劉小宇,熊禮靜,彭 波,羅翠榮,蓬國輝,朱 璽,白旭峰,4,5

( 1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 雙水雙綠研究院,作物遺傳改良全國重點實驗室,湖北 武漢 430070; 2.華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 水產(chǎn)學(xué)院,湖北 武漢 430070; 3.華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院,湖北 武漢 430070; 4.湖北洪山實驗室,湖北 武漢 430070; 5.長江經(jīng)濟帶大宗水生生物產(chǎn)業(yè)綠色發(fā)展教育部工程研究中心,湖北 武漢 430070 )

克氏原螯蝦(Procambarusclarkii),俗稱小龍蝦,屬節(jié)肢動物門甲殼綱十足目螯蝦科原螯蝦屬[1],在我國屬于入侵物種[2-3]。該物種原產(chǎn)于美國南部和墨西哥北部[4],于20世紀30年代由日本傳入我國南京地區(qū)[5]。由于克氏原螯蝦具有較強的繁殖能力,且適應(yīng)環(huán)境能力強,其已擴張至包括整個長江流域的20多個省、市、自治區(qū)[5]。20世紀90年代,我國開始養(yǎng)殖克氏原螯蝦[6]。隨著人們消費需求的不斷增加,克氏原螯蝦的養(yǎng)殖規(guī)模逐年上升。據(jù)統(tǒng)計,2019年,我國克氏原螯蝦養(yǎng)殖總產(chǎn)量達208.96萬t,養(yǎng)殖總面積達129萬hm2,其產(chǎn)業(yè)總產(chǎn)值達4110億元[7]。

優(yōu)質(zhì)種苗是實現(xiàn)克氏原螯蝦養(yǎng)殖效益增值的關(guān)鍵,但養(yǎng)殖戶捕大留小、逆向選擇,以及自繁自育的種苗繁育模式導(dǎo)致其種質(zhì)嚴重退化。易感病、生長變緩、成蝦個體變小已成為阻礙克氏原螯蝦養(yǎng)殖產(chǎn)量增加與規(guī)格品質(zhì)提升的主要因素,遺傳改良克氏原螯蝦種苗迫在眉睫。種質(zhì)資源遺傳多樣性的高低在一定程度上決定選育潛力,克氏原螯蝦群體的遺傳多樣性及遺傳結(jié)構(gòu)評估可為其遺傳育種方案制定提供參考依據(jù)。已有研究顯示,入侵群體的遺傳多樣性常小于原產(chǎn)地群體的遺傳多樣性,但它們也具有相對較高的遺傳多樣性[8-11]。Barbaresi等[12]報道,入侵歐洲的克氏原螯蝦群體具有較高的遺傳變異。李喜蓮等[13]研究的我國8個克氏原螯蝦野生群體的遺傳多樣性也較高,且存在一定的遺傳分化。然而,我國克氏原螯蝦養(yǎng)殖群體自繁自育導(dǎo)致遺傳多樣性降低,加之不同養(yǎng)殖區(qū)域的種苗被相互引種,進一步加劇了種苗的同質(zhì)化。截至目前,我國克氏原螯蝦養(yǎng)殖群體遺傳多樣性及其同質(zhì)化程度等鮮有報道。為此,筆者通過收集與分析我國克氏原螯蝦養(yǎng)殖群體的遺傳多樣性與群體結(jié)構(gòu),以期了解這些種質(zhì)資源的現(xiàn)狀,并評估其育種應(yīng)用價值。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

表1 克氏原螯蝦群體采集地點與樣本量Tab.1 Collection locations and sample size of the red swamp crayfish P. clarkii population

1.2 試驗方法

1.2.1 DNA提取

取約50 mg克氏原螯蝦尾肌肉于1.5 mL離心管中,充分剪碎后采用苯酚-氯仿法[5]提取基因組DNA,加入200 μL超純水溶解DNA,經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測合格后,置于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 PCR擴增

將制備好的基因組DNA轉(zhuǎn)移至96孔PCR板中,分別用文獻[14]中的35個SSR標記(PCM108、PCM155、PCM158、PCM363、PCM364、PCM394、PCM409、PCM412、PCM414、PCM564、PCM588、PCM628、PCM646、PCM806、PCM858、PCM887、PCM898、PCM1033、PCM1299、PCM1639、PCM1673、PCM1733、PCM1790、PCM1846、PCM1867、PCM1966、PCM2012、PCM2017、PCM2062、PCM2096、PCM2116、PCM2275、PCM2318、PCM2344與PCM2370)進行PCR擴增。

反應(yīng)體系:10×Buffer 4 μL、dNTP 1 μL、r-Taq酶0.15 μL 、引物2 μL、DNA模板2 μL、加超純水至20 μL。反應(yīng)程序:95 ℃預(yù)變性3 min;95 ℃變性30 s,58 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,35個循環(huán);72 ℃延伸7 min。產(chǎn)物降溫至25 ℃后,加入2 μL溴酚藍混勻后,用瓊脂糖凝膠(1%)電泳檢測擴增效果。

1.2.3 聚丙烯酰胺凝膠電泳

用4%的聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測PCR擴增產(chǎn)物,閱讀各標記電泳條帶并統(tǒng)計分析。

1.2.4 遺傳統(tǒng)計分析

收集14個群體的微衛(wèi)星分子標記基因型數(shù)據(jù),利用POPGENE 3.2軟件[15]對等位基因數(shù)、期望雜合度、觀測雜合度、多態(tài)性信息含量、哈迪-溫伯格平衡、遺傳距離等進行分析。運用Structure 2.3.4軟件分析14個群體的群體結(jié)構(gòu),預(yù)熱次數(shù)為100 000,隨后進行1 000 000次重復(fù)計算[16]。利用MEGA 7.0軟件構(gòu)建非加權(quán)組平均法系統(tǒng)進化樹[17]。利用在線軟件Structure Harvester[18](http://taylor0.biology.ucla.edu/struct_harvest/)計算ΔK得出遺傳群體數(shù)目K。

選用50%抗蚜威可濕性粉劑1500倍液～1600倍液，或10%吡蟲啉可濕性粉劑2500倍液，或2.5%三氟氯氰菊酯乳油1500倍液～2000倍液噴霧防治，藥劑交替使用，隔7d～10d防治1次，防治1次或2次，收獲前5d～7d停止用藥。

2 結(jié) 果

2.1 不同地域群體微衛(wèi)星分子標記基因型分析

各標記的PCR產(chǎn)物經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(圖1)后,再將其產(chǎn)物片段按大小依次定義為“A”、“B”、“C”等位基因,最后統(tǒng)計基因型。基因型頻率大于0.3的基因型被定義為群體的主要基因型。所選用的標記在14個群體中的等位基因數(shù)為2～3,其中標記PCM158、PCM364、PCM588、PCM898、PCM1639、PCM1846、PCM2116與PCM2344有3個等位基因,其余標記均為2個等位基因(表2)。在所有檢測到的主要基因型(434個)中,純合子(279個)約占64.28%,表明各群體處于一定程度的雜合子缺失狀態(tài)。

圖1 PCM1673、PCM2116與PCM2318標記PCR產(chǎn)物的聚丙烯酰胺凝膠電泳圖Fig.1 Polyacrylamide gel electrophoresis of PCR products of makers of PCM1673, PCM2116 and PCM2318

表2 35個微衛(wèi)星分子標記在14個克氏原螯蝦群體中的主要基因型Tab.2 Main genotypes of the 35 SSR markers in the 14 populations of red swamp crayfish P. clarkii

2.2 不同地域群體遺傳多樣性分析

對各群體的平均雜合度進行分析得出,采集的14個群體的平均多態(tài)信息含量為0.33～0.43(表3)。當(dāng)多態(tài)信息含量>0.5時即為具有高多態(tài)性,而0.25<多態(tài)信息含量<0.5時,則視為具有中度多態(tài)性,由此可見,本研究的14個群體均只具有中度多態(tài)性。各地域群體的平均觀測雜合度與平均期望雜合度分別為0.32～0.41和0.36～0.44。其中,遞鋪、龍南群體的平均期望雜合度最小(0.36),衢州群體平均期望雜合度最大(0.44)。除溫州群體外,其他13個群體的平均觀測雜合度均小于平均期望雜合度?？傊?本研究的14個養(yǎng)殖群體具有中等遺傳多樣性,其中遞鋪和龍南群體的遺傳變異相對較小。

表3 35個微衛(wèi)星分子標記在14個克氏原螯蝦群體中的平均多態(tài)信息含量與平均雜合度(平均值±標準差)Tab.3 Mean polymorphism information content and heterozygosity of the 35 SSR markers in the 14 populations of red swamp crayfish P. clarkii (Mean±SD)

2.3 不同地域群體哈迪-溫伯格平衡分析

分別對14個群體的35個微衛(wèi)星分子標記位點進行哈迪-溫伯格平衡分析,其結(jié)果顯示:除了香樹壩和椿木營群體外,其余12個群體均在多個標記(≥5)位點存在基因型分布偏離哈迪-溫伯格平衡現(xiàn)象(P<0.05)(表4),推測該不平衡是由雜合子缺失所致。

表4 哈迪-溫伯格平衡檢驗Tab.4 Hardy-Weinberg equilibrium test

2.4 不同地域群體遺傳距離分析

14個群體的遺傳距離分析結(jié)果表明,各地域群體的遺傳距離為0.03～0.15,遺傳距離越大表示親緣關(guān)系越遠(表5)。新余和臨江及蓮花池的遺傳距離分別為0.03,親緣關(guān)系最近。武漢和遞鋪的遺傳距離為0.15,親緣關(guān)系最遠?；贜ei′s遺傳距離對14個群體構(gòu)建的非加權(quán)組平均法系統(tǒng)發(fā)育樹見圖2。14個群體大致可聚為4個類群,香樹壩、溫州、衢州群體和吉安、天荒坪、遞鋪群體分別聚為2個類群,龍南單獨為1個類群,其余群體為1個類群。由此可見,多數(shù)地理位置較近的群體往往聚為同一類群。

表5 14個克氏原螯蝦群體的遺傳距離Tab.5 Genetic distance of the 14 populations of red swamp crayfish P. clarkii

圖2 14個克氏原螯蝦群體非加權(quán)組平均法系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 UPGMA phylogenetic tree of the 14 populations of red swamp crayfish P. clarkii

2.5 不同地域群體的遺傳結(jié)構(gòu)分析

利用Structure軟件與在線軟件Structure Harvester對14個群體的遺傳結(jié)構(gòu)分析得出,K=4(圖3a),表明本研究的14個克氏原螯蝦群體可分為4個遺傳群體。吉安、天荒坪、遞鋪群體(1～3)的遺傳結(jié)構(gòu)較為相似,此外,溫州、衢州、香樹壩與武漢群體(5～8)的遺傳結(jié)構(gòu)也較為相似,但前者(1～3)的遺傳結(jié)構(gòu)明顯不同于后者(5～8),為此,它們可被視為2個不同的遺傳群體(圖3b)。同理,龍南群體(4)和其余6個群體(9～14)屬于另外2個不同的遺傳群體。

圖3 14個克氏原螯蝦群體的群體結(jié)構(gòu)分析Fig.3 Population structure analysis of the 14 populations of red swamp crayfish P. clarkiia.ΔK評估值;b.當(dāng)K=3、4、5時,14個克氏原螯蝦群體的結(jié)構(gòu)圖,1～14分別表示吉安、天荒坪、遞鋪、龍南、溫州、衢州、香樹壩、武漢、新余、臨江、蓮花池、椿木營、陽新與修水群體.a.the assessed values of Delta K; b.population structure map of the 14 populations of red swamp crayfish at K=3, 4, and 5; the populations of Jian, Tianhuangping, Dipu, Longnan, Wenzhou, Quzhou, Xiangshuba, Wuhan, Xinyu, Linjiang, Lianhuachi, Chunmuying, Yangxin and Xiushui are represented by the number from 1 to 14, respectively.

3 討 論

3.1 克氏原螯蝦野生群體遺傳多樣性大于養(yǎng)殖群體

本研究結(jié)果顯示,我國14個地區(qū)的克氏原螯蝦養(yǎng)殖群體的平均多態(tài)信息含量為0.33～0.43、平均觀測雜合度與平均期望雜合度分別為0.32～0.41、0.36～0.44,表明這14個克氏原螯蝦養(yǎng)殖群體具有中度的遺傳多樣性。目前,關(guān)于我國克氏原螯蝦養(yǎng)殖群體遺傳多樣性鮮有報道。黃小芳等[19]探究過廣西5個地區(qū)(南寧、大塘、融水、柳州和來賓)的克氏原螯蝦養(yǎng)殖群體的遺傳多樣性,其結(jié)果顯示,在檢測群體中,各標記位點的有效等位基因數(shù)、平均期望雜合度與平均多態(tài)信息含量分別為2.5142～3.0574、0.5708～0.6489與0.4899～0.5843,表明被檢測群體具有中度或高度的遺傳多樣性。與本研究的14個養(yǎng)殖群體相比,上述廣西的5個養(yǎng)殖群體遺傳多樣性較高。由此推測:廣西并非克氏原螯蝦的主養(yǎng)區(qū),種苗主要來源于捕撈野生群體;而本研究的群體大多數(shù)來自于克氏原螯蝦的主養(yǎng)區(qū)(湖北與江西),其種苗已自繁自育多代,導(dǎo)致近交使其遺傳多樣性降低。相反,克氏原螯蝦野生群體的遺傳多樣性研究報道較多,如:曹玲亮[20]報道,長江、新安江、淮河3大流域9個地域的野生群體的平均期望雜合度和平均觀測雜合度分別為0.779與0.360;邢智珺[21]研究結(jié)果顯示,江蘇9個克氏原螯蝦野生群體的平均觀測雜合度為0.556,平均期望雜合度為0.745,多態(tài)信息含量為0.509～0.875;譚云飛等[22]報道,長江中下游13個地域野生群體的平均期望雜合度、平均觀測雜合度與多態(tài)性信息含量分別為0.37～0.57、0.23～0.48與0.40～0.56。這些研究結(jié)果表明,我國各地域克氏原螯蝦野生群體具有中度到高度的遺傳多樣性。而本研究采集的克氏原螯蝦養(yǎng)殖群體的遺傳多樣性明顯低于野生群體的遺傳多樣性,這一結(jié)論也與已有研究相似[23]。

3.2 不同地域的克氏原螯蝦養(yǎng)殖群體趨于同質(zhì)化

本研究的14個養(yǎng)殖群體的遺傳距離為0.03～0.15,與曹玲亮[20]研究的長江、新安江、淮河3大流域9個地域的野生群體的遺傳距離(0.06～0.18)較為相近,但低于邢智珺[21]研究的群體(0.071～0.611)與李喜蓮等[13]研究的群體(0.010～0.412)。理論上,由于地理隔離,不同地域的克氏原螯蝦群體會存在一定的遺傳分化,但本研究結(jié)果卻與其并不相符。推測其原因有二:首先,養(yǎng)殖群體的種苗多為人為引種,致使不同地域群體間的基因流動增加,進而使它們的種質(zhì)趨于同質(zhì)化;其次,養(yǎng)殖群體的種苗基本為自繁自育,近交嚴重,導(dǎo)致它們的遺傳多樣性降低,雜合子缺失。這也與本研究中的多數(shù)微衛(wèi)星標記位點基因型存在偏離哈迪-溫伯格平衡的結(jié)果相吻合。

3.3 克氏原螯蝦種質(zhì)現(xiàn)狀與展望

當(dāng)前,我國克氏原螯蝦產(chǎn)業(yè)規(guī)模大,具有較強的發(fā)展?jié)摿ΑＨ欢?在克氏原螯蝦養(yǎng)殖中,優(yōu)良種苗缺乏嚴重制約了其產(chǎn)業(yè)的持續(xù)發(fā)展。本研究結(jié)果顯示我國14個克氏原螯蝦養(yǎng)殖群體的遺傳多樣性明顯低于野生群體,且同質(zhì)化愈發(fā)嚴重。豐富的種質(zhì)資源是良種培育的關(guān)鍵,雖然野生克氏原螯蝦遺傳多樣性相對豐富,但是野生克氏原螯蝦種質(zhì)資源被過度捕撈、對其種質(zhì)資源多樣性造成了嚴重威脅。為此,建立我國野生克氏原螯蝦種質(zhì)資源保護區(qū),構(gòu)建其核心種質(zhì)資源庫,加快克氏原螯蝦優(yōu)良品種培育,提高種苗繁育技術(shù)水平,將對其產(chǎn)業(yè)的持續(xù)發(fā)展具有重要的意義。

4 結(jié) 論

本研究中的14個克氏原螯蝦養(yǎng)殖群體具有中度遺傳多樣性,各標記位點均存在雜合子缺失,經(jīng)過遺傳距離和群體結(jié)構(gòu)分析,可將采集的群體分為4個遺傳群體。