賈佳,紀(jì)玥玥,高碩,張燕,周萬青,沈瀚

(南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院檢驗(yàn)科,南京210000)

金黃色葡萄球菌是一種定植于人類上呼吸道的機(jī)會(huì)致病菌,可引起膿毒血癥、心內(nèi)膜炎等[1]。耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(methicillin-resistantStaphylococcusaureus,MRSA)定植或攜帶會(huì)增加感染的風(fēng)險(xiǎn),是人群間傳播的一個(gè)重要來源,并可造成院內(nèi)流行性傳播[2]。金黃色葡萄球菌血流感染的致病性與其可產(chǎn)生多種毒力因子、受到輔助基因調(diào)控因子(accessory gene regulator,agr)系統(tǒng)的調(diào)節(jié)等密切相關(guān)[3]。金黃色葡萄球菌的毒力基因包括表面相關(guān)因子、溶血素、酶、超抗原毒素等[4]。各毒力因子具有不同的致病機(jī)制,不同的毒力因素組合可形成菌株不同的流行病學(xué)特征[1]。agr系統(tǒng)是最常見且研究最多的毒力調(diào)節(jié)系統(tǒng),基于agr基因可變區(qū)的多態(tài)性可分為4個(gè)組別(agrⅠ～Ⅳ),不同agr型別對金黃色葡萄球菌毒力因子表達(dá)及感染嚴(yán)重程度具有一定的影響[1,5]。此外,金黃色葡萄球菌可以在各種醫(yī)療設(shè)備、組織表面形成生物膜,導(dǎo)致細(xì)菌抵抗吞噬細(xì)胞的殺傷和抗菌藥物滲透,從而造成疾病的持久性和難治性[6]。本研究旨在分析臨床血液來源金黃色葡萄球菌的耐藥性、毒力基因譜、agr分布、生物膜形成能力特征,并比較MRSA菌株與上述因素的關(guān)系,從而為臨床治療和醫(yī)院感染防控提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1菌株來源 收集2019年1月—2020年12月南京鼓樓醫(yī)院臨床患者血液培養(yǎng)連續(xù)分離的非重復(fù)金黃色葡萄球菌102株。所有菌株采用Vitek MS質(zhì)譜鑒定系統(tǒng)進(jìn)行菌種鑒定,采用Vitek 2 Compact及配套GP67卡進(jìn)行藥物敏感性檢測。金黃色葡萄球菌ATCC 29213、糞腸球菌ATCC 29212為藥敏試驗(yàn)質(zhì)控菌株;表皮葡萄球菌ATCC 35984和ATCC 12228分別為生物膜形成陽性和陰性對照菌株,上述菌株均為本實(shí)驗(yàn)室保存菌株。

1.2主要試劑和儀器 胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基(TSA)、胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基(TSB)(青島海博生物公司);2×Taq Master Mix(近岸蛋白質(zhì)科技有限公司);瓊脂粉AGAROSE G-10(西班牙BIOWEST公司);GoldView DNA(北京索萊寶科技公司);引物由上海生工生物公司合成。Vitek 2 Compact全自動(dòng)細(xì)菌鑒定儀、Vitek MS(法國生物梅里埃公司);T00型PCR擴(kuò)增儀、凝膠電泳儀(美國Bio-Rad公司);2500型凝膠成像系統(tǒng)(上海Tanon公司);MB-580酶標(biāo)儀(深圳市匯松科技公司)。

1.3菌株復(fù)蘇及核酸提取 常規(guī)復(fù)蘇菌株接種于血平板,置35 ℃、5% CO2培養(yǎng)24 h。挑單克隆菌落于200 μL無菌生理鹽水中,100 ℃加熱10 min,冰上靜置5 min,3個(gè)循環(huán)后,12 000 r/min離心5 min,取上清液作為DNA模板,-20 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.4生物膜表型分析 參照O′Toole[7]報(bào)道進(jìn)行生物膜形成試驗(yàn)。挑取菌落轉(zhuǎn)種于TSA培養(yǎng)基,35 ℃、5% CO2培養(yǎng)24 h。挑取菌落至1 mL生理鹽水并調(diào)節(jié)菌液濁度為3麥?zhǔn)蠞岫葐挝?吸取10 μL上述菌液至1 mL TSB培養(yǎng)基中,混勻后,每孔200 μL加入96孔板中。每個(gè)菌株設(shè)3個(gè)重復(fù)孔。96孔板置35 ℃培養(yǎng)24 h,棄上清液,PBS洗3遍后,每孔加入200 μL 5 g/L結(jié)晶紫水溶液并靜置15 min。PBS洗3遍,拍干。每孔加入200 μL無水乙醇,室溫20 min,使用酶標(biāo)儀在570 nm處測量每孔吸光度(A)值。表皮葡萄球菌ATCC 35984和ATCC 12228分別作為生物膜形成陽性和陰性對照,TSB為空白對照。判斷標(biāo)準(zhǔn):以陰性對照平均A值的3個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差為cut-off值(Ac)。根據(jù)Ac和待測菌株平均A值分為4類:強(qiáng)生物膜(A>4Ac);中等生物膜(A>2Ac,A≤4Ac);弱生物膜(A>Ac,A≤2Ac);無生物膜(A≤Ac)。

1.5agr基因多態(tài)性分析 參照文獻(xiàn)[8],采用多重PCR檢測agr基因多態(tài)性。agr基因分型擴(kuò)增引物見表1。多重PCR反應(yīng)體系為20 μL,包括10 μmol/L上、下游引物各1 μL,2×Taq Master Mix 10 μL,DNA模板1 μL,DEPC水4 μL。多重PCR反應(yīng)條件:95 ℃ 5 min;94 ℃ 1 min,45 ℃ 1 min,72 ℃ 1 min,5個(gè)循環(huán);94 ℃ 1 min,55 ℃ 1 min,72 ℃ 1 min,30個(gè)循環(huán);72 ℃ 5 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)15 g/L瓊脂糖凝膠電泳,用GoldView DNA染色后觀察。

1.6毒力基因檢測 參考文獻(xiàn)[9],采用PCR檢測金黃色葡萄球菌葡萄黃質(zhì)蛋白基因(crtN)、溶血素基因(hla、hlb和hld)、CP8合成酶基因(cap8H)、中毒性休克綜合征毒素-1基因(tst),引物信息見表2。PCR反應(yīng)體系為20 μL,包括10 μmol/L上、下游引物各1 μL,2×Taq Master Mix 10 μL,DNA 1 μL,DEPC水7 μL。PCR反應(yīng)條件:94 ℃ 5 min;94 ℃ 1 min,在不同溫度下退火1 min,72 ℃ 1 min,35個(gè)循環(huán);72 ℃ 5 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)15 g/L瓊脂糖凝膠電泳,用GoldView DNA染色觀察。

表1 agr分型多重PCR反應(yīng)引物和產(chǎn)物長度

表2 毒力基因引物序列、退火溫度和擴(kuò)增產(chǎn)物長度

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 使用GraphPad 8.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì),計(jì)數(shù)資料以百分率表示,組間比較采用卡方檢驗(yàn)或Fisher精確概率法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。分離菌株藥敏數(shù)據(jù)采用Whonet 5.6軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

2 結(jié)果

2.1藥敏結(jié)果 102株金黃色葡萄球菌中苯唑西林耐藥43株(占42.2%),敏感59株(占57.8%)。所有菌株對萬古霉素、利奈唑胺和替加環(huán)素均敏感;對利福平、甲氧芐氨嘧啶-磺胺甲噁唑和慶大霉素耐藥率低,分別為1.0%、2.0%和4.9%;對克林霉素、環(huán)丙沙星、四環(huán)素、莫西沙星和左氧氟沙星耐藥率中等,分別為19.6%、28.4%、28.6%、30.4%和33.3%;大部分菌株對青霉素和紅霉素耐藥,分別為96.1%和53.9%。

2.2毒力基因表達(dá)情況 102株菌株中101株(占99.0%)至少攜帶6個(gè)毒力基因中的1種。各基因檢出率如下:crtN為99.0%,溶血素基因hla、hlb和hld分別為97.1%、98.0%和96.1%,表面因子基因cap8H為34.3%,tst為21.6%。其中,以同時(shí)攜帶crtN、hla、hlb、hld4種毒力基因的組合最多。見表3。

表3 102株金黃色葡萄球菌毒力基因攜帶情況

2.3agr基因多態(tài)性及不同agr分型菌株耐藥性和毒力基因攜帶情況 102株分離株中99株(占97.1%)agr位點(diǎn)陽性,其中58株檢測為agrⅠ型(占56.9%),37株檢測為agrⅡ型(占36.3%),5株檢測為agrⅢ型(占4.9%),未檢測到agrⅣ型,另有3株未獲分型。

比較不同agr分型菌株間抗菌藥物耐藥性和毒力基因攜帶情況發(fā)現(xiàn),agrⅡ型分離株對紅霉素、四環(huán)素、左氧氟沙星、苯唑西林、環(huán)丙沙星、莫西沙星的耐藥性較agrⅠ型強(qiáng),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。agrⅡ型分離株tst基因攜帶率顯著高于agrⅠ型分離株,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(8.8% vs 40.5%,χ2=13.519,P<0.001)。agrⅡ型分離株cap8H基因攜帶率低于agrⅠ型分離株,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(38.6% vs 21.6%,χ2=2.975,P=0.085)。crtN和溶血素基因在兩組之間普遍分布。見表4。

表4 agr不同分型菌株毒力基因和抗菌藥物耐藥性分布

2.4生物膜形成能力 102株分離株中28株生物膜形成陽性,其中12株為強(qiáng)生物膜,16株為非強(qiáng)生物膜(11株為弱生物膜,5株為中等生物膜)。強(qiáng)生物膜形成株攜帶毒力基因的數(shù)量更多,其中cap8H基因攜帶率高于非強(qiáng)生物膜株(66.7% vs 25.0%),但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=4.861,P=0.053)。強(qiáng)生物膜形成株和非強(qiáng)生物膜形成株均主要分布在agrⅠ型,分別為10株(占83.33%)和11株(占68.75%)。

2.5MRSA與MSSA菌株耐藥性、毒力基因、agr分布及生物膜形成能力比較分析 MRSA菌株對多種藥物耐藥率高于MSSA,分別為慶大霉素、環(huán)丙沙星、左氧氟沙星、莫西沙星、紅霉素、克林霉素、四環(huán)素,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表5。

43株MRSA菌株中crtN、hla、hlb、hld基因檢出率均為100%;59株MSSA菌株中crtN、hla、hlb、hld基因檢出分別為58株(98.31%)、56株(94.92%)、57株(96.61%)和55株(93.22%),兩組之間各基因檢出率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。MRSA菌株cap8H基因攜帶率較MSSA菌株低(20.9% vs 40.7%,χ2=4.432,P=0.035),tst基因攜帶率較MSSA菌株高(34.88% vs 11.86%,χ2=7.791,P=0.005),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表5。

43株MRSA菌株中agrⅠ、agrⅡ、agrⅢ型檢出率分別為46.51%(20株)、48.84%(21株)和4.65%(2株);59株MSSA菌株中agrⅠ、agrⅡ、agrⅢ型菌株檢出率分別為62.71%(37株)、27.12%(16株)和5.08%(3株)。agrⅡ分型中MRSA菌株占比高于MSSA菌株(48.84% vs 27.12%,χ2=5.075,P=0.024),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表5。

43株MRSA菌株中強(qiáng)生物膜4株(9.30%),非強(qiáng)生物膜10株(23.26%);59株MSSA菌株中強(qiáng)生物膜7株(11.86%),非強(qiáng)生物膜6株(10.17%)。MRSA和MSSA菌株在生物膜形成能力上差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表5。

3 討論

結(jié)果顯示,我院血液分離金黃色葡萄球菌對多種抗菌藥物的敏感性較高,但MRSA檢出率達(dá)42.2%,高于國內(nèi)部分同級別醫(yī)院[10-11],與江蘇省2020年度平均水平相似[12],且MRSA菌株對環(huán)丙沙星、四環(huán)素、紅霉素、克林霉素、左氧氟沙星、莫西沙星耐藥率均高于MSSA。

本研究發(fā)現(xiàn),血流感染來源金黃色葡萄球菌普遍攜帶crtN、hla、hlb、hld基因,且以同時(shí)攜帶crtN/hla/hlb/hld4種毒力基因的組合最多,提示葡萄黃質(zhì)和溶血素可能在金黃色葡萄球菌血流感染中起關(guān)鍵作用。葡萄黃質(zhì)crtN是金黃色葡萄球菌重要毒力因子,既具有抗氧化性,增加金黃色葡萄球菌的毒力和抵抗中性粒細(xì)胞殺傷作用,又具有增加細(xì)胞膜的韌性來增強(qiáng)抵抗陽離子抗菌肽介導(dǎo)的非氧化型宿主的防御,從而抵抗宿主先天免疫防御[13]。本研究發(fā)現(xiàn)crtN檢出率達(dá)99.0%,與Derakhshan等[9]報(bào)道不同來源金黃色葡萄球菌89.4%的crtN攜帶率相似,由此可見,crtN基因與金黃色葡萄球菌致病密切相關(guān)。溶血素是金黃色葡萄球菌另一重要細(xì)胞毒性分子,主要作用于紅細(xì)胞、吞噬細(xì)胞,hla、hlb和hld基因分別編碼α溶血素、β溶血素和δ溶血素[4]。本研究中hla、hlb和hld基因攜帶率分別為97.1%、98.0%和96.1%,且在MRSA和MSSA菌株中無差異。此結(jié)果與Wang等[14]報(bào)道山東地區(qū)血流感染金黃色葡萄球菌結(jié)果不同,是否存在地區(qū)差異尚待進(jìn)一步研究。同時(shí),本結(jié)果高于Derakhshan等[9]對不同來源金黃色葡萄球菌溶血素基因攜帶率的調(diào)查結(jié)果(hla39%,hlb67.5%,hld75.6%),說明在造成血流感染的金黃色葡萄球菌中溶血素基因可能在致病性中發(fā)揮重要作用。莢膜是細(xì)菌最重要的表面因子,對黏附和感染的初始階段至關(guān)重要,并可與各種非生物表面結(jié)合[15]。本研究中有65.7%的菌株不攜帶cap8H基因,與Wang等[14]研究結(jié)果一致,CP8表達(dá)的缺失可能會(huì)增強(qiáng)金黃色葡萄球菌在感染宿主中的持久性。本研究還發(fā)現(xiàn),與MSSA相比,MRSA菌株cap8H基因攜帶率更低,由此推測,cap8H缺失可能是MRSA菌株在體內(nèi)持續(xù)感染的一個(gè)重要因素。超抗原中毒性休克綜合征毒素-1(TSST-1)可以引起食物中毒和中毒性休克,激活T淋巴細(xì)胞,并產(chǎn)生大量的細(xì)胞因子和趨化因子[16]。本研究中tst基因攜帶率為21.6%,較Wang等[14]報(bào)道的tst基因攜帶率(5%)高。與MSSA相比,MRSA菌株tst基因攜帶率更高。由此可見,血液分離MRSA菌株較MSSA菌株在表面因子和超抗原攜帶上的差異性可能是導(dǎo)致MRSA更具持久性和致病性的原因。

Agr群體感應(yīng)系統(tǒng)是最早被發(fā)現(xiàn)參與金黃色葡萄球菌血流感染過程中毒力表達(dá)的重要調(diào)控系統(tǒng)并參與致病性[1]。本研究中agr檢出率達(dá)92.7%,其中agrⅠ型占56.9%,agrⅡ型占36.3%,agrⅢ型占4.9%,未檢測出agrⅣ型。這與文獻(xiàn)[9]報(bào)道不同來源金黃色葡萄球菌agr陰性株占35%,未檢出agrⅡ型和agrⅣ型的結(jié)果不同。Painter等[5]報(bào)道金黃色葡萄球菌菌血癥患者大多由agr缺陷分離株引起,與本研究結(jié)果不同,可能與菌株分離的地區(qū)性差異有關(guān)。對agrⅠ和agrⅡ組間耐藥性和毒力基因的相關(guān)性比較發(fā)現(xiàn),agrⅡ型菌株對抗菌藥物的耐藥性更高,更易表現(xiàn)為cap8H基因缺失和高tst基因攜帶。與國內(nèi)多家醫(yī)院菌血癥患者分離金黃色葡萄球菌結(jié)果一致[17]。此外,本研究中MRSA菌株中agrⅠ型和agrⅡ型占比相當(dāng),且與MSSA菌株相比,agrⅡ型占比更高。

本研究中,102株菌株中28株具有生物膜成膜能力,其中12株強(qiáng)生物膜形成株,16株非強(qiáng)生物膜形成株。血液分離金黃色葡萄球菌生物膜形成能力明顯低于不同來源金黃色葡萄球菌生物膜形成能力[9]。MRSA菌株中強(qiáng)生物膜5株(占11.6%)、非強(qiáng)生物膜9株(占20.9%);MSSA菌株中強(qiáng)生物膜7株(占11.9%)、非強(qiáng)生物膜7株(占11.9%)。雖然上述菌株間生物膜形成能力差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,但MRSA菌株更傾向于形成非強(qiáng)生物膜。另外,還發(fā)現(xiàn)強(qiáng)生物膜菌株攜帶毒力基因數(shù)高于非強(qiáng)生物膜菌株,且cap8H基因攜帶率高于非強(qiáng)生物膜株,但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,考慮到本研究中樣本量較少,cap8H基因在金黃色葡萄球菌生物膜形成中的作用仍需進(jìn)一步研究。