楊瑋,張思琴,陳福紅,李素娟

(杭州市中醫(yī)院檢驗(yàn)科,杭州 310007)

鮑曼不動(dòng)桿菌是院內(nèi)感染重要的病原菌之一且其耐藥率近年來居高不下,尤其是耐碳青霉烯藥物的鮑曼不動(dòng)桿菌(carbapenem-resistantAcinetobacterbaumannii, CRAB)成為臨床處理感染的棘手問題。2021年中國CHINET監(jiān)測(cè)網(wǎng)(http://www.chinets.com/)統(tǒng)計(jì)顯示CRAB占比高達(dá)66.5%,然而15 166株全國CRAB對(duì)多黏菌素B的耐藥率僅為0.5%。因此,目前在臨床抗感染聯(lián)合治療中,多黏菌素B常作為抗CRAB的最后防線。然而,多黏菌素單獨(dú)使用會(huì)導(dǎo)致異質(zhì)性耐藥的問題,臨床多主張聯(lián)合用藥。實(shí)際上鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)多黏菌素異質(zhì)性耐藥率遠(yuǎn)高于其檢出耐藥率[1]。本研究利用自一名腦出血術(shù)后并發(fā)腦膿腫患者分離到的1株國內(nèi)較為少見的多黏菌素B高水平耐藥的鮑曼不動(dòng)桿菌(polymyxin resistantAcinetobacterbaumannii, PmRAB),進(jìn)行深入的基因?qū)W研究,以便為今后的耐藥機(jī)理及流行病學(xué)的研究積累一定實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1研究對(duì)象 目標(biāo)菌株來自杭州市中醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科腦出血術(shù)后并發(fā)腦膿腫的患者,該患者腦脊液多次同時(shí)分離出菌落大小不一異質(zhì)性耐藥的CRAB。在分離前臨床曾有多黏菌素B 5萬單位QD鞘內(nèi)注射抗感染治療史。住院期間先后使用美羅培南、多黏菌素B、頭孢哌酮/舒巴坦、替加環(huán)素多種抗菌藥物治療,但后因腦部感染持續(xù)加重,放棄治療出院。本研究挑選多黏菌素B高水平耐藥小菌落突變株作為研究對(duì)象。

1.2主要儀器和試劑 Vitek質(zhì)譜儀、Vitek 2 Compact全自動(dòng)微生物儀(法國生物梅里埃公司)、PCR擴(kuò)增儀(Bio-Rad公司)、全自動(dòng)毛細(xì)管電泳儀(美國AATI公司)、超聲波破碎儀(美國Covaris公司)、Nanopore PromethION測(cè)序儀(英國Oxford Nanopore公司)、NovaSeq PE150測(cè)序儀(美國Illumina公司);血瓊脂平板、M-H平板(鄭州貝瑞特公司),細(xì)菌全基因組提取試劑盒(廣州Magen公司),多黏菌素B、美羅培南、替加環(huán)素微量肉湯稀釋法藥敏條、頭孢哌酮/舒巴坦藥敏紙片(溫州康泰公司)。

1.3細(xì)菌鑒定及藥敏試驗(yàn) 采用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行質(zhì)譜方法在Vitek質(zhì)譜儀進(jìn)行菌種鑒定。采用Vitek 2 Compact全自動(dòng)儀AST-GN16卡型進(jìn)行藥敏試驗(yàn),多黏菌素B、美羅培南、替加環(huán)素藥敏試驗(yàn)采用微量肉湯稀釋法,頭孢哌酮/舒巴坦藥敏采用K-B紙片擴(kuò)散法,質(zhì)控菌株以大腸埃希菌ATCC 25922為質(zhì)控菌株。結(jié)果判讀參照據(jù)美國臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)(Clinical and Laboratory Standards Institute, CLSI)M100標(biāo)準(zhǔn),頭 孢 哌 酮/舒 巴 坦 敏 感 性 判 讀 參 照CLSI M100中頭孢哌酮方案進(jìn)行。

1.4全基因組測(cè)序及分析 采用SDS或STE的方法,對(duì)Z198菌株的基因組DNA進(jìn)行提取,再利用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA的純度和完整性,測(cè)定合格后樣品送杭州廣科安德生物科技有限公司進(jìn)行高通量的測(cè)序與信息分析。經(jīng)DNA片段化、末端補(bǔ)平、3′端加A、連接測(cè)序接頭、PCR擴(kuò)增與純化等完成文庫制備,然后采用Nanopore PromethION和Illumina NovaSeq PE150測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序。組裝使用Unicycler軟件采用二代+三代數(shù)據(jù)進(jìn)行基因組組裝,篩分染色體與質(zhì)粒序列,并將染色體序列組裝成為一個(gè)環(huán)狀基因組。測(cè)序結(jié)果利用各種數(shù)據(jù)庫進(jìn)行基因組生物信息分析,如基因島(IslandPath-DIOMB 0.2)、編碼基因(GeneMarkS 4.17)、重復(fù)序列(RepeatMasker 4.0.5、TRF 4.07)、非編碼RNA(RNAscan-SE 1.3.1)、前噬菌體基因(phiSpy 2.3)分別進(jìn)行比對(duì)分析。此外,重點(diǎn)分析比對(duì)多位點(diǎn)序列分型(multilocus sequence typing, MLST)信息、耐藥基因(ARDB及CARD數(shù)據(jù)庫)和毒力基因(PHI及VFDB數(shù)據(jù)庫),最后,通過Circos軟件進(jìn)行全基因組組裝和注釋結(jié)果可視化分析。

2 結(jié)果

2.1藥敏試驗(yàn)結(jié)果 僅頭孢哌酮/舒巴坦藥敏采用K-B紙片擴(kuò)散法,藥敏試驗(yàn)抑菌圈為21 mm,參照CLSI-M100中頭孢哌酮標(biāo)準(zhǔn)判斷為敏感。其余藥物的藥敏檢測(cè)采用E-test條法測(cè)定最低抑菌濃度(minimal inhibitory concentration, MIC),結(jié)果顯示,除了替加環(huán)素藥物MIC為1 μg/mL外,其他所有藥物均呈現(xiàn)顯示高度耐藥。見表1。

表1 1株多黏菌素耐藥的鮑曼不動(dòng)桿菌的抗菌藥物敏感性結(jié)果

2.2全基因組測(cè)序結(jié)果 該菌全基因組測(cè)序并組裝分析,基因組共有1個(gè)環(huán)狀染色體(4 105 371 bp,39.01%G+C)及一個(gè)環(huán)狀固有質(zhì)粒(72 256 bp,33.37%G+C),無外來質(zhì)粒。其中編碼基因(3 671 484 bp)占基因組的87.88%。在基因組中發(fā)現(xiàn)有9個(gè)基因島和4個(gè)前噬菌體。另外在基因功能分析中發(fā)現(xiàn)效應(yīng)子分泌蛋白3個(gè)T2SS,1個(gè)T4SS。測(cè)序結(jié)果上傳至https://submit.ncbi.nlm.nih.gov基因數(shù)據(jù)庫,經(jīng)認(rèn)證生成編號(hào)為:SUB12155784,SAMN31277299。

2.3MLST分型結(jié)果 經(jīng)全基因組測(cè)序?qū)?對(duì)管家基因(cpn60、fusA、gltA、pyrG、recA、rplB、rpoB)進(jìn)行序列比對(duì)分析,經(jīng) https://cge.cbs.dtu.dk/services/mlst網(wǎng)站查詢,結(jié)果為(2-2-2-2-2-2),確定為MLST分型ST2型。

2.4耐藥基因測(cè)序結(jié)果 通過對(duì)ARDB(Antibiotic Resistance Genes Database)及CARD(Comprehensive Antibiotic Research Database)數(shù)據(jù)庫均進(jìn)行比對(duì)分析,本株分離菌共攜帶有34種抗菌藥物耐藥基因,均位于染色體上。比對(duì)分析發(fā)現(xiàn),存在LpsB基因與多黏菌素耐藥機(jī)制密切相關(guān),再進(jìn)一步將Z198菌株的LpsB基因編碼氨基酸序列比對(duì)至參考基因組ATCC 19606(QFQ03949.1)的LpsB基因序列,該序列也是CARD數(shù)據(jù)庫中的LpsB基因參考序列。在Z198菌株基因組中檢測(cè)到LpsB基因有4個(gè)氨基酸突變位點(diǎn),分別是D146G、G218H、E219S、T331I。該菌同時(shí)檢測(cè)出碳青霉烯類藥物耐藥的相關(guān)基因blaOXA-23、blaOXA-66,其他頭孢菌素的耐藥基因blaADC-73以及其他類抗菌藥物的常見耐藥基因及多種藥物外排泵,見表2。

表2 1株多黏菌素B耐藥的鮑曼不動(dòng)桿菌的耐藥基因檢測(cè)結(jié)果

2.5毒力基因檢測(cè)結(jié)果 使用 Diamond 軟件,將目標(biāo)物種的氨基酸序列與VFDB(Virulence Factors of Pathogenic Bacteria)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì),把目標(biāo)物種的基因和其相對(duì)應(yīng)的毒力因子功能注釋信息結(jié)合起來,得到注釋結(jié)果。比對(duì)分析結(jié)果取ID=95%～100%值,共發(fā)現(xiàn)檢測(cè)出19種主要毒力基因,見表3。

表3 1株多黏菌素耐藥的鮑曼不動(dòng)桿菌的毒力基因檢測(cè)結(jié)果

2.6全基因測(cè)序組裝結(jié)果 針對(duì)測(cè)序樣品的組裝基因組序列,結(jié)合編碼基因的預(yù)測(cè)結(jié)果,使用Circos軟件[2]對(duì)樣品基因組進(jìn)行展示。在圖中同時(shí)也展示了非編碼RNA和基因功能注釋等信息。全基因組圖譜分別見于圖1(染色體)、圖2(質(zhì)粒)所示。

3 討論

近年來在我國及歐美等地區(qū)在腸桿菌科細(xì)菌中陸續(xù)發(fā)現(xiàn)質(zhì)粒攜帶的多黏菌素耐藥基因mcr-1、mcr-2新亞型[3-4],由于質(zhì)粒的水平傳播將為抗菌治療帶來巨大威脅,然而mcr尚未在鮑曼不動(dòng)桿菌中被公開報(bào)道。目前關(guān)于多黏菌素耐藥的機(jī)制研究除了膜孔蛋白通透性改變見于OmpW[5]外,主要集中在細(xì)胞外膜的脂質(zhì)A改變上。外膜脂質(zhì)A被修飾主要通過以下兩種機(jī)制。一是磷酸乙醇胺(pEtN)修飾脂質(zhì)A,如PmrCAB成分調(diào)節(jié)系統(tǒng)通過點(diǎn)突變或者移碼突變,二是脂質(zhì)A編碼基因突變,如lpxA、lpxC、lpxD[6-7],少見lpxB。本研究中菌株首先mcr基因通過二代測(cè)序及PCR技術(shù)測(cè)定均未檢出,其次三代測(cè)序分析跨膜蛋白(TCDB數(shù)據(jù)庫)及功能分析并未檢出OmpW改變的高表達(dá)。因此,該菌株Z198推測(cè)主要由染色體上LpsB基因發(fā)生多點(diǎn)突變導(dǎo)致多黏菌素高水平耐藥。LpsB基因編碼產(chǎn)物為糖基轉(zhuǎn)移酶,該酶參與脂多糖合成,當(dāng)LpsB基因突變會(huì)使多黏菌素藥物通透性降低,從而導(dǎo)致多黏菌素耐藥。此種耐藥機(jī)制在國內(nèi)目前尚少見報(bào)道,國外Lean等[8]曾報(bào)道LpsB基因序列中H181Y突變,而本研究菌為D146G、G218H、E219S、T331I四點(diǎn)突變,與多黏菌素B高水平耐藥關(guān)系密切。

注:最外圈是基因組序列位置坐標(biāo),由外到內(nèi),分別是編碼基因、基因功能注釋結(jié)果(根據(jù)實(shí)際項(xiàng)目情況,可能包含COG(KOG),KEGG,GO數(shù)據(jù)庫的注釋結(jié)果信息)、ncRNA、基因組GC含量:以窗口(染色體長度/1 000)bp,步長(染色體長度/1 000)bp來統(tǒng)計(jì)GC含量,向內(nèi)的紅色部分表示該區(qū)域GC含量低于全基因組平均GC含量,向外的綠色部分與之相反,且峰值越高表示與平均GC含量差值越大、基因組GC skew值:窗口(染色體長度/1 000)bp,步長(染色體長度/1 000)bp,具體算法為G-C/G+C,向內(nèi)的粉色部分表示該區(qū)域G的含量低于C的含量,向外的淺綠色部分與之相反。

注:圖片由外到內(nèi),分別是COG 功能注釋分類基因(箭頭順時(shí)針表示正鏈編碼)、基因組序列位置坐標(biāo)、基因組GC含量:以窗口500 bp,步長20 bp來統(tǒng)計(jì),向內(nèi)的紅色部分表示該區(qū)域GC含量低于全基因組平均GC含量,向外的綠色部分與之相反,且峰值越高表示與平均GC含量差值越大、基因組GC skew值:以窗口500 bp,步長20 bp來統(tǒng)計(jì),具體算法為G-C/G+C,向內(nèi)的粉色部分表示該區(qū)域G的含量低于C的含量,向外的淺綠色部分與之相反。

此外,Z198還攜帶其他耐藥基因,如同時(shí)產(chǎn)D類碳青霉烯類耐藥基因OXA-23、OXA-66,這與國內(nèi)廣州佛山報(bào)道相似[9]。越南、土耳其也曾報(bào)道多重耐藥的鮑曼不動(dòng)桿菌表達(dá)ADC-73基因[10-11]。與此同時(shí),該菌還產(chǎn)生對(duì)喹諾酮、氨基糖苷類、磺胺類、大環(huán)內(nèi)酯類、四環(huán)素類等多種抗菌藥物耐藥基因及外排泵等耐藥機(jī)制。然而,本菌株藥敏結(jié)果顯示即使多黏菌素及碳青霉烯類藥物都高水平耐藥,頭孢哌酮/舒巴坦及替加環(huán)素依然保持敏感。

利用MLST分析本Z198菌為ST2型多重耐藥的鮑曼不動(dòng)桿菌,是目前國內(nèi)外報(bào)道最為流行的ST型。據(jù)全球數(shù)據(jù)報(bào)道ST2、ST1、ST79、ST25占所有型別的71%[12]。ST2型在中國分布占絕對(duì)主導(dǎo)地位。如在浙江溫州、黑龍江等地鮑曼不動(dòng)桿菌主要型為ST2型[13-14],僅廣州報(bào)告以ST195為最多見[15]。

利用VDBP數(shù)據(jù)庫比對(duì),發(fā)現(xiàn)Z198含有多種毒力因子。其中外膜蛋白OmpA是一個(gè)關(guān)鍵因素,在細(xì)菌侵襲及導(dǎo)致細(xì)胞毒性發(fā)揮重要作用。包膜、脂多糖、菌毛蛋白、生物膜調(diào)控系統(tǒng)在細(xì)菌黏附、抗吞噬、生物膜形成、免疫調(diào)控發(fā)揮一定的生物活性。此外,Z198鑒定出11個(gè)基因島、4個(gè)噬菌體,這些基因也可能含有與增強(qiáng)細(xì)菌侵襲力及菌體與宿主的相互作用有關(guān)。病原菌通過分泌系統(tǒng)TNSS(type N secretion systems,目前Ⅰ型～Ⅶ型)將該類蛋白質(zhì)分泌至胞外或是宿主細(xì)胞中,通過控制免疫應(yīng)答反應(yīng)以及細(xì)胞衰亡引起病理反應(yīng),而其中革蘭陰性菌的T3SS通常用來從分子水平研究病原菌、感染機(jī)制、毒力作用等,是研究得比較多的分泌系統(tǒng)。本研究對(duì)于TNSS系統(tǒng),通過蛋白質(zhì)序列功能數(shù)據(jù)庫注釋結(jié)果中,提取分泌系統(tǒng)相關(guān)蛋白進(jìn)行注釋。對(duì)于革蘭陰性菌,另外采用EffectiveT3軟件[16](Version 1.0.1)預(yù)測(cè)T3SS效應(yīng)蛋白,結(jié)果并未在Z198菌種檢測(cè)到,但檢測(cè)到3個(gè)T2SS及1個(gè)T4SS,這與國外近期報(bào)道不完全一致[17]。

多黏菌素耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌株在全球出現(xiàn)陸續(xù)報(bào)道,中國目前耐藥率尚低,但仍需要臨床及實(shí)驗(yàn)室高度重視。對(duì)于多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌引起的感染,臨床必須減少單藥的給藥方案以避免出現(xiàn)誘導(dǎo)性異質(zhì)性耐藥問題。一旦發(fā)現(xiàn)耐藥菌株,尤其是外膜脂質(zhì)A改變的耐藥機(jī)制值得持續(xù)關(guān)注。