周佳佳,趙樹龍,宋爽,康海全1,

(1.徐州醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院,江蘇徐州221000;2.淮安市婦幼保健院醫(yī)學(xué)檢驗科,江蘇淮安 223002;3.徐州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院檢驗科,江蘇徐州221000)

肺炎克雷伯菌(Klebsiellapneumoniae,KP)是一種臨床常見的條件致病菌,可以引起肺部、肝臟、尿道、血液、大腦等全身多部位感染[1-2],特別是抵抗力低下和有基礎(chǔ)疾病患者。曾經(jīng)碳青霉烯類藥物被視為阻擊革蘭陰性桿菌的最后一道防線,但是目前碳青霉烯耐藥肺炎克雷伯菌(carbapenemase-resistantKlebsiellapneumoniae,CRKP)檢出率越來越高。中國細(xì)菌耐藥監(jiān)測報告顯示,KP對主要碳青霉烯類藥物(亞胺培南和美羅培南)耐藥率從2007年2.4%和2.9%分別增長至2021年23.1%和24.4%,上升幅度高達(dá)10倍[3-4]。一項多中心隊列研究中揭示了全球不同地區(qū)的CRKP高死亡率[5]。因此,CRKP的防控已成為全球關(guān)注的公共衛(wèi)生問題。

CRKP的主要耐藥機制是產(chǎn)碳青霉烯酶。我國CRKP主要產(chǎn)肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶(KPC)[6],NDM、OXA-48次之。隨著碳青霉烯酶抑制劑的廣泛使用,B類金屬酶的檢出率逐年增加,目前國內(nèi)外已相繼報道同時產(chǎn)A類和B類碳青霉烯酶的CRKP[7-8],這給臨床的抗感染治療提出了新的挑戰(zhàn)。但是對于聯(lián)產(chǎn)碳青霉烯酶菌株的流行病學(xué)信息尚不完善,因此本研究將對KPC-2和NDM-1聯(lián)產(chǎn)的CRKP菌株從流行病學(xué)、分子分型、耐藥機制和同源性進(jìn)行分析,為臨床合理用藥和醫(yī)院感染監(jiān)測提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1菌株來源 篩選徐州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院2021年6月至12月臨床首次分離的CRKP菌株。本研究已通過徐州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)(批文號:XYFY2021-KL101-01)。

1.2試劑與儀器 微生物標(biāo)本自動接種培養(yǎng)儀(武漢DIASE公司),MALDI-TOF MS質(zhì)譜儀(BD公司),Vitek 2 Compact全自動微生物鑒定分析儀及GN鑒定卡(法國生物梅里埃公司),PCR儀、脈沖場電泳儀、凝膠成像系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司);頭孢他啶/阿維巴坦藥敏紙片(意大利Liofilchem公司),替加環(huán)素藥敏試劑(溫州康泰生物公司),Taq DNA聚合酶、PCR相關(guān)試劑、脈沖場凝膠電泳(pulsed field gel electrophoresis, PFGE)使用相關(guān)試劑、DNA marker和XbaⅠ內(nèi)切酶(大連寶生物公司),瓊脂糖及溴化乙錠(美國Promega公司)。PCR擴增引物由上海生工生物公司合成。

1.3方法

1.3.1菌株鑒定與藥物敏感性試驗 所有菌株均使用MALDI-TOF MS鑒定,用Vitek 2 Compact全自動微生物鑒定分析儀進(jìn)行菌株確認(rèn)及藥敏檢測,藥敏結(jié)果判讀參照2021年美國臨床和實驗室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(Clinical and Laboratory Standards Institute, CLSI)標(biāo)準(zhǔn)。亞胺培南或者美羅培南任一藥物耐藥均認(rèn)定為CRKP菌株。頭孢他啶/阿維巴坦使用K-B法,取濁度為0.5～0.63麥?zhǔn)蠞岫葐挝坏拇郎y菌液,均勻涂布于M-H瓊脂平板,37 ℃培養(yǎng)18～20 h后量取最小抑菌圈大小,≥21 mm為敏感,≤20 mm為耐藥。質(zhì)控菌株:肺炎克雷伯菌ATCC 700603。

1.3.2耐藥基因檢測 使用煮沸法提取DNA,用PCR法擴增碳青霉烯酶基因(blaKPC、blaNDM、blaVIM、blaIMP、blaOXA-48)、超廣譜β-內(nèi)酰胺酶基因(blaCTX-M、blaSHV、blaTEM)。引物序列和條件參照相關(guān)文獻(xiàn)[9]。引物及退火溫度見表1。擴增產(chǎn)物行15 g/L瓊脂糖凝膠電泳分析,陽性擴增產(chǎn)物委托上海生工生物公司進(jìn)行Sanger測序,測序儀器為美國ABI公司3730XL測序分析儀。

表1 耐藥基因引物及退火溫度

1.3.3多位點序列分型(multilocus sequence typing, MLST) 參照網(wǎng)站(https://bigsdb.pasteur.fr/klebsiella/primers-used/)合成肺炎克雷伯菌7個管家基因(rpoB、pgi、tonB、mdh、phoE、gapA、infB)引物,進(jìn)行 PCR 擴增。PCR反應(yīng)體系共25 μL,包括上、下游引物(10 μmol/L)各1 μL,PCR混合液12.5 μL,ddH2O 8.5 μL,DNA模板2 μL。PCR反應(yīng)參數(shù):94 ℃預(yù)變性2 min;94 ℃變性30 s,50 ℃退火1 min,72 ℃延伸30 s,35個循環(huán);72 ℃延伸5 min。擴增產(chǎn)物電泳及序列分析方法同1.3.2。

1.3.4PFGE同源性分析 包埋細(xì)菌:取培養(yǎng)18 h的肺炎克雷伯菌與沙門菌H9812標(biāo)準(zhǔn)菌株2～3個菌落,分別加入2 μL細(xì)胞懸浮液中研磨均勻。將菌液與1%低熔點膠1∶1混勻加入模具中,待其凝固。細(xì)菌裂解:將包埋細(xì)菌的小膠塊加入5 mL濃度為0.1 mg/mL蛋白酶K的細(xì)胞裂解液中震蕩2 h。清洗膠塊:將裂解好的小膠塊以超純水沖洗2遍,TE緩沖液沖洗3遍。然后用XbaⅠ酶切2 h,再灌制凝膠后跑膠18 h(電壓:6 V/cm;初始時間:6 s;最終時間:36 s;電場夾角:120°;初始電流:120～140 mA),溴化乙錠染色30 min,最后放在凝膠成像儀中成像。PFGE圖譜相似度超過85%判定為同一克隆型[10]。

2 結(jié)果

2.1耐藥基因及MLST分型 2021年6月至12月共分離出239例CRKP,經(jīng)耐藥基因分析,其中檢測出3株KPC-2和NDM-1聯(lián)產(chǎn)CRKP,并均檢出β-內(nèi)酰胺酶基因,MLST結(jié)果顯示均為ST11型。見圖1、圖2、表2。

注:M,DNA marker;1、2,blaNDM基因陰性菌株;3、4、5,blaNDM基因陽性菌株。

注:M,DNA marker;1、5,blaKPC基因陰性菌株;2、3、4,blaKPC基因陽性菌株。

表2 3株KPC-2和NDM-1聯(lián)產(chǎn)CRKP耐藥基因分析結(jié)果

2.2藥物敏感性試驗結(jié)果 藥敏結(jié)果顯示,3株KPC-2和NDM-1聯(lián)產(chǎn)CRKP菌株對青霉素類、頭孢菌素類、喹諾酮類、氨基糖苷類和碳青霉烯類100%耐藥,且均呈高水平耐藥,3株聯(lián)產(chǎn)CRKP對新藥頭孢他啶/阿維巴坦(Ceftazidime/avibactam,CZA)均顯示耐藥,其中K2菌株替加環(huán)素中介,無多黏菌素耐藥株。見表3。

2.3PFGE同源性分析 結(jié)果顯示,本次檢出的3株聯(lián)產(chǎn)CRKP中有2株圖譜高度相似,同源性>90%。見圖3。

圖3 3 株KPC-2和NDM-1聯(lián)產(chǎn)肺炎克雷伯菌PFGE圖譜分析

3 討論

本研究檢出的3株KPC-2和NDM-1聯(lián)產(chǎn)CRKP均屬于ST11,且有2株P(guān)FGE同源性>90%,說明局部存在KPC-2和NDM-1聯(lián)產(chǎn)CRKP的流行傳播。ST11型是我國主要流行分子型,其次是ST15[11]。除了中國,ST11在日本、泰國、德國、希臘、意大利、波蘭、巴西、奧地利、印度、以色列、美國等多個國家被廣泛檢測出。因此,ST11型CRKP作為國際高?？寺?應(yīng)當(dāng)引起更多的關(guān)注和重視。

馬筱玲教授團(tuán)隊回顧分析了2 462例感染CRKP患者,發(fā)現(xiàn)CRKP感染的死亡率(42.14%)高于碳青霉烯酶敏感的肺炎克雷伯菌(CSKP)的死亡率(21.16%),并且血流感染、入住ICU、器官移植感染CRKP死亡率排前三,分別是54.30%、48.90%、43.13%[12]。本院3例聯(lián)產(chǎn)CRKP患者均來自ICU,死亡率高達(dá)100%,高于馬教授等的研究,這可能是因為聯(lián)產(chǎn)CRKP增加了臨床抗感染治療的難度。但是由于國內(nèi)外報道的聯(lián)產(chǎn)例數(shù)還較少,危險因素與轉(zhuǎn)歸情況還有待進(jìn)一步研究。

本研究中,3例KPC-2和NDM-1聯(lián)產(chǎn)CRKP菌株均屬于多藥耐藥菌,且均呈現(xiàn)高水平耐藥,這可能由于體內(nèi)存在2種碳青霉烯酶基因共同拮抗的效果。這2種碳青霉烯酶中,KPC酶屬于A類絲氨酸β-內(nèi)酰胺酶,NDM酶屬于B類金屬酶,都能夠水解β-內(nèi)酰胺類藥物,包括青霉素類、頭孢菌素類和碳青霉烯類[13]。不同的是KPC酶可以水解單環(huán)內(nèi)酰胺類藥物,但會被許多抑制劑抑制,NDM酶不能水解單環(huán)內(nèi)酰胺類藥物,但對阿維巴坦有抑制作用[14]。因此,blaKPC和blaNDM同時攜帶將會被獲得更高的耐藥性,這對臨床治療提出更大的挑戰(zhàn)。本研究中,3株KPC-2和NDM-1聯(lián)產(chǎn)CRKP均對CZA耐藥,而NDM酶對CZA有抑制作用[15],所以表現(xiàn)出了更高的耐藥性。另外有研究報道,用替加環(huán)素治療CRKP可能會導(dǎo)致替加環(huán)素耐藥性的發(fā)展[16],本研究中有1例K2藥敏結(jié)果顯示對替加環(huán)素中介,根據(jù)抗菌藥物使用史阿米卡星+替加環(huán)素+氟康唑+卡泊芬凈,推測K2菌株患者替加環(huán)素的使用誘導(dǎo)了該菌的抗藥性,替加環(huán)素的耐藥加劇了抗感染的困難。

目前,聯(lián)產(chǎn)碳青霉烯酶CRKP不斷被報道,除了KPC-2和NDM-1組合,還有一些新的組合[17],如KPC-OXA、VIM-OXA甚至有KPC-NDM-VIM三聯(lián)產(chǎn)組合。但是這種碳青霉烯酶聯(lián)產(chǎn)菌株的進(jìn)化機制和傳播機制尚不完全明確。國內(nèi)對聯(lián)產(chǎn)碳青霉烯酶CRKP的少量研究[18]發(fā)現(xiàn),blaKPC-2基因優(yōu)先發(fā)現(xiàn)于IncFⅡ質(zhì)粒,而blaNDM-1基因位于不同的背景,如IncN、IncX和IncHI1B質(zhì)粒,其進(jìn)化途徑可能是KPC-2-CRKP獲得了高度可轉(zhuǎn)移的NDM-1質(zhì)粒,同時該研究還發(fā)現(xiàn)這種聯(lián)產(chǎn)的CRKP可以穩(wěn)定遺傳。綜上所述,聯(lián)產(chǎn)CRKP的微生物學(xué)特性表明,KPC-2和NDM-1聯(lián)產(chǎn)CRKP可以同時攜帶blaKPC-2和blaNDM-1并穩(wěn)定遺傳,同時也可引起廣泛的流行傳播。