44.2個(gè)月依然生存。此外,臨床試驗(yàn)還在研究GPC3 CAR-T與檢查點(diǎn)抑制劑的聯(lián)合治療,特別是對PD-L1陽性的HCC。這項(xiàng)研究為進(jìn)一步開發(fā)“優(yōu)化的”GPC3-CAR-T方法提供了基礎(chǔ)[20-21]。為此,在GPC3-CAR-T設(shè)計(jì)上添加結(jié)構(gòu),包括41BBL和IL-15/IL-21的工程模塊(NCT02932956)等,旨在提高GPC3-CAR-T細(xì)胞的殺傷能力[22]。

聯(lián)合治療也是目前GPC3的研究熱點(diǎn)之一。為了防止靶點(diǎn)逃逸,Cao等[23]開發(fā)了一種新型的雙特異性T淋巴細(xì)胞嚙合劑CAR-T(CAR.T-BiTEs),驅(qū)動GPC3和BiTE針對CD3和B7H3的特異性CAR的表達(dá),體外功能檢測顯示,與GPC3 CAR-T細(xì)胞(GPC3靶向CAR-T細(xì)胞)和B7H3 CAR-T細(xì)胞(B7H3靶向CAR-T細(xì)胞)相比,GPC3-BiTE CAR-T細(xì)胞對GPC3+/B7H3+HCC細(xì)胞系表現(xiàn)出更大的細(xì)胞毒性活性。酪氨酸激酶抑制劑或免疫檢查點(diǎn)抑制劑的聯(lián)合治療方法(NCT03980288)[24],以及通過肝動脈輸注的靶向遞送(NCT03993743)都正在研究中[25]。多藥聯(lián)合是未來研究的改進(jìn)方向。

3.2 甲胎蛋白(AFP) CAR-T細(xì)胞

3.2.1 AFP生物學(xué)原理 AFP是一種591個(gè)氨基酸的糖蛋白,幾乎只在胚胎發(fā)育過程中表達(dá),以及慢性肝臟炎癥和60%～80%的HCC中表達(dá)[26]。AFP在細(xì)胞內(nèi)(加工成肽)和細(xì)胞表面均表達(dá),同時(shí)也在MHC Ⅰ類分子上表達(dá)。在生物學(xué)上,AFP促進(jìn)腫瘤增殖,其在體內(nèi)異常升高的表達(dá)水平預(yù)示著預(yù)后不良。但是由于AFP定位問題,其作為CAR-T細(xì)胞治療靶點(diǎn)設(shè)計(jì)依然存在一定的難度[27]。

3.2.2 AFP靶向CAR-T細(xì)胞臨床前研究及臨床研究 由于AFP的細(xì)胞內(nèi)定位及其在MHC上的表達(dá),CAR-T細(xì)胞設(shè)計(jì)難度較大。一項(xiàng)研究利用定位系統(tǒng)ET1402L1開發(fā)了第二代AFP-CAR-T(CD28/CD3ζ),這是一種完全人源化的組合,專門針對AFP158-166位點(diǎn)。該CAR-T的缺點(diǎn)是將患者限制在特定的HLA匹配群體中,但卻為CAR-T領(lǐng)域提供了針對細(xì)胞內(nèi)抗原的機(jī)會。這對于缺乏細(xì)胞表面靶點(diǎn)的實(shí)體瘤來說至關(guān)重要,可以擴(kuò)大CAR-T的治療范圍[28]。

在臨床前模型中,將攜帶HLA-A HCC SK-HEP-1-MG和HEPG2腫瘤細(xì)胞表達(dá)AFP158-166表位的免疫缺陷型NSG小鼠進(jìn)行AFP-CAR-T的瘤內(nèi)注射,與對照組相比抑制了腫瘤的生長[29]。在臨床研究方面,一項(xiàng)針對AFP陽性HCC的Ⅰ期臨床試驗(yàn)AFP-CAR-T(NCT03349255),給藥方法為靜脈注射和肝內(nèi)動脈給藥治療,目前已經(jīng)終止,至今無研究結(jié)果報(bào)道。但是目前看來AFP靶點(diǎn)依然充滿了潛力,只要解決了定位問題,臨床前景巨大[30]。

3.3 黏蛋白1(MUC1) CAR-T細(xì)胞

3.3.1 MUC1生物學(xué)背景 MUC1是一種膜結(jié)合的糖基化磷蛋白,其表達(dá)由炎癥細(xì)胞因子誘導(dǎo)。MUC1在HCC中過量表達(dá),并通過免疫組化分析驗(yàn)證為潛在的HCC靶點(diǎn),70.8%的HCC病例顯示MUC1強(qiáng)陽性,并且在正常肝組織中無表達(dá)。MUC1與HCC的預(yù)后和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。67.7%的MUC1陽性患者在3年內(nèi)發(fā)生轉(zhuǎn)移,而無MUC1表達(dá)的患者轉(zhuǎn)移率只有31%。因此MUC1是一種很有前景的CART肝癌靶點(diǎn)[31]。

3.3.2 MUC1靶向CAR-T細(xì)胞臨床前研究及臨床研究 在乳腺癌中已經(jīng)設(shè)計(jì)出MUC1 CAR-T細(xì)胞,名為TAB004(針對糖基化MUC1的mAb),在異種移植模型中具有靶點(diǎn)特異性的細(xì)胞毒性,以及細(xì)胞因子的分泌和減少腫瘤負(fù)荷。體外研究[32]顯示,MUC1對HCC細(xì)胞系有特異性的療效。

在臨床研究中一項(xiàng)包括HCC在內(nèi)的多種實(shí)體瘤的MUC1-CAR-T臨床試驗(yàn)正在進(jìn)行(NCT02587689),但結(jié)果尚無報(bào)道。一項(xiàng)用于頭頸部鱗狀細(xì)胞癌的第四代MUC1-IL-22分泌型CAR-T產(chǎn)品已立項(xiàng),目前正在進(jìn)行中[33]。

3.4 NKG2D配體(NKG2DL)CAR-T 細(xì)胞

3.4.1 NKG2DL生物學(xué)背景 NKG2DL是一種表達(dá)在NK和T淋巴細(xì)胞上的Ⅱ型跨膜蛋白,在NK細(xì)胞的激活和為CD8+與CD4+T淋巴細(xì)胞提供共刺激中發(fā)揮作用。NKG2DL在HCC中過度表達(dá),突出了其作為免疫治療靶點(diǎn)的潛力。MICA是靶向NKG2D的特定配體,在大多數(shù)正常組織中不表達(dá),并且定位在上皮細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中,為NKG2DL的CAR-T提供了一個(gè)潛在的靶點(diǎn)。但是需要警惕腫瘤外NK細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞耗竭,這也是未來研究的方向[34-35]。

3.4.2 NKG2DL靶向的CAR-T細(xì)胞臨床前研究以及臨床研究 第三代NKG2DL-CAR-T的體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在SMMC-7721和MHCC97H細(xì)胞系中存在特異性細(xì)胞毒性,細(xì)胞毒性具有NKG2DL依賴性。NKG2DL低的MICA和ULBP2細(xì)胞不易受影響,但NKG2DL高的HEP3B易受影響[36]。在體內(nèi)研究中,NKG2DL-CAR-T對接種SMMC-7721皮下腫瘤的NOD-Prkdcscid//Il2rgtm1/Bcgen小鼠(B-NDG)有效。50%(3/6)的治療小鼠在灌注后19天達(dá)到完全緩解(CR),50%(3/6)達(dá)到部分緩解(PR)[36]。已經(jīng)開展臨床研究的NKR-2(NCT02203825)在7例急性骨髓性白血病患者和5例多發(fā)性骨髓瘤患者Ⅰ期臨床試驗(yàn)報(bào)告中沒有明顯的毒性或其他不良事件[37-38]。完整的臨床數(shù)據(jù)正在等待后續(xù)劑量升級。但是到目前為止,尚無HCC的數(shù)據(jù)。

3.5 其他潛在的用于治療HCC的CAR-T靶點(diǎn) 除了上述靶點(diǎn)外,還有很多有潛力的靶點(diǎn)可以用于HCC的CAR-T治療。CD147是一種跨膜糖蛋白,在HCC中高度表達(dá),在增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮作用,是一種潛在的生物標(biāo)志物。Zhang等[39]開發(fā)了一個(gè)抗CD147-CAR-T的“tet-on”誘導(dǎo)系統(tǒng),需要給予多西環(huán)素以獲得CAR活性。停用多西環(huán)素后,體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中CD147-HepG2靶細(xì)胞殺傷率從50%降至10%。在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中,使用皮下Huh-7 NSG小鼠模型,與單獨(dú)使用CD147 CAR相比,CD147 CAR聯(lián)合多西環(huán)素治療后腫瘤體積明顯減少。目前,一項(xiàng)Ⅰ期臨床試驗(yàn)正在進(jìn)行中(NCT03993743)[40]。

黑色素瘤抗原基因家族(MAGE)幾乎只在癌癥組織中表達(dá)。在68%的HCC腫瘤中有MAGE-1和-3 mRNA的表達(dá)[41]。從功能上講,MAGE的異常表達(dá)可以導(dǎo)致信號的改變和腫瘤的發(fā)生。但是到目前為止,MAGE-CAR-T在HCC中的證據(jù)有限。紐約食管鱗狀細(xì)胞1(NY-ESO-1),一種癌癥-睪丸抗原(CTA),常見于多種侵襲性腫瘤中的癌癥相關(guān)蛋白,它在包括乳腺癌、膀胱癌、前列腺癌、黑色素瘤、NSCLC、肝細(xì)胞癌以及卵巢癌在內(nèi)的多種癌癥中廣泛表達(dá),表達(dá)范圍為20%～80%,是全身最具免疫原性的抗原之一,因此,被認(rèn)為是腫瘤免疫治療的理想靶抗原[42]。目前,只有針對NY-ESO-1的工程TCR-T方法在HCC中進(jìn)行了試驗(yàn)(NCT01967823)[43]。

4 聯(lián)合治療

4.1 與溶瘤病毒的聯(lián)合治療 溶瘤病毒是一種抗腫瘤藥物,具有裂解性和免疫原性,可以選擇性地感染和殺死腫瘤細(xì)胞。在FDA批準(zhǔn)Talimogene laherparepvec (T-VEC)之后,溶瘤病毒療法在癌癥治療中受到廣泛關(guān)注。溶瘤病毒可以通過基因工程在腫瘤微環(huán)境中表達(dá)許多轉(zhuǎn)基因,增強(qiáng)腫瘤特異性T淋巴細(xì)胞的效應(yīng)活性,對實(shí)體惡性腫瘤,溶瘤病毒具有與CAR-T細(xì)胞協(xié)同作用的特殊能力。有1項(xiàng)獲批的臨床研究(NCT03740256)[44]驗(yàn)證了CAR-T和溶瘤病毒聯(lián)合治療HER2陽性惡性腫瘤的情況。此外,預(yù)測結(jié)合兩種強(qiáng)效促炎癥免疫療法的安全性也很困難。雖然T-VEC的臨床前價(jià)值已經(jīng)確認(rèn),但聯(lián)合溶瘤病毒可能會增加CAR-T細(xì)胞副作用的嚴(yán)重程度。因此,需要謹(jǐn)慎考慮安全劑量。

4.2 與免疫檢查點(diǎn)抑制劑聯(lián)合使用 目前CAR-T細(xì)胞治療實(shí)體瘤的問題之一就是存在免疫抑制性腫瘤微環(huán)境。多種因素參與了這種免疫抑制性微環(huán)境的發(fā)展,包括抑制性分子,如PD-1、CTLA-4、LAG-3等。研究表明,免疫檢查點(diǎn)抑制劑聯(lián)合CAR-T細(xì)胞治療可以極大地提高CAR-T細(xì)胞療效。這些抗體可以預(yù)防T淋巴細(xì)胞的耗竭,保持其效應(yīng)功能。免疫檢查點(diǎn)抑制劑與CAR-T細(xì)胞聯(lián)合治療的多項(xiàng)研究已經(jīng)開啟(NCT01454596, NCT03030001, NCT02873390, NCT03179007, NCT02862028, NCT03182803)[45]。Li等[46]在2023年建立了針對GPC3和阻礙PD-1/PD-L1結(jié)合的雙目標(biāo)CAR-T細(xì)胞,新構(gòu)建的雙靶點(diǎn)CAR-T細(xì)胞在HCC中表現(xiàn)出比其他常見的單靶點(diǎn)對應(yīng)細(xì)胞更強(qiáng)的腫瘤抑制作用,這提示了在HCC治療中加強(qiáng)CAR-T細(xì)胞活性的潛力。

5 影響CAR-T治療效果的因素以及解決策略

CAR-T細(xì)胞療法在實(shí)體瘤中的應(yīng)用仍面臨著諸多挑戰(zhàn),諸如靶點(diǎn)逃避、靶向非腫瘤效應(yīng)、CAR-T細(xì)胞擴(kuò)增、腫瘤內(nèi)浸潤受限以及免疫抑制微環(huán)境等因素,限制了CAR-T細(xì)胞在實(shí)體腫瘤中的研發(fā)進(jìn)程。

5.1 靶點(diǎn)逃逸 靶點(diǎn)逃逸是最具挑戰(zhàn)性的難點(diǎn)。雖然單一抗原靶向的 CAR-T 細(xì)胞具有較高的應(yīng)答率,但使用這些CAR-T細(xì)胞治療的大部分患者腫瘤細(xì)胞會出現(xiàn)目標(biāo)抗原表達(dá)的部分或完全喪失,導(dǎo)致耐藥,即為靶點(diǎn)逃避效應(yīng)[47]。

當(dāng)前針對CAR-T細(xì)胞在實(shí)體瘤治療中所產(chǎn)生的靶點(diǎn)逃避效應(yīng),解決策略聚焦于靶向多種抗原:即使用雙CAR結(jié)構(gòu)或串聯(lián)CAR結(jié)構(gòu),這是一種包含兩個(gè)或更多單鏈抗體的單CAR 結(jié)構(gòu),能夠同時(shí)靶向多個(gè)腫瘤抗原。研究[48]報(bào)道與單靶點(diǎn)CAR-T 細(xì)胞治療相比,串聯(lián) HER2 和 IL13Ra2 CAR 結(jié)構(gòu)在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中產(chǎn)生了更好的抗腫瘤反應(yīng),提示優(yōu)化靶抗原選擇的重要性。然而目前針對肝內(nèi)膽管癌相關(guān)CAR-T細(xì)胞治療的研究極少,相關(guān)CAR-T細(xì)胞治療的改進(jìn)策略有待新的探索和臨床驗(yàn)證。

5.2 劑量影響因素 對肝癌患者使用多大CAR-T細(xì)胞劑量一直存在爭議,其機(jī)制主要為低劑量可能加速T淋巴細(xì)胞耗竭,而高劑量又會增加毒性,并且劑量對療效也有很大影響。

為了解決劑量與療效的關(guān)系,一項(xiàng)研究在惡性黑色素瘤CAR-T治療進(jìn)行了機(jī)器學(xué)習(xí)預(yù)測劑量對T淋巴細(xì)胞群動態(tài)的影響。發(fā)現(xiàn)最低劑量(5 000萬個(gè)細(xì)胞)不能減少腫瘤,并導(dǎo)致T淋巴細(xì)胞耗竭加速。在腫瘤負(fù)荷比不足的情況下,由于低劑量或擴(kuò)張能力,輸注的CAR-T細(xì)胞將在起效之前耗盡。1.5億～4.5億個(gè)細(xì)胞劑量下T淋巴細(xì)胞耗竭減緩,并且具有細(xì)胞殺傷效應(yīng),因此,療效與劑量有關(guān)。推測劑量影響因素可能是由患者的免疫狀態(tài)預(yù)先決定的[49]。

5.3 CAR-T細(xì)胞運(yùn)送和持久性因素 加強(qiáng)CAR-T的運(yùn)送和進(jìn)入HCC腫瘤部位是目前亟待解決的問題。CAR-T細(xì)胞治療在HCC存在物理屏障,HCC普遍具有纖維化細(xì)胞外基質(zhì)(ECM),而CAR-T細(xì)胞缺乏肝素酶,無法穿過ECM[50]。

為了解決這項(xiàng)問題,部分研究正在探究可降解ECM的CAR-T細(xì)胞是否在HCC治療中具有運(yùn)送優(yōu)勢。趨化因子也是CAR-T細(xì)胞運(yùn)送作用的一個(gè)重要影響因素,其在白細(xì)胞遷移/歸宿和癌癥遷移/進(jìn)展中起著關(guān)鍵作用。在CAR-T產(chǎn)品中設(shè)計(jì)表達(dá)趨化因子受體,可以利用腫瘤相關(guān)的趨化因子梯度來增強(qiáng)CART的腫瘤運(yùn)送。CXCL2在HCC中高表達(dá),在HCC模型中,GPC3-CAR-T細(xì)胞上過表達(dá)CXCR2L受體(CXCR2)可以增強(qiáng)CAR-T在腫瘤部位的浸潤和擴(kuò)增[17]。

5.4 CAR-T免疫抑制腫瘤微環(huán)境因素 實(shí)體瘤內(nèi)存在免疫抑制信號,也是CAR-T細(xì)胞治療所面臨的困境,如何克服免疫抑制微環(huán)境也是CAR-T目前研究的關(guān)鍵點(diǎn)。研究[51]發(fā)現(xiàn),CAR-T衍生的細(xì)胞因子可以激活宿主的巨噬細(xì)胞,并將腫瘤微環(huán)境從免疫抑制性轉(zhuǎn)變?yōu)槊庖叽碳ば?。在卵巢癌?分泌IFN-γ和GM-CSF的CAR-T細(xì)胞可以激活腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞,減少調(diào)節(jié)因子的表達(dá),并增加IL-12的產(chǎn)生,促進(jìn)內(nèi)源性免疫并抑制腫瘤生長[52]。免疫檢查點(diǎn)抑制劑作為一種潛在的組合方法,可能與CAR-T細(xì)胞同時(shí)發(fā)揮作用。具有內(nèi)置檢查點(diǎn)阻斷功能的CAR-T工程可以提供一種“一體化”戰(zhàn)略,例如PD-1缺陷的GPC3-CART[46,53]。

6 展望

近年來,原發(fā)性肝癌免疫檢查點(diǎn)抑制劑為主導(dǎo)的免疫/免疫聯(lián)合治療方案給患者帶來很好的臨床獲益,但仍然面臨原發(fā)耐藥和繼發(fā)耐藥的難題,繼續(xù)研發(fā)新型腫瘤免疫療法仍然是熱點(diǎn)方向。CAR-T細(xì)胞在血液腫瘤領(lǐng)域的臨床推廣應(yīng)用使得實(shí)體瘤領(lǐng)域的研究也越來越多,隨著生物科學(xué)技術(shù)的不斷進(jìn)步,CAR-T細(xì)胞各種改良技術(shù)的優(yōu)勢也逐漸顯露出來,并且在臨床研究中取得了較好的應(yīng)用前景。而最佳適應(yīng)人群、細(xì)胞劑量、輸液方式和合適的聯(lián)合治療方案是進(jìn)一步需要探討的問題。另外,建立以免疫學(xué)科專家為主導(dǎo)、輔以臨床醫(yī)生的多中心腫瘤免疫治療團(tuán)隊(duì),將極大推動 CAR-T技術(shù)的創(chuàng)新,并極有可能提高未來原發(fā)性肝癌免疫治療的臨床效果。

利益沖突聲明：本文不存在任何利益沖突。

作者貢獻(xiàn)聲明：李爽、劉哲睿負(fù)責(zé)提出研究選題,撰寫論文;陸蔭英、趙琦負(fù)責(zé)調(diào)研整理文獻(xiàn),修訂論文,終審論文。