王桂興,何忠偉,劉玉峰,張曉彥,趙雅賢,任玉芹,王玉芬,侯吉倫

( 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院 北戴河中心實(shí)驗(yàn)站,河北 秦皇島 066100 )

牙鲆(Paralichthysolivaceus)是重要的海水養(yǎng)殖魚類,具有個體大、生長快、味道鮮美等特點(diǎn),深受廣大消費(fèi)者的喜愛。牙鲆雌性生長速度顯著快于雄性,通過人工誘導(dǎo)雌核發(fā)育技術(shù)制備的全雌牙鲆已經(jīng)在生產(chǎn)上得到了廣泛的應(yīng)用[1-3]。人工誘導(dǎo)雌核發(fā)育技術(shù)同時還能夠快速提高牙鲆的純合度和遺傳相似度[4-5],是快速建立魚類近交系的有效方法[6]。近交系的雜交后代具有明顯的雜種優(yōu)勢[7-8],利用雌核發(fā)育技術(shù)[3]和雜種優(yōu)勢能夠快速地選育出具有優(yōu)良生長性狀、抗逆性狀以及高品質(zhì)的新品種[9]。

隨著牙鲆養(yǎng)殖業(yè)的快速發(fā)展,病害問題也日益凸顯。在眾多病害中,由DNA病毒所引發(fā)的淋巴囊腫病對牙鲆養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)造成了嚴(yán)重的影響[10]。筆者團(tuán)隊(duì)針對淋巴囊腫病開展抗病新品種選育,并篩選到了抗病保護(hù)率在80%以上的家系2個[11]。以此為基礎(chǔ),進(jìn)一步利用人工雌核發(fā)育技術(shù)制備了上述2個家系的近交系,并進(jìn)行雜交,其子代經(jīng)淋巴囊腫病毒染毒養(yǎng)殖后的抗病保護(hù)率均逾90%(未發(fā)表中試試驗(yàn)數(shù)據(jù)),具有良好的抗病性能。

牙鲆作為我國北方重要的海水養(yǎng)殖魚類,其營養(yǎng)成分也是評價(jià)新品種養(yǎng)殖潛力的一個重要指標(biāo)。目前魚類肌肉營養(yǎng)價(jià)值研究已在主要海水養(yǎng)殖魚類中廣泛開展,如大黃魚(Pseudosciaenacrocea)[12-13]、大菱鲆(Scophthalmusmaximus)[14-17]、半滑舌鰨(Cynoglossussemilaevis)[18-20]、紅鰭東方鲀(Takifugurubripes)等[21-22]。在牙鲆上,開展了野生牙鲆與養(yǎng)殖牙鲆的肌肉營養(yǎng)比較[23-24],雌核發(fā)育牙鲆與普通牙鲆肌肉的營養(yǎng)比較[25],以及不同生長環(huán)境[26]、不同規(guī)格[15]、不同餌料飼養(yǎng)[27]的牙鲆肌肉營養(yǎng)的分析比較,但關(guān)于抗病新品系肌肉營養(yǎng)成分分析的報(bào)道較少。筆者分析對比牙鲆抗淋巴囊腫品系及其親本系的肌肉營養(yǎng)成分、氨基酸和脂肪酸的含量及組成,旨在為牙鲆抗淋巴囊腫病新品種選育和推廣提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

北戴河中心實(shí)驗(yàn)站在2016年選育出2個抗淋巴囊腫家系,2020年將2個家系作為親本進(jìn)行雜交制備出牙鲆抗淋巴囊腫品系,同時誘導(dǎo)了2個親本家系的減數(shù)分裂雌核發(fā)育系,進(jìn)行親本擴(kuò)繁。所用試驗(yàn)魚為2個親本抗淋巴囊腫系雌核發(fā)育后代及其雜交系(抗淋巴囊腫系),3系均在中國水產(chǎn)科學(xué)研究院北戴河中心實(shí)驗(yàn)站內(nèi)進(jìn)行工廠化流水養(yǎng)殖,養(yǎng)殖池面積為25 m2,養(yǎng)殖時間為2020年4月—2020年11月,養(yǎng)殖密度每月進(jìn)行一次標(biāo)準(zhǔn)化,使各池養(yǎng)殖條件基本保持一致,全程投喂東丸牌鲆鰈類苗種專用飼料,水溫17～25 ℃,pH 7.8～8.3,溶解氧8.0～10.0 mg/L。養(yǎng)殖密度約為10 kg/m2,日投喂2次(8:00和16:00),投餌量為體質(zhì)量的2%。2020年11月采樣時試驗(yàn)魚為7月齡,規(guī)格分別為:母系體質(zhì)量(219.88±33.82) g,體長(24.38±1.56) cm;父系體質(zhì)量(213.53±27.20) g,體長(23.76±1.68) cm;抗淋巴囊腫系體質(zhì)量(237.51±26.04) g,體長(24.61±0.94) cm。

飼料成分:粗蛋白≥52.0%,粗脂肪≥8.0%,賴氨酸≥3.0%,總磷≥1.5%,粗纖維≤3.0%,粗灰分≤16.0%,鈣≤2.0%,水分≤10.0%。

1.2 樣品采集與處理

每個家系分別隨機(jī)挑選無病無傷的試驗(yàn)魚9尾,鮮活取樣,切斷鰓蓋骨后緣的頸椎骨處死,放血后,取魚體兩側(cè)全部肌肉組織作為樣品,取樣過程在冰盤上完成。再隨機(jī)將3尾試驗(yàn)魚的肌肉組織樣品混合,使每個家系保有3個樣本,樣本量大于100 g,-80 ℃冰箱冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 常規(guī)營養(yǎng)成分的測定

粗蛋白含量參照GB 5009.5—2016(第一法)測定,粗脂肪含量參照GB 5009.6—2016(第二法)測定,粗灰分含量參照GB 5009.4—2016(第一法)測定,水分含量參照GB 5009.3—2016(第一法)測定。

1.4 氨基酸和脂肪酸的測定

色氨酸含量測定:樣品采用4.2 mol/L氫氧化鈉水解26 h,調(diào)節(jié)pH,使用戴安U3000高效液相色譜儀測定。胱氨酸含量測定:參照GB 5009.124—2016,用6 mol/L鹽酸水解22 h后,鹽酸水解液采用過氧甲酸氧化48 h,蒸干復(fù)溶后使用日立L-8900全自動氨基酸分析儀測定。其他16種氨基酸含量也參照GB 5009.124—2016,用6 mol/L鹽酸水解22 h后,蒸干復(fù)溶后使用日立L-8900全自動氨基酸分析儀測定。

脂肪酸含量參照GB 5009.168—2016(內(nèi)標(biāo)法),使用島津氣相色譜儀GC-2010測定。

1.5 營養(yǎng)價(jià)值的評定

營養(yǎng)價(jià)值依據(jù)聯(lián)合國糧食及農(nóng)業(yè)組織/世界衛(wèi)生組織的氨基酸評分標(biāo)準(zhǔn)模式[28]和雞蛋蛋白標(biāo)準(zhǔn)模式[29]進(jìn)行評價(jià)。氨基酸評分(AAS)、化學(xué)評分(CS)和必需氨基酸指數(shù)(EAAI)按下式計(jì)算:

(1)

(2)

(3)

(4)

式中,waa為樣品的氨基酸含量(%),wcp為樣品的粗蛋白含量(%),wa為氨基酸含量(mg/g,以N計(jì)),wFAO/WHO為聯(lián)合國糧食及農(nóng)業(yè)組織/世界衛(wèi)生組織評分模式中同種氨基酸含量,wEgg為雞蛋蛋白同種氨基酸含量(mg/g,以N計(jì)),A…I為樣品蛋白質(zhì)的必需氨基酸含量(mg/g,以N計(jì)),AE…IE為雞蛋蛋白的必需氨基酸含量(mg/g,以N計(jì)),n為氨基酸數(shù)。

1.6 數(shù)據(jù)分析方法

試驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示,采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行單因素方差分析及LSD法進(jìn)行組間多重比較,顯著性水平為0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 肌肉常規(guī)營養(yǎng)成分分析

抗淋巴囊腫系及親本系的肌肉粗蛋白質(zhì)含量為19.80%～20.83%,粗脂肪含量為0.73%～1.27%,粗灰分含量為1.30%～1.37%,水分為76.83%～77.63%。3系肌肉在粗蛋白質(zhì)、粗灰分、水分上含量差異不顯著,但粗脂肪含量上母系(1.27%)顯著高于抗淋巴囊腫系(0.73%)和父系(0.90%)(P<0.05)(表1)。

表1 牙鲆淋巴囊腫系及親本系肌肉常規(guī)營養(yǎng)成分對比(鮮樣) %Tab.1 Comparison of muscular proximate nutrient compositions (fresh weight) among hybrid and its parental strains of bastard halibut

2.2 肌肉蛋白質(zhì)中氨基酸含量與營養(yǎng)評價(jià)

本試驗(yàn)中,抗淋巴囊腫系及其親本系中均檢測到18種氨基酸(表2),其中必需氨基酸8種、半必需氨基酸2種、非必需氨基酸8種和鮮味氨基酸4種。氨基酸總量為18.82%～20.09%,其中含量最高的是谷氨酸(3.12%～3.29%),其次是天冬氨酸(2.03%～2.20%)、賴氨酸(1.82%～1.92%),色氨酸(0.14%～0.17%)含量均最低。必需氨基酸中,賴氨酸含量最高(1.82%～1.92%),色氨酸最低(0.14%～0.17%);3系中必需氨基酸、鮮味氨基酸和氨基酸總量均為抗淋巴囊腫系>母系>父系,但差異不顯著(P>0.05);3系間只有色氨酸和酪氨酸含量差異顯著(P<0.05),而其他16種氨基酸含量均差異不顯著(P>0.05);抗淋巴囊腫系及親本系的必需氨基酸/總氨基酸分別為40.92%、40.86%和40.94%,必需氨基酸/非必需氨基酸分別是79.88%、79.77%、80.24%,3系間差異不顯著(P>0.05)。

表2 牙鲆抗淋巴囊腫系及親本系氨基酸含量(鮮樣) %Tab.2 Amino acid composition and contents in muscle of hybrid and parental strains (fresh weight) in bastard halibut

2.3 必需氨基酸組成評價(jià)

必需氨基酸含量換算成每克氮中含氨基酸毫克數(shù)后,結(jié)果見表3。3系的必需氨基酸含量與聯(lián)合國糧食及農(nóng)業(yè)組織/世界衛(wèi)生組織及雞蛋蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)模式對比,結(jié)果顯示,抗淋巴囊腫系必需氨基酸總量(2945 mg/g)>父系(2702 mg/g)>母系(2667 mg/g),均高于聯(lián)合國糧食及農(nóng)業(yè)組織/世界衛(wèi)生組織的標(biāo)準(zhǔn)(2250 mg/g),但低于雞蛋蛋白模式(3059 mg/g)。必需氨基酸指數(shù)抗淋巴囊腫系(87.40)顯著高于母系(79.86)和父系(79.04)(P<0.05),而親本間差異不顯著(P>0.05)。氨基酸評分、化學(xué)評分結(jié)果顯示:抗淋巴囊腫系高于親本系,其中賴氨酸分值最高,亮氨酸次之,二者含量超過聯(lián)合國糧食及農(nóng)業(yè)組織/世界衛(wèi)生組織標(biāo)準(zhǔn)和雞蛋蛋白模式;第一限制性氨基酸為色氨酸(表4)。

表3 牙鲆抗淋巴囊腫系及其親本系必需氨基酸組成評價(jià)Tab.3 Comparison and evaluation of the essential amino acid content in bastard halibut P. olivaceus hybrids and parental strains

表4 牙鲆抗淋巴囊腫系及其親本系必需氨基酸組成的評價(jià)Tab.4 Evaluation of essential amino acid composition of bastard halibut P. olivaceus hybrids and parental strains

2.4 脂肪酸組成分析

本試驗(yàn)中,3系共計(jì)含有16種脂肪酸,其中飽和脂肪酸3種,單不飽和脂肪酸4種,多不飽和脂肪酸5種,3類脂肪酸總含量為單不飽和脂肪酸>飽和脂肪酸>多不飽和脂肪酸。母系脂肪酸數(shù)量(16種)>父系(14種)>抗淋巴囊腫系(12種),抗淋巴囊腫系和父系中均未檢測出花生酸和順,順-11,14-二十碳二烯酸,抗淋巴囊腫系還未檢出十五碳酸和珠光脂酸。飽和脂肪酸組成中,含量最高的脂肪酸均為棕櫚酸,單不飽和脂肪酸組成中含量最高的為油酸,多不飽和脂肪酸組成中含量最高為二十二碳六烯酸。單個脂肪酸上含量較高的依次為二十二碳六烯酸、棕櫚酸和亞油酸,含量較低為十五碳酸、珠光脂酸和花生酸等。3類脂肪酸含量在3系間差異顯著(P<0.05),且均為母系>父系>抗淋巴囊腫系。二十二碳六烯酸+二十碳五烯酸總含量為母系(359.33 mg/100 g)>父系(313.80 mg/100 g)>抗淋巴囊腫系(253.70 mg/100 g),且差異顯著(P<0.05)。

表5 牙鲆抗淋巴囊腫系及其親本系脂肪酸組成及含量(鮮樣) mg/100 gTab.5 Composition and contents (fresh weight) of fatty acids of hybrids and parental strains of bastard halibut P.olivaceus

3 討 論

筆者團(tuán)隊(duì)利用雌核發(fā)育方法建立牙鲆家系,并選育出2個抗淋巴囊腫病家系作為親本。本試驗(yàn)中,以牙鲆抗淋巴囊腫系及其親本的雌核發(fā)育系為研究對象,對3系的肌肉營養(yǎng)成分,氨基酸和脂肪酸的含量和組成進(jìn)行分析比較,為利用雌核發(fā)育技術(shù)選育牙鲆抗病新品系提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù),以期選育出更加優(yōu)質(zhì)的牙鲆抗病新品種。

3.1 抗淋巴囊腫系及其親本系的常規(guī)營養(yǎng)分析

在魚體肌肉品質(zhì)評價(jià)中,肌肉的營養(yǎng)成分組成和含量起著重要作用,其中蛋白質(zhì)和脂肪含量決定了其營養(yǎng)價(jià)值。本試驗(yàn)中,抗淋巴囊腫牙鲆3系間粗蛋白含量無顯著差異,并且與已報(bào)道的雌核發(fā)育牙鲆(21.34%)[25]、養(yǎng)殖牙鲆[26](網(wǎng)箱19.6%,工廠化19.8%,池塘20.03%)及野生牙鲆(19.9%)[30]相近,高于大黃魚(16.55%)[12]、大菱鲆(16.91%)[17]和半滑舌鰨(17.17%)[20]等其他海水魚類。而粗脂肪含量母系(1.27%)顯著高于父系(0.90%)和抗淋巴囊腫系(0.73%)。根據(jù)魚體脂肪含量,可將魚類分為少脂型(<2%)、低脂型(2%～<4%)、中脂型(4%～<8%)和高脂型(≥8%)4大類[31]。本試驗(yàn)中,3系脂肪含量均小于2%,屬于少脂型。可見牙鲆抗淋巴囊腫系及其親本家系的肌肉具有高蛋白低脂肪的特點(diǎn),營養(yǎng)品質(zhì)較高,符合現(xiàn)代人們對健康食品的要求。

本試驗(yàn)中,牙鲆抗淋巴囊腫系作為雜交子一代,在粗蛋白含量上略低于父本系,而顯著低于母系。雜交黃顙魚(Pelteobagrusvachell♀×P.fulvidraco♂)“黃優(yōu)1號”[32]粗脂肪含量雖低于雙親,但差異不顯著;牙鲆(♀)×犬齒牙鲆(P.dentatus)(♂)雜交子一代[33]、小黃魚(L.polyactis)♀×大黃魚♂雜交子一代[13]和雜交云龍斑(Epinehelusmoara♀×E.lanceolatus♂)[34]的粗脂肪含量介于雙親之間;赤點(diǎn)石斑魚(Epinephelusakaara)與鞍帶石斑魚(E.lanceolatus)雜交子一代[35]高于父本,與母本相當(dāng);雜交鱧(Channaargus♀×C.maculata♂)[36]則顯著高于雙親;黑鯛(Acanthopagrusschlegelii)與真鯛(Pagrusmajor)正反交后代[37]結(jié)果顯示,正交后代高于雙親,而反交后代介于親本之間。以上報(bào)道中雜交后代粗脂肪含量大多表現(xiàn)出中親或超親優(yōu)勢,與本試驗(yàn)結(jié)果存在差異,可能是因?yàn)檫@些雜交子一代均為遠(yuǎn)緣雜交后代,一般情況下后代具有雜種優(yōu)勢,而本試驗(yàn)中牙鲆抗淋巴囊腫系為近交系的雜交后代,由于不同親本間配合力不同,導(dǎo)致后代雜種優(yōu)勢的差異,這需要在后續(xù)的研究中進(jìn)一步探討。

3.2 氨基酸及營養(yǎng)評價(jià)

抗淋巴囊腫系及親本系均含有18種氨基酸,其中以抗淋巴囊腫系含量最高,氨基酸的種類和含量與普通牙鲆[30]、雌核發(fā)育牙鲆[25]以及不同養(yǎng)殖模式的牙鲆[26]相似。

必需氨基酸含量和比例決定了蛋白質(zhì)的營養(yǎng)價(jià)值。根據(jù)聯(lián)合國糧食及農(nóng)業(yè)組織/世界衛(wèi)生組織氨基酸理想模式,必需氨基酸/總氨基酸約為40%、必需氨基酸/非必需氨基酸在60%以上為高質(zhì)量氨基酸[28]。本試驗(yàn)中,3系必需氨基酸/總氨基酸分別為39.75%、40.79%和40.81%,必需氨基酸/非必需氨基酸分別為79.59%、79.56%和86.92%,均符合理想氨基酸模式的要求,氨基酸平衡效果較為合理?？沽馨湍夷[系必需氨基酸含量(2945 mg/g)和必需氨基酸指數(shù)(87.40)均高于親本系,必需氨基酸含量大于聯(lián)合國糧食及農(nóng)業(yè)組織/世界衛(wèi)生組織標(biāo)準(zhǔn)值(2250 mg/g),必需氨基酸指數(shù)分值超過牙鲆已報(bào)道的結(jié)果[24-27,30],表明抗淋巴囊腫系肌肉蛋白質(zhì)品質(zhì)較高。與其他海水魚相比,本試驗(yàn)中的抗淋巴囊腫系牙鲆的必需氨基酸指數(shù)高于大黃魚(62.1～77.9)[12]、紅鰭東方鲀(76.61～77.61)[22]、鮭鱒魚(84.40～86.56)[38]和七帶石斑魚(E.septemfasciatus)(82.38)[39],但低于大菱鲆(98.00)[14]。除必需氨基酸外,鮮味氨基酸含量也是評價(jià)魚肉營養(yǎng)品質(zhì)的重要指標(biāo)之一,主要影響魚肉的鮮味程度,其包含的4種氨基酸分別為天冬氨酸、谷氨酸、丙氨酸和甘氨酸。4種鮮味氨基酸總量抗淋巴囊腫系(7.77%)高于父系(7.29%)和母系(7.42%),但差異不顯著(P<0.05),其中谷氨酸含量(3.12%～3.29%)較高。谷氨酸不僅是鮮味氨基酸,還是腦組織生化代謝中的重要氨基酸,參與多種生理活性物質(zhì)的合成[40]。這說明牙鲆抗淋巴囊腫品系具有較高的營養(yǎng)與保健價(jià)值。以上分析表明,抗淋巴囊腫系作為牙鲆近交系雜交后代,在氨基酸總量、必需氨基酸含量、鮮味氨基酸含量和必需氨基酸指數(shù)上略優(yōu)于親本系。此結(jié)果與小黃魚♀×大黃魚♂雜交子代[13]、褐牙鲆♀×犬齒牙鲆♂雜交子一代[33]、雜交黃顙魚[32]及雜交鱧[36]等研究結(jié)果類似,雜交后代優(yōu)于雙親?，F(xiàn)有研究表明,牙鲆雌核發(fā)育雜交系在生長上具有顯著雜交優(yōu)勢[3],而抗淋巴囊腫系正是由2個雌核發(fā)育系雜交而來,其氨基酸含量和必需氨基酸指數(shù)較高也可能源于雜種優(yōu)勢。

3.3 脂肪酸含量分析

本試驗(yàn)中牙鲆抗淋巴囊腫系及親本系肌肉含有3種飽和脂肪酸、4種單不飽和脂肪酸、5種多不飽和脂肪酸,共計(jì)16種。其脂肪酸數(shù)量雖少于南極冰魚(Channichthysmithridatis)[41],但二者均具有深海冷水魚類特征,多不飽和脂肪酸含量豐富,尤其是二十二碳六烯酸和二十碳五烯酸含量高。而脂肪酸的不飽和度決定了脂肪的質(zhì)量,其中二十二碳六烯酸和二十碳五烯酸屬n-3長鏈高不飽和脂肪酸,屬于人體必需的多不飽和脂肪酸,是營養(yǎng)價(jià)值評價(jià)的重要指標(biāo),可以預(yù)防心腦血管疾病,有助于大腦的發(fā)育[42]。3系的二十二碳六烯酸和二十碳五烯酸含量豐富,均在250 mg/100 g以上,此結(jié)果高于半滑舌鰨[20]、大菱鲆[17,19]、雌核發(fā)育牙鲆和普通牙鲆[25,30]等鲆鰈類,也高于大黃魚[12-13]、河鲀[21]和七帶石斑魚[39]等其他主要海水養(yǎng)殖魚類。

3系脂肪酸種類和含量上,均為母系>父系>抗淋巴囊腫系,尤其是母系多不飽和脂肪酸含量最豐富,其中二十二碳六烯酸含量最高,這與粗脂肪含量結(jié)果相符。而抗淋巴囊腫系不飽和脂肪酸含量均低于雙親,與其他魚類雜交后代的結(jié)果比較不盡相同,如:大黃魚、小黃魚的雜交子一代[13]介于雙親之間;雜交云龍斑[34]和雜交黃顙魚“黃優(yōu)1號”[32]均高于雙親;赤點(diǎn)石斑魚與鞍帶石斑魚雜交子一代[35]與母本相當(dāng),高于父本;而牙鲆(♀)×犬齒牙鲆(♂)雜交子一代[33]與本研究結(jié)果類似,均低于雙親?，F(xiàn)有的關(guān)于魚類雜交后代不飽和脂肪酸含量的結(jié)果表明,雜交后代并不總是表現(xiàn)出雜種優(yōu)勢。導(dǎo)致這些結(jié)果的原因需進(jìn)一步探討,魚類的養(yǎng)殖水溫、餌料等環(huán)境因素均能影響魚類的攝食、生長及代謝,進(jìn)而對魚體脂肪含量及脂肪酸組成造成影響。

4 結(jié) 論

牙鲆抗淋巴囊腫系含有18種氨基酸,含量略高于親本系,氨基酸平衡效果合理,符合人體必需氨基酸需求。同時3系具有較高的脂肪酸營養(yǎng)價(jià)值,其中母系多不飽和脂肪酸,尤其是二十二碳六烯酸+二十碳五烯酸含量最豐富,可作為脂肪酸選育目標(biāo)的候選材料。