張 紅,丁涵露,2,陳 瑾,2

(1.西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院臨床醫(yī)學(xué)院,四川 瀘州 646000;2.四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院·四川省人民醫(yī)院,四川 成都 610072)

慢性腎臟病是指多種原因?qū)е碌穆阅I臟結(jié)構(gòu)和功能障礙(腎臟損害病史大于3個(gè)月),其中包括腎小球?yàn)V過(guò)率(glomerular filtration rate,GFR)正常和不正常的病理?yè)p傷、血液或尿液成分異常,及影像學(xué)檢查異常,或不明原因GFR<60 ml/min·1.73m2超過(guò)3個(gè)月。中國(guó)慢性腎臟病(chronic kidney disease,CKD)患病率為10.8%[1]。CKD 5期的患者采用腎臟替代治療,但研究表明,在治療期間依然存在毒素潴留的問(wèn)題[2]。腸道菌群是一個(gè)具有營(yíng)養(yǎng)和保護(hù)功能的動(dòng)態(tài)共生生態(tài)系統(tǒng),與宿主的代謝系統(tǒng)保持著持續(xù)的相互作用。病理情況下,腸道菌群的失衡,某些細(xì)菌過(guò)度生長(zhǎng),慢性激活免疫系統(tǒng),從而引發(fā)疾病[3.4]。透析患者和健康對(duì)照組的腸道菌群在組成和功能存在差異,然而這些結(jié)果并不一致[5-8]。本研究比較了血液透析(hemodialysis,HD)、腹膜透析(peritoneal dialysis,PD)患者和健康對(duì)照者的腸道菌群差異,并進(jìn)行了腸道菌群與透析患者預(yù)后相關(guān)性分析。

1 資料與方法

1.1 一般資料納入2005年1月至2022年6月在四川省人民醫(yī)院隨訪的患者63例。納入標(biāo)準(zhǔn):在四川省人民醫(yī)院隨訪的HD及PD患者,治療時(shí)間大于3個(gè)月。排除標(biāo)準(zhǔn):①合并惡性腫瘤、肝硬化、腸手術(shù)、腸易激綜合征的患者;②標(biāo)本采集前1周使用益生菌、益生元或抗生素;③孕婦或腎移植受者;④素食者或純素食者的患者。本研究經(jīng)我院倫理委員會(huì)審核通過(guò)(編號(hào):2018195),并由患者簽署臨床標(biāo)本收集檢測(cè)知情同意書(shū)。依據(jù)患者的治療模式分為PD組27例、HD組36例。對(duì)照組為2018年6月至2022年6月于四川省人民醫(yī)院體檢中心體檢的健康人群57例。所有患者隨訪至2022年6月或患者死亡或失訪結(jié)束。

1.2 方法

1.2.1一般資料采集 收集患者人口學(xué)資料,包括開(kāi)始腹透時(shí)的年齡、性別、CKD的原因。血紅蛋白、血漿白蛋白、尿素、血清肌酐、尿素氮、甘油三酯、膽固醇、估算腎小球?yàn)V過(guò)率。

1.2.2糞便樣本收集 在糞便標(biāo)本采集前7天,禁止使用益生菌或食用酸奶。保持糞便中部均勻部分約1克,避免食物殘留。將糞便收集到收集管中,4小時(shí)內(nèi)放入-80 ℃冰箱中。女性避免進(jìn)行生理周期取樣。

1.2.3腸道菌群檢測(cè) 對(duì)DNA樣本進(jìn)行定量,并選擇16S rRNA的V3-V4高變區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。使用Trimmomatic(v 0.36)得到原始數(shù)據(jù),然后用FLASH軟件(v1.2.11)拼接雙端序列,要求序列重疊至少10 bp,采用滑動(dòng)窗口法對(duì)序列做質(zhì)量過(guò)濾,去除接頭污染和低質(zhì)量數(shù)據(jù),將重疊的成對(duì)端讀數(shù)合并到標(biāo)簽中(標(biāo)簽與OTU的序列相似性為97%),使用核糖體數(shù)據(jù)庫(kù)給OTU代表序列分配分類等級(jí)。最后,基于OTU和分類等級(jí)進(jìn)行α多樣性、β多樣性以及不同物種的篩選進(jìn)行了分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法使用SPSS 26.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。正態(tài)分布計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,偏態(tài)分布計(jì)量數(shù)據(jù)以中位數(shù)(四分位間距)表示,三組以上比較采用ANOVA檢驗(yàn),多重檢驗(yàn)采用Bonferroni分析。采用非參數(shù)檢驗(yàn)(Mann WhitneyU檢驗(yàn)或Kruskal-Wallis) 對(duì)非正態(tài)分布的參數(shù)進(jìn)行分析。計(jì)數(shù)資料以百分率表示,比較采用卡方檢驗(yàn)。P<0.05被認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 三組臨床資料比較HD組共36例(其中死亡2例,失訪3例),男18例,女18例,年齡(53.89±14.08)歲;PD組27例(其中死亡2例,失訪1例,5例轉(zhuǎn)為腎移植,6例轉(zhuǎn)為HD),男19例,女8例,年齡(52.26±14.29)歲;57例為健康對(duì)照組,男31例,女26例,年齡(54.89±5.33)歲,3組患者年齡、性別比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05),而HD與PD組的血肌酐、血尿素氮、血尿酸值顯著升高(均P<0.001)。對(duì)照組的BMI、膽固醇高于HD組與PD組(P<0.05)。PD組的甘油三酯高于HD組及對(duì)照組(P=0.008)。見(jiàn)表1。

表1 PD組、HD組與對(duì)照組的一般資料比較

2.2 腸道菌群類別分析如圖1所示,不同顏色代表不同組,每個(gè)圓圈內(nèi)的數(shù)字表示各組中的OTU數(shù)量,重疊區(qū)域表示各組中的共同OTU集合。三組所共有的OTU數(shù)為645,血透組、腹透組、對(duì)照組的OTU數(shù)分別為916、727、1405,其中透析組的OTU數(shù)明顯低于對(duì)照組,腹透組與血透組之間差距不大PCA構(gòu)建二維圖(圖2),顯示血透組及腹透組與對(duì)照組之間距離較遠(yuǎn),第一主成分的貢獻(xiàn)為12.04%,第二主成分的貢獻(xiàn)為8.98%。

圖1 不同組別之間的Venn圖

圖2 不同組別OTU豐度的主成分分析

2.3 組及組間α多樣性分析健康對(duì)照組與透析患者相比,Sobs、Chao、Ace、Shannon指數(shù)顯著升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均小于0.05)。說(shuō)明健康對(duì)照組的群落均勻性和物種的多樣更高,而PD組與HD組的物種豐度無(wú)明顯差異。見(jiàn)表2。

2.4 各組腸道菌群多樣性及門、屬水平的分類分布根據(jù)不同分類等級(jí)(門、綱、目、科、屬)的物種組成比例情況可以看出,從門水平上看(圖3),各組主要由擬桿菌門、厚壁菌門、變形菌門、梭狀菌門組成,其中對(duì)照組還有一定比例的放線菌門,血透組中存在一定量的疣微菌門。在屬水平上(圖4),對(duì)照組中的雙歧桿菌、普雷沃特拉菌與另外兩組比較增多,擬桿菌屬減少。HD組的糞球菌屬和普雷沃特拉菌低于對(duì)照組、PD組,擬桿菌屬增高。PD組的瘤胃球菌屬增高。

圖4 各組在屬水平上的相對(duì)豐度

2.5 腸道菌群與預(yù)后相關(guān)性分析通過(guò)顯著性分析發(fā)現(xiàn),HD組中2例死亡病例普雷沃特拉菌減少。PD組中2例死亡,其在門水平主要為擬桿菌門、厚壁菌門、變形菌門、梭桿菌門,屬水平上薩特氏菌、瘤胃球菌屬增高,普雷沃特拉菌、埃希菌屬、土里西桿菌減少。危險(xiǎn)因素分析顯示普雷沃特拉菌是影響透析患者預(yù)后死亡的危險(xiǎn)因素(P=0.047)。見(jiàn)表3。Spearman相關(guān)性分析顯示普雷沃特拉菌與患者生存時(shí)間負(fù)相關(guān)性(r=-4.18,P=0.001)。

表3 影響透析患者預(yù)后的危險(xiǎn)因素分析

3 討論

HD和PD都能去除體內(nèi)多余的水分以減少容量負(fù)荷,清除代謝廢物(如肌酐、尿素氮和其他小分子毒素),并維持電解質(zhì)和酸堿平衡。這些都是影響腸道微生物的因素。但是,幾乎沒(méi)有研究證明HD和PD患者腸道微生物區(qū)系的影響。本研究比較了PD和HD患者與健康對(duì)照者腸道菌群差異,并且分析了與PD和HD組患者預(yù)后相關(guān)的腸道菌群。

研究觀察到門水平上各組主要由擬桿菌門、厚壁菌門、變形菌門、梭狀菌門組成。對(duì)照組的放線菌門升高,HD、PD患者的擬桿菌門增高。屬水平上,對(duì)照組中的雙歧桿菌、擬桿菌屬、普雷沃特拉菌增多,HD組中的小桿菌屬、糞球菌屬減少。PD組中死亡的2例薩特氏菌、瘤胃球菌屬增高,普雷沃特拉菌、埃希菌屬、土里西桿菌減少;轉(zhuǎn)為血液透析的6例患者考拉桿菌屬、鏈球菌屬增高,土里西桿菌減少。HD組中死亡的2例優(yōu)桿菌屬、鏈球菌屬增高,普雷沃特拉菌、顫螺菌屬、土里西桿菌減少。

CKD患者腸道微生態(tài)腸道菌群失調(diào)常表現(xiàn)為菌群種類、相對(duì)豐度及其代謝產(chǎn)物改變[8]。目前已經(jīng)有許多研究將腸道菌群變化與CKD的發(fā)病機(jī)制聯(lián)系起來(lái)。終末期腎病患者尿毒癥毒素聚集,腸道環(huán)境改變,腸道中普氏桿菌減少,擬桿菌增多[9]。這與本研究結(jié)果相似。血液透析在超濾過(guò)程中維持血流動(dòng)力學(xué)穩(wěn)定的代償機(jī)制下內(nèi)臟血流量的減少可能會(huì)導(dǎo)致腸道低灌注,從而破壞腸道屏障,增加細(xì)菌易位的風(fēng)險(xiǎn)。Wang等發(fā)現(xiàn)CKD5期的患者腸道內(nèi)雙歧桿菌減少,慢型埃格特氏菌增多[10]。另一項(xiàng)對(duì)73名受試者進(jìn)行的臨床研究發(fā)現(xiàn),CKD患者和對(duì)照組之間存在31個(gè)系統(tǒng)類型的差異[11]。研究顯示與非透析的CKD患者相比,HD可以改善腸道微生物區(qū)系紊亂,包括增加雙歧桿菌和嗜酸乳桿菌,減少大腸桿菌和糞腸球菌[5]。Luo等的研究發(fā)現(xiàn)PD對(duì)CKD患者腸道菌群沒(méi)有顯著影響[6]。相比之下,Hu等的研究比較了PD、HD、非透析CKD和健康對(duì)照組的腸道微生物區(qū)系,并報(bào)道了PD降低了微生物多樣[7]。此外,本研究觀察到各組的梭狀菌門有所升高。腸道微生物群受到不同環(huán)境、飲食和生活習(xí)慣的影響,并且受到患者依從性的影響,這可能解釋產(chǎn)生差異的原因。

本研究表明普雷沃特拉菌與患者生存呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)。由于培養(yǎng)的局限性,普雷沃特拉菌與其他屬相比受到的關(guān)注較少。普雷沃特拉菌屬于革蘭氏陰性厭氧菌,是口腔中最具優(yōu)勢(shì)的屬之一,同時(shí)也在人類的皮膚、陰道和胃腸道中被發(fā)現(xiàn)。其與多種疾病有關(guān),包括炎癥性自身免疫性疾病、機(jī)會(huì)性感染、細(xì)菌性陰道病以及口腔生物膜形成和疾病。相反,另一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)普雷沃特拉菌與胰島素抵抗有關(guān),而較低基線水平的普雷沃特拉菌與超重個(gè)體在地中海飲食干預(yù)后胰島素抵抗的降低有關(guān)[12]。感染中最常見(jiàn)的是口腔感染,報(bào)告最多的是牙周感染和牙髓感染,肌肉骨骼、頭頸部、下呼吸道和皮膚感染少見(jiàn),此外,口腔感染也可能導(dǎo)致繼發(fā)性全身感染或與器官相關(guān)的感染[13]。研究表明,在關(guān)節(jié)炎小鼠中普雷沃特拉菌通過(guò)擴(kuò)大腸屬Allobaculum、增加丁酸鹽產(chǎn)量來(lái)預(yù)防關(guān)節(jié)炎[14]。除此之外,普雷沃特拉菌可通過(guò)調(diào)控宿主NF-κB/C-myc影響育齡婦女持續(xù)人類乳頭瘤病毒感染和宮頸病變的發(fā)生[15]。在克羅恩病和潰瘍性結(jié)腸炎患者中,普雷沃特拉菌和產(chǎn)黑素假單胞菌的豐度顯著增加,因此普雷沃特拉菌被認(rèn)為是與克羅恩病相關(guān)的一個(gè)潛在標(biāo)志[16]。Yang等的研究發(fā)現(xiàn)普氏外膜蛋白負(fù)責(zé)Th17的發(fā)展、激活以及IL-17B和IL-17A的表達(dá),最終促進(jìn)肺纖維化, 這些結(jié)果表明共生普氏桿菌不僅加重了呼吸道免疫反應(yīng),而且能夠調(diào)節(jié)病原誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)[17]。目前普雷沃特拉菌在慢性腎臟病中的作用機(jī)制尚不明確。

本研究的優(yōu)勢(shì)為觀察了腸道菌群與CKD患者的預(yù)后關(guān)系,反映了四川地區(qū)CKD患者的腸道菌群變化。本研究尚存在有一定的局限性:首先,它是一個(gè)有地域限制的單中心研究。其次,本研究在樣本收集時(shí)是依據(jù)患者自愿入組的原則,沒(méi)有進(jìn)行隨機(jī)分組。但本研究顯示了不同透析治療模式的CKD患者腸道微生物多樣性和群落變化,發(fā)現(xiàn)了腸道菌群變化與患者生存的相關(guān)性。在此基礎(chǔ)上,我們將針對(duì)普氏菌屬與CKD的關(guān)系深入研究,為通過(guò)調(diào)節(jié)腸道菌群防治CKD的治療提供依據(jù)。