何 皎，孫曉菲，潘 琳，馬浩原

（河南科技大學食品與生物工程學院，微生物資源開發(fā)與利用校級重點實驗室，河南洛陽 471023）

0 引言

香菇在我國菌類人工栽培品種中，是第一大類食用菌，其富含蛋白質(zhì)、脂肪、維D 和鈣、磷等多種營養(yǎng)物質(zhì)，因其高蛋白低脂肪的特性，已成為健身人群的餐桌首選[1]。此外，其還具有較高的藥用價值[2]。研究發(fā)現(xiàn)，香菇多糖具有抑制腫瘤細胞增殖、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)等生物活性，且具有較強的安全性[3-5]。食用香菇能夠滿足消費者一次攝入補充多種營養(yǎng)的品質(zhì)需求。

目前，還少見有關不同地區(qū)香菇營養(yǎng)成分與多糖含量之間關系探究方面的報道，同時選擇合適的香菇作為香菇多糖的提取物，是減少成本獲得較多優(yōu)質(zhì)抗氧化性多糖的前提[6]。因此，檢測分析出產(chǎn)香菇中香菇多糖含量大的香菇產(chǎn)地對香菇多糖提取工藝、相應生物活性的研究具有重要意義[7-8]。不同地區(qū)種植的香菇，因氣候和栽培技術影響，香菇的產(chǎn)量與各種營養(yǎng)成分有所不同，香菇多糖的質(zhì)量和含量因菌種的不同而不同，而且還取決于香菇的產(chǎn)地、培養(yǎng)條件和生長情況[9-11]。產(chǎn)量排名前4 位的香菇種植地區(qū)分別為河南、河北、福建、湖北及陜西，產(chǎn)量占全國香菇總產(chǎn)量的71.39%，是優(yōu)質(zhì)香菇材料選擇地[12]。

以河南白云山、河北遵化、湖北隨州、福建古田、浙江慶元5 個地區(qū)的香菇為原料，并對其蛋白質(zhì)含量、脂肪含量、總糖含量、灰分等指標檢測分析，探究各營養(yǎng)成分之間的關系及地區(qū)性差異，并利用超聲輔助經(jīng)正交試驗優(yōu)化香菇多糖的提取方案，以DPPH 自由基清除率為指標對所提香菇多糖的抗氧化性能進行分析，以期為指導均衡飲食及生產(chǎn)香菇多糖保健系列產(chǎn)品的研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 材料與試劑

試驗所用干香菇產(chǎn)地分別為河南白云山、福建古田、浙江慶元、河北遵化、湖北隨州5 個地區(qū)；DPPH（分析純），海藍季科技發(fā)展有限公司提供；其他試劑均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 供試品的制備

5 個產(chǎn)地的干香菇于恒溫烘箱中65 ℃下二次烘干后粉碎，過60 目篩，置于棕色瓶中備用。

1.2.2 蛋白質(zhì)的測定

蛋白質(zhì)的測定方法，根據(jù)董松果和王亞威等人[13-14]的方法修改如下。消化管試劑配制：準確稱取2 g 的樣品，記為m，置于消化管中，并按順序加入0.2 g硫酸銅與6 g 硫酸鉀。最后，加入20 mL 濃硫酸。

式中：X——蛋白質(zhì)的含量，g/100 g；

V1——試液消耗硫酸標準滴定溶液的體積，mL；

V2——空白對照消耗硫酸標準滴定溶液的體積，mL；

C——硫酸標準滴定溶液的濃度，mol/L；

m——香菇的質(zhì)量，g；

V3——吸收消化液的體積，mL；

F——將氮換算成蛋白質(zhì)時的系數(shù)。

1.2.3 脂肪的測定

測定方法根據(jù)遲全勃等人[15]測量如下，準確稱取樣品5 g，使用索氏抽提器，將樣品處理完畢后，置入恒溫箱內(nèi)，然后移入干燥箱中，冷卻后稱量，計算含油量。

式中：X——試樣中的脂肪含量，g/100 g；

m1——接收瓶和脂肪的質(zhì)量，g；

m0——接收瓶的質(zhì)量，g；

m2——試樣的質(zhì)量，g。

1.2.4 多糖含量的測定

測定方法根據(jù)遲全勃等人[15]修改如下，取6 支試管，分別加入0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mL 葡萄糖標準溶液，并加入蒸餾水至1.0 mL。然后加入質(zhì)量分數(shù)為5%的苯酚溶液1.0 mL，5.0 mL 濃硫酸，靜置10 min。漩渦混合后，30 ℃水浴20 min。于波長490 nm 處測吸光度。以葡萄糖質(zhì)量濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制標準曲線。

在試管中取0.2 mL 測試液，加蒸餾水至1.0 mL。以空白溶液進行對照，讀取吸光度，利用標準曲線計算出多糖的含量。

式中：W——多糖含量，

V1——定容后的樣品體積，mL；

V2——比色測定過程中的樣品測定液體積，mL；

m1——標準曲線中讀出的樣品測定液的含糖量，μg；

m2——樣品的質(zhì)量，g；

ω——樣品的含水量，%。

1.2.5 灰分的測定

取來自5 個產(chǎn)地的干香粉，將藍黑墨水和氯化鐵溶液按1∶1 混勻，用棉簽沾取后在事先準備好的坩堝上進行標號1，2，3，4，5 這5 組并烘干。然后，將5 組坩堝依次放入分析天平中，每個坩堝放入5 g 香菇粉。接下來，將坩堝放在電爐上進行碳化,冷卻后取出，在分析天平上準確測量出5 組坩堝的質(zhì)量。

式中：X1——試樣中灰分的含量，g/100 g；

m1——灰分和坩堝的總質(zhì)量，g；

m2——坩堝的質(zhì)量，g；

m3——試樣和坩堝的總質(zhì)量，g；

ω——試樣的干物質(zhì)含量，%。

1.2.6 香菇多糖抗氧化測定

（1） 提取工藝流程。準確稱取3 份香菇粉各1 g分別于250 mL 錐形品，按預設料液比各加入適量蒸餾水攪拌均勻，在預設超聲功率的條件下處理相應時間。處理好的樣品得濾液，量出其體積并倒入燒杯中，按其體積的3 倍加入無水乙醇，4 ℃醇沉12 h后，以轉(zhuǎn)速4 000 r/min 離心10 min，取沉淀于燒杯中，蒸餾水定容至100 mL，得到含香菇多糖溶液后進行冷凍干燥，最后進行多糖含量測定與計算。

（2） 多糖含量測定與計算。①葡萄糖標準曲線的制作。用移液管分別移取配置好的葡萄糖標準溶液1，2，4，6，8，10 mL 于6 個容量瓶中，用蒸餾水定容至100 mL，所得葡萄糖標準溶液的質(zhì)量濃度分別為10，20，40，60，80，100 mg/L。分別取各標準溶液1 mL 于25 mL 試管中，并以1 mL 的蒸餾水作為空白對照。準確量取4 mL 硫酸蒽酮加入各試管中混勻，迅速放入冰浴中冷卻。加樣工作全部完成后，置于100 ℃水浴中加熱至沸騰10 min 后取出，冷卻至室溫。以對照組作為參比溶液，使用分光光度計于波長620 nm 處檢測各樣品的吸光度。以葡萄糖標準溶液的質(zhì)量濃度作為自變量，吸光度作為因變量，建立線性關系，繪制葡萄糖標準曲線。②多糖提取液的處理。得到香菇粗多糖的提取液后，移取1 mL 樣品液于容量瓶中，用蒸餾水定容至100 mL，用于多糖含量的測定。③多糖吸光度值的測定。用移液管移取1 mL 稀釋后的香菇多糖溶液，加入試管中，移取硫酸蒽酮溶液4 mL，混勻，迅速冰浴。加樣完成后，將水浴鍋內(nèi)100 ℃水浴至沸騰30 min。水浴加束后，冷卻至室溫，以空白對照為參比，于波長620 nm 處用分光光度計測定其吸光度A。

葡萄糖標準曲線見圖1。

圖1 葡萄糖標準曲線

多糖含量的計算：將記錄的數(shù)據(jù)求平均值得到A，將A 代入葡萄糖標準曲線中得到香菇多糖稀釋液的質(zhì)量濃度C（mg/L），香菇多糖提取液的質(zhì)量濃度為100×Cmg/L，由公式（5） 計算可得多糖含量：

式中：C——根據(jù)葡萄糖標準曲線所得的香菇多糖質(zhì)量濃度，g/mL；

V——得到的香菇多糖提取液的總體積，mL。

多糖提取率計算，依據(jù)式（6）：

式中：m——香菇多糖含量，mg；

M——香菇粉末的質(zhì)量，g。

1.2.7 香菇多糖DPPH·清除能力測定

檢測方法為：將提取液進行50 倍稀釋后作為待測液。吸取2.0 mL 待測液，加入0.1 mmol/L DPPH·乙醇溶液4.0 mL，搖勻26 ℃恒溫避光反應30 min，以無菌水調(diào)零，于波長517 nm 處測定吸光度A1，用無菌水代替DPPH 所測值為吸光度A2，用無菌水代替待測液所測值為吸光度A0，同時以1 mg/mL 維C溶液作為陽性對照，計算活性。

1.2.8 香菇多糖提取的單因素試驗

（1） 料液比對香菇多糖提取率的影響。固定超聲功率300 W，超聲時間30 min，超聲溫度50 ℃，料液比梯度設置為1∶20，1∶30，1∶40，1∶50，1∶60，進行試驗。

（2） 超聲功率對香菇多糖提取率的影響。固定料液比1∶30，超聲時間30 min，超聲溫度50 ℃，設置超聲功率梯度為200，250，300，350，400 W，進行試驗。

（3） 超聲時間對香菇多糖提取率的影響。固定料液比1∶30，超聲功率300 W，超聲溫度50 ℃，設置超聲時間梯度為10，20，30，40，50 min，進行試驗。

1.2.9 香菇多糖的提取正交試驗

根據(jù)單因素試驗結果進行正交試驗設計，分別選取料液比（A）、超聲時間（B）、超聲功率（C） 3 個因素為考查因素，以多糖得率為指標，采用L9（34）正交試驗表進行三因素三水平正交試驗選出多糖得率最佳提取工藝。

1.2.10 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

試驗均進行3 次重復操作，所有數(shù)據(jù)用X±s表示。采用Origin 8.0 等軟件對數(shù)據(jù)進行處理與分析。

2 結果與分析

2.1 不同產(chǎn)地對香菇中蛋白質(zhì)含量的影響

5 個不同產(chǎn)地干香菇中蛋白含量測定結果見圖2。

圖2 5 個不同產(chǎn)地干香菇中蛋白含量測定結果

由圖2 可知，產(chǎn)地不同，香菇蛋白質(zhì)含量不同，適量蛋白質(zhì)攝入有益健康，攝入量過高，會增加肝臟代謝的負擔，影響身體健康。5 種產(chǎn)地的干香菇蛋白質(zhì)含量都滿足人體需求，生產(chǎn)生活中可按需求選擇香菇作為人體補充蛋白質(zhì)。福建古田的干香菇蛋白質(zhì)含量最高，為30.81%。河南白云山、河北遵化和浙江慶元的干香菇蛋白質(zhì)含量相對較低，湖北隨州的干香菇蛋白質(zhì)含量最低。

2.2 不同產(chǎn)地對香菇中脂肪含量的影響

5 個不同產(chǎn)地干香菇中脂肪含量測定結果見圖3。

圖3 5 個不同產(chǎn)地干香菇中脂肪含量測定結果

由圖3 可知，福建古田的干香菇脂肪含量最高，為3.33%；其次是河北遵化的干香菇，含量相對較低的是浙江慶元和湖北隨州的干香菇；河南白云山的干香菇脂肪含量最低，為2.38%?？梢缘贸霾煌a(chǎn)地香菇脂肪的含量不同，南北方地區(qū)香菇脂肪含量差異較大。由于香菇脂肪含量受當?shù)貧夂驐l件影響，南方雨水更為充沛空氣濕度大，地區(qū)土壤含合成脂肪的微量元素更為充足。

2.3 不同產(chǎn)地對香菇中總糖含量的影響

5 個不同產(chǎn)地干香菇中多糖含量測定結果見圖4。

由圖4 可知，河南白云山的干香菇多糖含量最高，為46.53%；其次是河北遵化、湖北隨州和浙江慶元的干香菇為38.28%，30.86%和30.17%；福建古田的干香菇多糖含量最低，為20.56%。

圖4 5 個不同產(chǎn)地干香菇中多糖含量測定結果

2.4 不同產(chǎn)地對香菇中灰分含量的影響

高溫灼燒時，香菇的有機成分揮發(fā)逸散，無機成分殘留下來，這些殘留物稱為灰分。它是標示香菇中無機成分總量。

5 個不同產(chǎn)地干香菇中灰分含量測定結果見圖5。

圖5 5 個不同產(chǎn)地干香菇中灰分含量測定結果

由圖5 可知，福建古田的干香菇灰分含量最高，為6.88%；浙江慶元、河南白云山、河北遵化，灰分含量分別為6.27%，5.34%，5.56%；湖北隨州干香菇的灰分含量是最低的，為5.25%?？傻贸龈＝ü盘秕r菇所含無機成分總量最大，因為福建的氣候、土壤和種植條件更有利于鮮菇無機成分的積累。

2.5 提取工藝優(yōu)化試驗結果

2.5.1 單因素試驗結果

單因素試驗對多糖得率的影響見圖6。

圖6 單因素試驗對多糖得率的影響

由圖6 可知，經(jīng)單因素試驗確定選取料液比1∶30，超聲功率300 W，超聲時間30 min，進行提取工藝正交優(yōu)化。

2.5.2 正交試驗結果分析

正交因素與水平設計見表1，正交試驗結果見表2。精確稱取1g 樣品，按照正交因素水平表進行提 取，記錄多糖得率（%）。由正交試驗結果（表2）可知，料液比（A）、超聲時間（B）、超聲功率（C）3 個因素的極差（R） 分別為1.13，1.63，2.45，說明影響香菇多糖提取率的各因素主次順序為C＞B＞A。通過對正交試驗結果的分析可得，香菇多糖最佳提取工藝為A3B3C1，即料液比1∶35，超聲時間35 min，超聲功率340 W。在最佳工藝下多糖得率為10.32%。

表1 正交因素與水平設計

表2 正交試驗結果

2.5.3 抗氧化性結果分析

不同產(chǎn)地香菇多糖抗氧化對比見表3。

表3 不同產(chǎn)地香菇多糖抗氧化對比

由表3 可知，不同產(chǎn)地的香菇多糖的抗氧化性不同，中原地區(qū)的香菇多糖的抗氧化性較好。

2.5.4 不同質(zhì)量濃度的香菇多糖的抗氧性能分析（1） DPPH 自由基清除率結果分析。

不同質(zhì)量濃度的香菇多糖對DPPH 自由基的清除率的影響見圖7。

圖7 不同質(zhì)量濃度的香菇多糖對DPPH 自由基清除率的影響

由圖7 可知，隨著香菇多糖質(zhì)量濃度的增大，DPPH 自由基的清除率也不斷增大，但增長幅度減小，說明香菇多糖的質(zhì)量濃度增大到一定程度時，其自身的抗氧化性能逐漸趨于飽和。

（2） 超氧陰離子自由基清除率結果分析。

不同質(zhì)量濃度的香菇多糖對超氧陰離子自由基清除率的影響見圖8。

圖8 不同質(zhì)量濃度的香菇多糖對超氧陰離子自由基清除率的影響

由圖8 可知，多糖質(zhì)量濃度不斷增大時，超氧陰離子的清除率也不斷上升，說明香菇多糖質(zhì)量濃度越大，抗氧化性能越好。

3 結論

研究表明，香菇的蛋白質(zhì)含量、脂肪含量、灰分含量的高低或決定著其多糖含量，高蛋白含量的香菇其脂肪含量也高，但其多糖含量確相對低。研究為后續(xù)挑選含香菇多糖更為豐富的香菇提供了理論依據(jù)，只用檢驗其蛋白質(zhì)含量或脂肪含量就能確定出良好的香菇多糖原材料。同時，研究可指導在生活生產(chǎn)中選擇何種香菇作為原材料，若需補充蛋白質(zhì)產(chǎn)品，可選擇福建古田的香菇。制作食用低糖和無糖食品，可選擇福建古田香菇。制作低脂肪類產(chǎn)品可選擇河南白云山的香菇。香菇多糖具有較好的抗氧化性能，香菇多糖質(zhì)量濃度越大，抗氧化性能越好，河南白云山的香菇多糖含量及其他營養(yǎng)成分均較好，可作為保健產(chǎn)品原料。研究確定良好的香菇多糖原材料，優(yōu)化提取工藝并分析其抗氧化活性，針對保健品和食品領域，開發(fā)香菇多糖類產(chǎn)品，將有助于香菇的進一步利用，為進一步開發(fā)香菇多糖保健品應用奠定基礎。