丁祝進,崔虎軍,谷昭天,趙曉恒,程漢良

( 1.江蘇海洋大學 海洋科學與水產學院,江蘇 連云港 222005; 2.江蘇省海洋生物技術重點實驗室,江蘇 連云港 222005; 3.江蘇省海洋生物資源與環(huán)境重點實驗室,江蘇省海洋生物產業(yè)技術協(xié)同創(chuàng)新中心,江蘇 連云港 222005 )

魚類的免疫系統(tǒng)由非特異性免疫和特異性免疫組成,包括免疫組織和器官、免疫細胞及免疫因子等。魚類免疫細胞主要有兩種類型:一類是淋巴細胞,主要參與特異性免疫應答;另一類是吞噬細胞,作為非特異性和特異性免疫系統(tǒng)的重要組成部分,在抵御病原體侵襲方面發(fā)揮著非常重要的作用。巨噬細胞是由單核細胞衍生而來的白細胞,主要是以固定或游離細胞的形態(tài)對細胞殘片和病原體進行吞噬、殺傷及消化,并激活淋巴細胞等其他免疫細胞,以抵御病原體感染從而保護生物體。魚類巨噬細胞可被不同刺激物誘導,分化成表型和功能具有顯著性差異的M1型和M2型巨噬細胞,不同類型巨噬細胞具有特定的標記物,筆者將對魚類巨噬細胞通用型、M1型和M2型標記物的相關研究進展進行綜述,相關標記物見表1。

表1 部分已報道的魚類巨噬細胞標記物Tab.1 Some of the fish macrophage markers reported

1 巨噬細胞的通用標記物

巨噬細胞是一種可塑性較高的免疫細胞,參與機體的多種免疫學功能。魚類巨噬細胞在未分化前,具有多種典型的標記物,稱為巨噬細胞的通用標記物,如巨噬細胞集落刺激因子受體蛋白等。通用標記物可介導巨噬細胞的多種免疫功能,并可用于魚類巨噬細胞的分選與鑒定,具有重要的研究意義。

集落刺激因子(CSF)是一類能刺激多能造血干細胞和不同發(fā)育階段造血祖細胞增殖分化,并在固定培養(yǎng)基中形成相應細胞集落的細胞因子。研究顯示,部分集落刺激因子可以動員中性粒細胞和巨噬細胞遷移、分化和增殖,并增強其吞噬功能,稱為粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)。巨噬細胞集落刺激因子(M-CSF,又稱CSF-1),最初發(fā)現于血清、尿液等體液中,主要由單核-巨噬細胞、淋巴細胞等分泌產生。巨噬細胞集落刺激因子在促進單核巨噬細胞生存、增殖、分裂和骨、胚胎的形成等多方面起到重要作用[27]。草魚巨噬細胞集落刺激因子與白細胞介素-4/13(IL-4/13)同源物可以協(xié)同促進巨噬細胞增殖[28]。金魚體內注射巨噬細胞集落刺激因子可增加血液中循環(huán)單核細胞的數量,且在原代金魚巨噬細胞培養(yǎng)中持續(xù)添加重組巨噬細胞集落刺激因子,可以穩(wěn)定細胞狀態(tài)并延長巨噬細胞的存活時間,并增強長期培養(yǎng)巨噬細胞的呼吸爆發(fā)活性[29]。金魚巨噬細胞對巨噬細胞集落刺激因子表現出濃度依賴性的趨化反應及吞噬活性增強,但該效應在培養(yǎng)基中添加巨噬細胞集落刺激因子受體后受到抑制[30]。因此,魚類巨噬細胞集落刺激因子在促進巨噬細胞增殖、維持巨噬細胞體外穩(wěn)定培養(yǎng)、延長巨噬細胞存活時間、增強巨噬細胞免疫活性等方面都發(fā)揮著重要作用。

巨噬細胞集落刺激因子受體是巨噬細胞的通用標記物[1],屬于生長因子受體家族,與巨噬細胞集落刺激因子結合后發(fā)生二聚化或多聚化,從而激活一系列信號轉導過程,對巨噬細胞的生長、增殖和分化等具有重要作用。在正常情況下,巨噬細胞集落刺激因子受體以跨膜蛋白的形式分布于細胞膜上,巨噬細胞集落刺激因子與其受體結合發(fā)揮著多種生物學效應,可以延長成熟巨噬細胞的壽命,增強正常巨噬細胞的生物學功能,參與多種與非造血組織、器官、系統(tǒng)相關的生長和發(fā)育,并影響著與之相關的疾病發(fā)生[31]。

巨噬細胞集落刺激因子受體在多種魚類中都已克隆、鑒定,并作為巨噬細胞標記物進行應用[32]。金頭鯛巨噬細胞集落刺激因子受體mRNA基因雖然在鰓、肝臟、脾臟和頭腎等不同免疫組織中均有表達,但其表達僅限于單核/巨噬細胞譜系,且其表達可能受巨噬細胞激活階段的影響[2]。金魚巨噬細胞集落刺激因子受體抗體可特異性識別單核細胞、巨噬細胞及其祖細胞,單核細胞中始終存在巨噬細胞集落刺激因子受體,并且在分化為巨噬細胞后也持續(xù)高表達,表明其是金魚巨噬細胞的特異性標記物[3]。香魚巨噬細胞集落刺激因子受體基因也主要在頭腎單核細胞/巨噬細胞、脾臟和頭腎中表達,并且鰻弧菌(Vibrioanguillarum)感染后表達顯著上調,表明其參與調控香魚巨噬細胞的吞噬功能[4]。草魚巨噬細胞集落刺激因子受體基因在單核/巨噬細胞中高表達,而在其他類型的白細胞中幾乎檢測不到,表明其可作為草魚巨噬細胞的特異性標記[5]。草魚巨噬細胞集落刺激因子受體基因的敲除不僅會導致單核/巨噬細胞處于抑炎狀態(tài),也會降低單核/巨噬細胞的吞噬活性。此外,研究表明,巨噬細胞集落刺激因子受體基因敲除會干擾斑馬魚胚胎至成魚巨噬細胞的發(fā)育,從而使斑馬魚幼魚表現出系統(tǒng)性巨噬細胞缺失[33]。也有研究表明,魚類巨噬細胞集落刺激因子受體在單核細胞和巨噬細胞譜系中特異性高表達,并且對巨噬細胞的吞噬功能具有顯著的調控作用,因此可以作為魚類巨噬細胞的特異性標記物。

2 巨噬細胞的極化及相應標記物

單核(巨噬)細胞和中性粒細胞是魚類中兩類重要的吞噬細胞。魚類單核細胞與哺乳動物中類似,從血管遷移到各種組織中分化發(fā)育為巨噬細胞,魚類巨噬細胞不僅在非特異性免疫中具有吞噬和殺傷功能,在特異性免疫中作為抗原呈遞細胞也發(fā)揮著重要作用。硬骨魚類的細胞因子如白細胞介素-4、白細胞介素-13和γ-干擾素與巨噬細胞激活及分化有關,白細胞介素-1、γ-干擾素等活化巨噬細胞后,不僅可以通過分泌殺傷性物質殺死靶細胞或病原體,還可以通過分泌白細胞介素-1、γ-干擾素、腫瘤壞死因子-α等細胞因子來增強自身的免疫功能。通過類比T輔助細胞1和T輔助細胞2極化的概念,根據巨噬細胞對不同環(huán)境刺激的反應,可將其分為表型和功能不同的M1型巨噬細胞和M2型巨噬細胞[34]。

γ-干擾素誘導的M1型巨噬細胞可分泌大量炎癥因子,能夠抗血管形成、抗膠原蛋白合成及清除病原體,并與動脈硬化、胰島素抵抗等代謝性疾病相關,被稱為經典活化巨噬細胞[35-38]。M2型巨噬細胞主要參與炎癥消除[37],抑制T細胞的增殖和活化,有助于組織再生[39]。M2型巨噬細胞又可分為M2a、M2b、M2c 3種亞型[40]。M2a型巨噬細胞主要由白細胞介素-4/13誘導,也稱為愈合性巨噬細胞,可以產生多種抗炎因子,從而抑制炎癥反應并促進血管生成[41]。M2b巨噬細胞被Toll樣受體配體或白細胞介素-1受體激動劑等免疫復合物及凋亡細胞聯合誘導后形成,具有抑制急性炎癥反應、促進Th2免疫及體液免疫發(fā)生的作用。M2c巨噬細胞由白細胞介素-10、轉化生長因子和糖皮質激素誘導后形成,能夠抑制炎性反應、促進組織重塑[41-42]。

2.1 M1型巨噬細胞標記物

脂多糖、γ-干擾素和巨噬細胞集落刺激因子等刺激后極化的巨噬細胞稱為炎癥性巨噬細胞或M1型巨噬細胞。脂多糖通過哺乳動物Toll樣受體4激活核因子κB(NFκB)、激活蛋白-1(AP-1)等信號因子,從而誘導下游γ-干擾素和腫瘤壞死因子-α表達,并產生M1型巨噬細胞的表型特征[43]。魚類中的研究表明,體外脂多糖刺激后會引起巨噬細胞呼吸爆發(fā)、產生一氧化氮自由基并誘導促炎型細胞因子分泌[44]。此外,魚類γ-干擾素單獨或與脂多糖聯合刺激都會增強巨噬細胞的吞噬功能,引起呼吸爆發(fā),并誘導白細胞介素-1β、白細胞介素-6、白細胞介素-12和腫瘤壞死因子-α等促炎性細胞因子及多種趨化因子表達[45]。目前,已報道的魚類M1型巨噬細胞標記物包括誘導型一氧化氮合酶、腫瘤壞死因子-α、白細胞介素-1β、白細胞介素-6、C-X-C型趨化因子11aa和C-X-C型趨化因子受體3.1等趨化因子及受體。

2.1.1 誘導型一氧化氮合酶

一氧化氮合酶(NOS)是一種同工酶,分布于巨噬細胞、神經吞噬細胞、內皮細胞及神經細胞中。哺乳動物一氧化氮合酶有3種亞型:一是正常狀態(tài)下表達的神經型一氧化氮合酶(nNOS);二是內皮型一氧化氮合酶(eNOS);三是損傷后誘導表達的誘導型一氧化氮合酶,該亞型是由2個鈣調蛋白和2個一氧化氮合酶連接構成的四聚體[46]。

系統(tǒng)發(fā)育表明,誘導型一氧化氮合酶基因在鯉與高等脊椎動物中高度同源,推測其與哺乳動物誘導型一氧化氮合酶相似,可以作為魚類M1型巨噬細胞的標記物[6]。鯉頭腎巨噬細胞被脂多糖刺激時會極化產生M1型巨噬細胞表型,且轉錄組測序分析發(fā)現,誘導型一氧化氮合酶基因表達顯著上調。在大黃魚腫瘤壞死因子-α誘導的促炎性巨噬細胞極化中,誘導型一氧化氮合酶等炎性細胞因子基因表達顯著上調,并引起一氧化氮產生及呼吸爆發(fā)[7]。重唇魚在肝臟表達抗菌肽2 (LEAP-2)單獨或與脂多糖聯合處理巨噬細胞時也可誘導M1型極化,其炎性反應包括引起巨噬細胞呼吸爆發(fā),并促進誘導型一氧化氮合酶、白細胞介素-1β和腫瘤壞死因子-α等炎性細胞因子基因表達顯著上調[8]。

誘導型一氧化氮合酶在魚類組織中廣泛分布且能在病原侵染時快速應答,因而在魚類中發(fā)揮著重要的免疫作用。鮭腎桿菌(Renibacteriumsalmoninarum)感染虹鱒后,誘導型一氧化氮合酶基因僅在鰓和頭腎巨噬細胞中表達上調[9]。此外,虹鱒感染病毒性出血敗血癥后,脾、頭腎和肝臟巨噬細胞誘導型一氧化氮合酶基因被顯著誘導表達[47],表明巨噬細胞誘導型一氧化氮合酶在虹鱒抗病毒防御過程中也發(fā)揮了重要作用。鯉經過嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)刺激后,誘導型一氧化氮合酶基因在多組織中廣泛被誘導表達,其中頭腎巨噬細胞中的表達量上調最顯著[46]。因此,誘導型一氧化氮合酶已被證明是參與魚類多種免疫過程的重要效應酶,尤其在寄生蟲[48-49]、細菌[50]和病毒[51]等病原體侵染后,巨噬細胞中誘導型一氧化氮合酶基因表達量均顯著上調,表明其參與魚類抵抗病原感染的炎癥反應,是魚類M1型巨噬細胞的重要標記物。

2.1.2 腫瘤壞死因子-α

腫瘤壞死因子-α屬于TNF超家族成員,能增強殺傷細胞活性,抑制和殺傷腫瘤細胞,促進淋巴細胞增殖和分化[52],是機體抵抗細菌、寄生蟲及病毒感染的重要炎性細胞因子[53]。腫瘤壞死因子-α主要由活化的巨噬細胞產生,M1型和M2b型巨噬細胞是分泌腫瘤壞死因子-α的主要細胞類型[37,54],在其他細胞如中性粒細胞、淋巴細胞、NK細胞和肥大細胞中也可以被誘導分泌[55]。

大黃魚單核/巨噬細胞在腫瘤壞死因子-α1/α2蛋白處理后可大量誘導活性氧和一氧化氮產生,并引起炎性細胞因子誘導型一氧化氮合酶、腫瘤壞死因子-α1、白細胞介素-1β、白細胞介素-6和白細胞介素-8基因表達上調,并增強巨噬細胞吞噬功能,表明腫瘤壞死因子-α可以誘導大黃魚M1型巨噬細胞形成,且是重要的M1型極化標記物[7]。此外,建立的2種大黃魚巨噬細胞系在脂多糖刺激后,腫瘤壞死因子-α、白細胞介素-1β等炎性細胞因子基因表達量被誘導上調[10]。類似的是,香魚巨噬細胞在脂多糖處理后也可誘導M1型極化標記物腫瘤壞死因子-α和白細胞介素-1β基因表達上調,而該調控作用受到具有膠原結構的巨噬細胞受體抑制[11]。筆者所在實驗室研究表明,團頭魴內凝集素蛋白孵育巨噬細胞后可以誘導M1型極化,并顯著促進腫瘤壞死因子-α和誘導型一氧化氮合酶等炎性細胞因子表達上調,表明腫瘤壞死因子-α和誘導型一氧化氮合酶等可以作為團頭魴M1型巨噬細胞的極化標記物[56-57]。在斑馬魚極化巨噬細胞亞群的建立和鑒定研究中,M1型巨噬細胞主要以腫瘤壞死因子-α作為標記物進行鑒定[12]。上述研究表明,炎性細胞因子腫瘤壞死因子-α作為魚類巨噬細胞M1型極化標記物已得到廣泛應用。

2.1.3 白細胞介素家族

白細胞介素是多種細胞分泌并可作用于多種靶細胞的一類細胞因子家族。因最初由白細胞分泌并作用于白細胞,并具有重要的調節(jié)作用,因此得名并沿用至今[58]。白細胞介素是在生物學功能和分子結構上已基本明確,且具有重要生物學調節(jié)作用的一類細胞因子。白細胞介素在信號傳遞,激活與調節(jié)免疫細胞,介導T細胞和B細胞活化、增殖與分化及炎癥反應中發(fā)揮著重要作用。目前,已發(fā)現的白細胞介素成員至少有38個,分別被命名為白細胞介素-1～白細胞介素-38,功能復雜多樣。有關白細胞介素的研究很多,本節(jié)主要綜述與M1型巨噬細胞極化相關的標記物白細胞介素-1β和白細胞介素-6。

(1)白細胞介素-1β

白細胞介素-1β是魚類炎癥反應中最先分泌的細胞因子之一,也是M1型巨噬細胞的極化標記物,目前在鯉形目、鮭形目、鱸形目等多種類型魚類中均已克隆、鑒定。雖然魚類白細胞介素-1β與哺乳動物類似,但仍存在一定的差異。哺乳動物白細胞介素-1β具有7個外顯子和6個內含子,而鮭形目魚類白細胞介素-1β只含有6個外顯子,鱸形目魚類白細胞介素-1β只含有5個外顯子,并且魚類白細胞介素-1β的剪切機制還不完全清楚。

魚類第一個白細胞介素-1β是通過同源克隆的方法在虹鱒中獲得的,與哺乳動物白細胞介素-1β的氨基酸相似性為49%～56%,與鯉白細胞介素-1β的相似性為57%[59],此后魚類白細胞介素-1β得到了廣泛研究。脂多糖可誘導虹鱒白細胞介素-1β基因的表達,且其表達水平受脂多糖濃度、環(huán)境溫度和皮質醇水平等因素影響。脂多糖質量濃度為1.5 μg/mL時誘導的白細胞介素-1β表達量約是質量濃度為0.1 μg/mL時的18倍,且脂多糖在22 ℃和14 ℃處理虹鱒頭腎白細胞時白細胞介素-1β的轉錄水平分別是4 ℃處理時的8倍和2倍,而皮質醇卻會抑制脂多糖對白細胞介素-1β的誘導表達作用[14]。此外,虹鱒白細胞介素-1β可誘導巨噬細胞環(huán)氧化酶2(COX-2)和Ⅱ型主要組織相容性復合體(MHC Ⅱ)的表達,并增強頭腎白細胞的吞噬活性。大黃魚重組白細胞介素-1β可增強其對溶藻弧菌(V.alginolyticus)的抵抗力,且在體外可誘導單核/巨噬細胞趨化,并增強巨噬細胞的吞噬和殺菌活性[15]。香魚經鰻利斯頓氏菌(Listonellaanguillarum)感染后,單核/巨噬細胞中的白細胞介素-1β蛋白表達顯著上調,中和白細胞介素-1β不會改變香魚頭腎來源的單核/巨噬細胞的吞噬作用,但降低了其殺菌能力。因此,香魚白細胞介素-1β可能在免疫應答中發(fā)揮重要作用,特別是參與單核/巨噬細胞對細菌的殺傷作用[16]。綜上所述,魚類白細胞介素-1β在炎癥或病原感染時表達上調,并通過增強巨噬細胞的吞噬或殺傷功能發(fā)揮其免疫保護作用,且白細胞介素-1β和腫瘤壞死因子-α作為魚類巨噬細胞M1型極化的典型標記物已被廣泛應用。

(2)白細胞介素-6

哺乳動物白細胞介素-6家族由白細胞介素-6、白細胞介素-11、睫狀神經營養(yǎng)因子、白血病抑制因子、抑瘤素M、心肌營養(yǎng)素-1、心肌營養(yǎng)蛋白樣細胞因子等組成[58]。在魚類中,白細胞介素-6是一種多功能的細胞因子,也是最重要的促炎細胞因子之一[60-61],具有廣泛的生物學效應,在先天性免疫和獲得性免疫方面都有著重要的功能[62]。在誘導巨噬細胞極化的經典方法中,脂多糖是誘導M1和M2b型巨噬細胞的常用刺激物,且白細胞介素-6在脂多糖誘導的M1和M2b巨噬細胞中高表達,但在M2a和M2c中表達較低。結合白細胞介素-10、ccl1等其他標記物,可通過白細胞介素-6從其他巨噬細胞亞群中鑒定M2b[35]。

2005年,利用人類和河豚基因組某些區(qū)域之間的同線性,在紅鰭東方鲀(Takifugurubripes)中鑒定了魚類中的第一個白細胞介素-6序列[63],魚類白細胞介素-6的發(fā)現將允許對局部炎癥反應進行更深入的研究。脂多糖、poly (I:C)和白細胞介素-1β等促炎因子可誘導虹鱒巨噬細胞系RTS-11和原代頭腎巨噬細胞表達白細胞介素-6,虹鱒重組白細胞介素-6刺激增加了RTS-11細胞的數量,表明白細胞介素-6可以促進虹鱒巨噬細胞系RTS-11的增殖[17]。此外,虹鱒重組白細胞介素-6還可以誘導巨噬細胞鐵調素的表達,從而通過抑制鐵的吸收來增強巨噬細胞的抑菌功能。因此,魚類白細胞介素-6在巨噬細胞炎癥反應中被誘導表達后,可通過誘導鐵調素表達來限制鐵的獲取,從而將鐵缺乏作為限制病原侵染的一種手段[17]。鰻弧菌感染后香魚白細胞介素-6基因在主要免疫組織和單核/巨噬細胞中的表達量均顯著上調,重組白細胞介素-6孵育香魚巨噬細胞可增強促炎細胞因子表達及其吞噬與殺菌能力,且白細胞介素-6受體β(IL-6Rβ)對該效應起主要調控作用[18]。研究表明,鯉巨噬細胞可以極化為M1和M2表型,并具有保守的功能和相應的轉錄譜,M1極化的巨噬細胞一氧化氮的產生增加,轉錄組測序分析表明白細胞介素-1β、白細胞介素-6、白細胞介素-12、血清淀粉樣蛋白A(SAA)等促炎細胞因子的轉錄水平增加[19]。由此可知,白細胞介素-6作為魚類重要的M1型極化標記物能快速響應魚類炎癥反應和病原感染,并對巨噬細胞增殖、吞噬和殺菌功能起到促進作用。

2.1.4 趨化因子和趨化因子受體

趨化因子,由70～100個氨基酸組成,蛋白大小僅8～10 ku,是一類由細胞分泌的信號蛋白或細胞因子。趨化因子可以聚集并激活白細胞作用于感染部位參與免疫反應,在炎癥反應和非特異性免疫中具有重要作用。趨化因子有多種分類方式,根據生理功能的不同,可將其分為誘導型趨化因子和組成型趨化因子[64],前者主要誘導嗜中性粒細胞、單核細胞、活化的T細胞等到炎癥部位,后者主要是對機體起免疫監(jiān)控和維持機體動態(tài)平衡的作用[64-65];根據趨化因子多肽鏈一級結構中前2個半胱氨酸的排列位置可分為4類,分別是:近氨基端的兩個半胱氨酸之間還有一個其他氨基酸的為CXC亞族或α亞族,近氨基端的2個半胱氨酸緊密相連的是CC亞族或β亞族,近氨基端只有1個半胱氨酸的為C亞族或γ亞族,近氨基端的2個半胱氨酸之間有3個其他氨基酸的為CX3C亞族或δ亞族。此外,魚類還擁有1類特有的CX亞族,而近些年來對魚類的趨化因子的研究大都集中在CXC型和CC型2類[66]。CXC型和CC型趨化因子均可作用于嗜中性粒細胞、淋巴細胞和單核巨噬細胞[65,67]。趨化因子受體根據結合配體的不同可以分為4類:CCR,即CC亞族趨化因子的受體;CXCR,即CXC亞族趨化因子的受體;XCR,即C亞族趨化因子的受體;CX3CR,即CX3C趨化因子的受體。

趨化因子受體CXCR3被認為是香魚、草魚和黑青斑河鲀的M1(CXCR3.1)和M2(CXCR3.2)型巨噬細胞的標記物[20]。CXCR3.1和CXCR3.2基因對草魚和黑青斑河鲀的巨噬細胞極化有調節(jié)作用,并首次證明了硬骨魚巨噬細胞極化受趨化因子受體的調節(jié)。香魚CXCL9-11l2和CXCL9-11l3通過與CXCR3.1相互作用誘導CXCR3.1+巨噬細胞趨化和M1表型,CXCL9-11l1和CXCL9-11l2通過與CXCR3.2相互作用誘導CXCR3.2+巨噬細胞趨化和M2表型。上述結果表明,在硬骨魚中CXCR3.1和CXCR3.2通過與其特異性配體相互作用來介導巨噬細胞極化[20]。斑馬魚CXCL11aa是人類CXCL11的同源物,細菌感染時可作為M1型巨噬細胞極化的標記物[13]。綜上所述,魚類趨化因子及其受體種類繁多,在誘導魚類巨噬細胞M1型和M2型極化或作為極化標記物方面都有較多的研究,表明魚類趨化因子及其受體在巨噬細胞功能分化中扮演著重要角色。

2.2 M2型巨噬細胞標記物

2.2.1 精氨酸酶-2

精氨酸酶是一種能夠水解L-精氨酸脒基并生成鳥氨酸與尿素的反應酶,一般存在于可產生尿素的動物如哺乳類、兩棲類、板鰓魚類、海龜類的肝臟、腎臟和精巢中,在植物與微生物中也有分布。精氨酸酶目前發(fā)現兩種亞型:精氨酸酶-1和精氨酸酶-2,兩者之間氨基酸序列約有60%的同源性[68],主要區(qū)別在于組織分布、亞細胞定位及免疫反應不同。精氨酸酶-1在肝臟中的表達量較高,催化L-精氨酸酶代謝為L-鳥氨酸和尿素,是尿素循環(huán)的最后步驟,對體內的氨解毒起著重要作用[69]。精氨酸酶-2是一種線粒體酶,主要存在于線粒體中[70],幾乎在所有器官都有表達。魚類精氨酸酶是一種M2型巨噬細胞的典型標記物。

與其他脊椎動物一樣,硬骨魚表達精氨酸酶-1和精氨酸酶-2兩種精氨酸酶,但這兩種異構體都存在線粒體靶向序列,表明這兩種酶都是線粒體形式的。由此可見,精氨酸酶在魚類中起線粒體酶的作用。鯉頭腎巨噬細胞在環(huán)磷酸腺苷(cAMP)刺激下極化形成M2表型,其特征是精氨酸酶-2基因表達上調,但精氨酸酶-1基因表達不變,而在脂多糖誘導形成的M1型巨噬細胞中精氨酸酶-2基因表達無顯著變化,表明精氨酸酶-2是鯉M2型巨噬細胞的重要標記物[6,21-22]。而且,鯉巨噬細胞極化為M2表型后抗炎介質增加,精氨酸酶活性增加,轉錄組測序分析表明,精氨酸酶-2等M2型極化標記物表達上調[19]。金頭鯛前列腺素E2可通過cAMP/CREB信號途徑誘導巨噬細胞M2型極化,并誘導精氨酸酶-2、甘露糖受體和白細胞介素-10等標記物基因顯著上調表達[23]。虹鱒和大西洋鮭的精氨酸酶-1和精氨酸酶-2基因在不同的刺激下也具有差異的表達模式,病原相關分子模式(PAMPs)和促炎性細胞因子可以顯著誘導精氨酸酶-1基因表達上調,而精氨酸酶-2基因表達主要受白細胞介素-4/13調控,表明虹鱒和大西洋鮭精氨酸酶-2是白細胞介素-4/13誘導的M2型極化的重要標記物[24]。類似的是,在金魚和草魚中的研究也表明,白細胞介素-4/13可顯著上調精氨酸酶-2基因表達水平及精氨酸酶-2活性,從而促進草魚巨噬細胞的M2型極化并抑制M1型極化的形成[25,28]。上述研究表明,精氨酸酶-2是魚類巨噬細胞M2型極化的重要標記物,并已被廣泛用于M2型極化鑒定。

2.2.2 清道夫受體CD163

清道夫受體(SR),是固有免疫中的一類重要模式識別受體,分為多種類型,主要包括SRA和SRB。其中,SRA含有6個半胱氨酸,SRB含有6～8個半胱氨酸。CD163屬于SRB家族,是位于細胞表面的糖蛋白受體,分子質量為130 ku,在高等脊椎動物中作為參與組織損傷修復的M2型巨噬細胞標記物。CD163的存在方式有兩種:一是在單核巨噬細胞上以跨膜大分子的形式存在,二是以可溶性CD163(sCD163)形式存在于組織液中[71]。CD163與sCD163均在抑制炎癥反應方面起著重要的作用,因此也被認為是M2型單核巨噬細胞的特異性標記物[72-73]。目前,關于魚類CD163的研究相對較少。通過定期監(jiān)測虹鱒傷口中CD163基因的表達發(fā)現,受傷后1～3 d,CD163基因的表達量上調了10倍,受傷100 d后CD163基因表達顯著性上調了17倍。而且,魚類CD163的表達模式與M2c巨噬細胞在傷口中出現的預期時間一致,表明其是M2c巨噬細胞的重要標記物[26]。高等脊椎動物CD163對巨噬細胞的調控作用研究及其作為M2型極化標記物的應用較多,已有關于魚類CD163的研究也表明其參與組織修復,但其作為魚類M2型極化標記物的研究與應用還有待深入。

2.2.3 甘露糖受體

甘露糖受體(MR)又稱CD206。甘露糖受體作為一種模式識別受體主要表達于巨噬細胞及樹突細胞等免疫細胞表面[74],在識別病原、維持穩(wěn)態(tài)、抗原遞呈、誘導細胞因子等過程有著重要作用,同時也可用作巨噬細胞分型,其對巨噬細胞選擇性較強[75],是M2型巨噬細胞的特異性標記物[76]。甘露糖受體屬于多凝集素受體,可識別細胞表面或病原體細胞壁上的多種糖分子,通過參與受體介導的內吞和吞噬作用,將非特異性和特異性免疫聯系起來,組成機體的免疫防御系統(tǒng)。鯉MRC-1B基因在未刺激的巨噬細胞中有較高的基底表達量,在脂多糖刺激后表達下調5倍,而在cAMP刺激后上調3倍,推測MRC-1B是魚類重要的M2型巨噬細胞標記物[6]。類似的是,金頭鯛前列腺素E2可通過cAMP/CREB信號途徑誘導的巨噬細胞M2型極化中甘露糖受體作為標記物表達顯著上調[23]。團頭魴甘露糖受體具有典型的C型凝集素樣結構域,定位于細胞表面和胞內,這與哺乳動物巨噬細胞中甘露糖受體一致。此外,甘露聚糖和甘露糖受體特異性抗體抑制試驗均表明,團頭魴甘露糖受體蛋白通過Ca2+依賴性方式介導了巨噬細胞的吞噬作用[77]。近些年,魚類甘露糖受體對巨噬細胞的調控作用研究逐漸增多,并廣泛應用于M2型巨噬細胞鑒定。

3 展 望

巨噬細胞作為重要的免疫細胞,在機體抗病及免疫過程中發(fā)揮著至關重要的作用。M1型巨噬細胞具有促炎作用,而M2型巨噬細胞的功能與M1型巨噬細胞相反,包括抑制炎癥、促進修復及組織再生等。兩類巨噬細胞在功能和表型方面具有顯著差異,并分別具有特定的標記物,因此巨噬細胞標記物在不同極化類型巨噬細胞的鑒定、分選和功能研究中具有重要意義。目前,魚類巨噬細胞標記物相關的研究較少,已鑒定的魚類巨噬細胞標記物種類有限,且部分標記物僅在一種或少數魚類中有報道,很多魚類巨噬細胞標記物的研究依然需要參考高等脊椎動物的研究成果?；阼b定的魚類巨噬細胞標記物,可進行不同極化類型巨噬細胞的分選,并可促進魚類巨噬細胞極化標記物與表型特征及功能分化之間的關聯研究。因此,系統(tǒng)、全面地篩選巨噬細胞不同極化類型的標記物是魚類巨噬細胞功能研究及分選的基礎,也是魚類巨噬細胞研究的重要方向。

此外,已建立的魚類巨噬細胞系(株)較少,僅在虹鱒、大黃魚、羅非魚等少數魚類中有報道。魚類原代巨噬細胞具有分離步驟繁瑣,貼壁率、體外培養(yǎng)時間不穩(wěn)定等缺點,而細胞系相對于原代細胞具有重復性高、可標準化及實驗操作方便等優(yōu)勢,可為魚類巨噬細胞的功能研究提供較好的材料。而且,基于魚類巨噬細胞系可以建立穩(wěn)定的不同極化類型巨噬細胞模型,從而為系統(tǒng)研究異質性巨噬細胞的功能差異奠定基礎。綜上所述,對于魚類巨噬細胞極化標記物的系統(tǒng)性鑒定及巨噬細胞極化模型的建立具有重要意義,有助于解析魚類巨噬細胞在病原感染及炎癥反應中的免疫調控機制,并為魚類病害防治奠定理論基礎。