劉思嘉,祁得林,祁洪芳,韓步鷹,牛依萌,趙 凱,田 菲

( 1.中國科學院 西北高原生物研究所,青海省動物生態(tài)基因組學重點實驗室,青海 西寧 810008; 2.青海大學,省部共建三江源生態(tài)與高原農牧業(yè)國家重點實驗室,青海 西寧 810016; 3.青海湖裸鯉救護中心,青海湖裸鯉繁育與保護重點實驗室,青海 西寧 810016 )

青海湖裸鯉(Gymnocyprisprzewalskiiprzewalskii)屬鯉科裂腹魚亞科裸鯉屬,僅分布于青海湖流域,是我國特有的珍稀高原魚類。青海湖裸鯉的物種形成與青藏高原的抬升密切相關[1],在長期的適應進化中,能夠很好地適應該地區(qū)嚴寒、低氧、高鹽堿、強紫外線等極端自然條件,無疑是一種研究生物耐逆的理想模型[2]。已有研究表明,青海湖裸鯉在高鹽環(huán)境下通過改變鰓和腎臟的組織形態(tài)進行滲透和離子調節(jié),維持機體滲透壓穩(wěn)態(tài)[3];通過提高肝胰臟、腎臟組織中超氧化物歧化酶基因、酸性磷酸酶基因和堿性磷酸酶基因表達水平,來適應高堿度環(huán)境[4]。由于青海湖裸鯉極端環(huán)境適應的機制十分復雜,其背后的分子機制需要進一步研究。解析青海湖裸鯉極端環(huán)境適應過程中關鍵基因的表達變化,是探究青海湖裸鯉抗逆分子機制的前提。

實時熒光定量PCR(qRT-PCR),是將聚合酶鏈式反應與熒光信號檢測結合,對DNA或cDNA模板進行定量檢測,從而對靶基因在某組織、時間轉錄豐度或基因拷貝數(shù)定量的方法[5]。在魚類研究中,qRT-PCR常用于魚類基因功能研究[6],如抗逆分子機理研究[7]、魚類病理學[8]、病原學檢測[9]、免疫應答[10]、環(huán)境毒理學[11]及代謝通路調控[12]等方面。除了斑馬魚(Daniorerio)[13]、青鳉(Oryziaslatipes)[14]等模式生物外,qRT-PCR技術也廣泛應用于多種經濟魚類和野生魚類的研究中,如鯉(Cyprinuscarpio)、異育銀鯽(Carassiusauratusgibelio)[15]、非洲麗魚(Astatotilapiaburtoni)[16]等。

在qRT-PCR中,最常用的方法是利用一個已知的、表達穩(wěn)定的基因來校正目標基因的Ct值,用于校正數(shù)據(jù)的基因稱作內參基因或管家基因(HKGs)[17]。內參基因是矯正基因表達的必要參照,篩選合適的內參基因能夠減少試驗誤差,提高結果可靠性。常用的內參基因主要包括肌動蛋白β(Act-β)基因[18-19]、3-磷酸甘油醛脫氫酶(Gapdh)基因[19]、真核生物延伸因子(Ef-1α)基因[20-21]、核糖體蛋白L13(Rpl13)基因[22]、琥珀酸脫氫酶亞基A(Sdha)基因[23]、次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶1(HPRT1)基因[24]等,這些常用的內參基因,或參與細胞的基本代謝,或作為細胞的組成成分,在不同器官、組織中的表達較穩(wěn)定。然而,沒有一個基因能在所有條件下的表達量恒定不變,因此,對于不同的物種、組織、細胞及試驗處理選擇合適的內參基因是十分必要的[18-26]。筆者基于青海湖裸鯉多組織RNA-seq數(shù)據(jù),篩選表達穩(wěn)定的候選內參基因,并利用GeNorm、NormFinder和BestKepper 3個程序評估上述基因在0 ℃和17 ℃時,腦、肝胰臟和肌肉組織中qRT-PCR檢測結果的穩(wěn)定性,篩選出適于青海湖裸鯉qRT-PCR分析的內參基因,并驗證其校正目標基因表達量的可靠性,以期為高原魚類極端環(huán)境適應的研究提供內參基因。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗魚來自青海省裸鯉救護中心。選擇體質量(8.5±1.2) g、體長(10.3±2.6) cm的青海湖裸鯉120日齡的幼魚為試驗對象,每組18尾,隨機分成低溫組和對照組,各組處理設3個平行。對照組溫度為17 ℃恒溫,低溫組在17 ℃恒溫飼養(yǎng)7 d后,以0.5 ℃/h速度降溫至0 ℃,并恒溫在0 ℃飼養(yǎng)15 d,其間除了溫度差異,飼養(yǎng)密度、氧氣供給、飼喂、水體循環(huán)過濾、光照節(jié)律等均與對照組一致。處理15 d后,麻醉處理(間氨基苯甲酸乙酯甲磺酸鹽),取腦、肝胰臟、肌肉等組織。將所取組織置于凍存管中,液氮中速凍后-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

1.2.1 候選內參基因挖掘

利用本課題組未發(fā)表的青海湖裸鯉多組織低溫適應的RNA-seq定量數(shù)據(jù),篩選出最符合內參基因標準的基因。理想的內參基因,應該具備以下2個基本條件:(1)在目標組織、細胞中穩(wěn)定表達;(2)具有高于背景的表達水平[27]。因此,篩選條件為:目標基因在各溫度處理、各組織間的FPKM值(每1 000 000單位比對片段中,比對到目的基因1000堿基單位的片段數(shù))>1,組內變異系數(shù)<0.2。符合標準的基因利用R語言中NormFinder軟件包(https://www.moma.dk/files/r.NormOldStab5.txt)進行進一步篩選,參數(shù)設置如下:Groups=TRUE,ctVal=FALSE,pStabLim=0.25。

1.2.2 總RNA提取

剪取約50 mg凍存組織樣,放入無RNase的2 mL離心管中,加入鋼珠和800 μL組織裂解液(Trizol),在高通道組織勻漿機中以40 Hz、180 s勻漿,4 ℃、12 000 r/min (離心半徑 6.5 cm)離心2 min,保留上清液進行總RNA提取試驗。總RNA提取按照康為世紀Ultrapure RNA Kit (DNase I)(貨號CW0597S)說明書進行操作。

1.2.3 總RNA 的檢測

利用超微量核酸蛋白測定儀Nano drop和1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA 樣品質量和完整性。測定總RNA的濃度和純度;電泳檢測若28S、18S條帶清晰,則表明總RNA完整性較好,無DNA及蛋白污染,可作為反轉錄模板。

1.2.4 反轉錄cDNA

反轉錄使用北京全式金生物技術有限公司的EasyScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix 反轉錄試劑盒。20 μL反轉錄體系,各組分如下:隨機引物(10 μmol/L) 1 μL,總RNA 5 μL,2×ES Reaction Mix 10 μL,EasyScript?RT/RI Enzyme 1 μL,gDNA酶1 μL,最后用無RNA酶ddH2O將體系補充至20 μL。42 ℃水浴孵育1 h,合成第一鏈cDNA,95 ℃滅活逆轉錄酶3 min,然后12 000 r/min (離心半徑 6.5 cm)離心1 min,用5倍體積去離子水稀釋后,進行后續(xù)qRT-PCR反應。

1.2.5 內參基因的選擇和引物設計

對Abhd18、Actb、B2m、Bad、Dazap2、Eloa、Fabp3和Gapdh共8個候選基因進行qRT-PCR驗證。根據(jù)青海湖裸鯉基因庫(未發(fā)表),利用Primer Premier 6.0軟件對上述候選基因進行引物設計,標準如下:引物Tm(55±5) ℃,堿基長度18～22 bp,GC 含量為40%～60%。擴增產物長度100～200 bp,引物信息見表1。另外,為探討低溫下青海湖裸鯉的脂類代謝變化,對Acsl1、Cpt1a、Elovl1和Slc27a4等關鍵基因的表達豐度進行檢測。

表1 基因引物序列Tab.1 Primers used in this study

1.2.6 qRT-PCR

本試驗采用SYBR Green I法qRT-PCR(相對定量)進行mRNA表達量分析;定量PCR試劑盒為:北京全式金TransStart Green qPCR SuperMix;檢測機器為LightCycler96 RealTime PCR儀(Roche,瑞士)。20 μL反應體系優(yōu)化如下:2×SYBR Premix EX-Taq Mix 10 μL,QF (10 μmol/L) 0.5 μL,QR (10 μmol/L) 0.5 μL,模板cDNA 2 μL,無RNA酶dH2O 7 μL。每個基因均設3個平行孔。優(yōu)化后的反應條件如下:95 ℃預變性1 min;95 ℃變性5 s ,61 ℃退火35 s,40個循環(huán)。延伸階段收集熒光信號,反應結束后,97 ℃ 1 min獲得熔解曲線。

1.2.7 數(shù)據(jù)分析

基因相對表達量分析數(shù)據(jù)處理采用2-△△Ct法處理[28],處理軟件利用R語言ddCt包完成。分別采用R語言中NormqPCR軟件包[29]、Normfinder軟件包及endoGenes.R (https://github.com/hanielcedraz/endoGenes) 腳本文件完成GeNorm、Normfinder及BestKeeper等3種方法對候選內參基因的表達穩(wěn)定性進行分析。采用獨立性t檢驗對兩組間的相對表達量做顯著性檢驗,P<0.05為差異顯著,P<0.01為差異極顯著。統(tǒng)計作圖由R語言ggplot2軟件包(https://cran.rproject.org/web/packages/ggplot2/index.html)完成。

2 結 果

2.1 內參基因篩選

根據(jù)多組織(腦、鰓、心、腎臟、腸道、肝胰臟、肌肉、皮膚等8個組織)RNA-seq的基因定量結果,在青海湖裸鯉所有表達的編碼基因中進行候選內參基因篩選。參考文獻[27]的方法,選擇各組織中平均log(FPKM)>1,組內FPKM值變異系數(shù)<0.2的基因。結果共獲得7個候選內參基因,分別是脫水酶(Abhd18)基因、肌動蛋白(Actb)基因、微球蛋白(B2m)基因、延伸蛋白A(Eloa)基因、DAZ相關蛋白(Dazap2)基因、BCL細胞死亡激動因子(Bad)基因和脂肪酸結合蛋白3(Fabp3)基因,各基因在各組織中的RNA-seq表達定量結果見圖1。在候選內參基因中,B2m和Actb基因也是其他魚類常用的內參基因,而Fabp3基因在心臟中高表達,在其他組織中表達量較穩(wěn)定,因此選作候選內參基因擬驗證其在腦、肝胰臟和肌肉組織中的表達穩(wěn)定性;甘油醛-3-磷酸脫氫酶(Gapdh)基因是魚類最常用內參基因,但因其在組內的變異系數(shù)為0.23,大于0.2,未達到本試驗中篩選內參基因的標準。但是,考慮到Gapdh基因作為內參基因應用的廣泛性,同時,為了更好地比較分析內參基因對定量結果的影響,筆者也把Gapdh基因作為候選內參基因。因此最終確定8個候選內參基因,進行下游分析。利用NormFinder方法對候選基因按表達穩(wěn)定值排序,表達穩(wěn)定值排序見表2,數(shù)值越小則表達穩(wěn)定性越高。

圖1 候選基因表達量熱圖Fig.1 Heatmap of expression level of candidate genes

表2 利用NormFinder方法基于RNA-seq定量結果分析候選基因表達穩(wěn)定性Tab.2 Stability analysis of candidate genes based on RNA-seq by NormFinder

2.2 RNA質量檢測

利用Nano drop測定總RNA的質量濃度均在150 ng/μL以上,純度D(260 nm)/D(280 nm)及D(260 nm)/D(230 nm)均在2.1～2.0;隨機選取5個RNA樣品進行核酸瓊脂糖凝膠電泳檢測,結果顯示,總RNA完整性較好,28S、18S條帶清晰,無明顯的DNA及蛋白污染,可作為反轉錄模板(圖2)。

圖2 總RNA電泳Fig.2 The agarose gel electrophoresis of total RNAM.標準分子量; 1.0 ℃腦; 2.17 ℃腦; 3.0 ℃肝胰臟; 4.17 ℃肝胰臟; 5.17 ℃肌肉.M.marker; 1.brain at 0 ℃; 2.brain at 17 ℃; 3.hepatopancreas at 0 ℃; 4.hepatopancreas at 17 ℃; 5.muscle at 17 ℃.

2.3 內參基因引物特異性驗證

對設計引物的特異性進行驗證,結果見圖3。由圖3可見,各基因的擴增片段熔解曲線呈單一峰,表明引物特異性良好,可用于定量PCR分析。

圖3 候選內參基因熔解曲線Fig.3 Melting curves of candidate genes

基因的表達豐度用Ct值表示,其數(shù)值越高,則表達量越低。理想的內參基因Ct值應大于10,且趨近于20。對青海湖裸鯉不同溫度處理下,各候選內參基因的表達豐度統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)(圖4),8個基因在腦、肝胰臟及肌肉組織中的表達水平存在一定變化,其中B2m和Bad基因的表達豐度相對較高,而Abhd18和Gapdh基因表達豐度較低;Fabp3和Gapdh基因在不同溫度下組織間的表達量差異較大,B2m和Eloa基因在不同溫度下組織間的表達量差異較小。

圖4 候選基因Ct值Fig.4 Ct values of candidate genes

2.4 內參基因穩(wěn)定性分析

為篩選在不同溫度和組織間均能穩(wěn)定表達的內參基因,筆者利用GeNorm、Normfinder和BestKeeper方法對青海湖裸鯉在0、17 ℃條件下腦、肝胰臟及肌肉組織內8個候選內參基因的穩(wěn)定性進行分析。

2.4.1 GeNorm分析結果

GeNorm是由Vandesompele等編寫的專門用于確定qRT-PCR分析中,篩選最適內參基因的程序,該方法已被引入R語言NormqPCR包[29]。GeNorm通過計算每個內參基因穩(wěn)定性的M值來選擇穩(wěn)定的內參基因。標準是M值越小,內參基因的穩(wěn)定性越好,反之,內參基因的穩(wěn)定性越差。分析結果顯示,8個候選內參基因在青海湖裸鯉不同溫度、不同組織間表達穩(wěn)定性排序,由高到底依次是:B2m、Eloa、Bad、Dazap2、Actb、Abhd18、Gapdh、Fabp3(圖 5)。

圖5 GeNorm方法分析候選基因穩(wěn)定值排序Fig.5 Stability value sort of candidate genes by GeNorm

GeNorm通過計算引入新的內參基因后標準化因子的配對變異V值,并根據(jù)(Vn/Vn+1)值確定最優(yōu)內參基因的數(shù)目,以減少使用單一內參基因所引起的偏差。當Vn/Vn+1<0.15時,最優(yōu)內參基因數(shù)為n;如果Vn/Vn+1>0.15,則最優(yōu)內參基因數(shù)為n+1。由圖6可知,V2/V3對應變異系數(shù)最高且大于0.15,因此確定最合適的內參組合基因數(shù)目是3個(圖6)。

圖6 GeNorm方法檢測最適內參基因數(shù)目Fig.6 Optimal reference gene analysis by GeNorm

2.4.2 NormFinder 分析結果

NormFinder是Claus等在2004年編寫的用于篩選內參基因的一種程序,該程序計算原理與GeNorm程序相似,也是根據(jù)表達穩(wěn)定值篩選最適內參基因,判定標準為表達穩(wěn)定值最小的基因為最適內參基因[17]。分析結果顯示,B2m基因表達最穩(wěn)定,而Fabp3基因最不穩(wěn)定(圖7)。與GeNorm方法得出的結果相似的是,B2m都是表達最穩(wěn)定的最適內參基因,而Fabp3基因表達最不穩(wěn)定。

圖7 NormFinder方法對候選基因表達穩(wěn)定值排序Fig.7 Stability value sort of candidate genes by NormFinder

2.4.3 BestKeeper分析結果

BestKeeper是Michael等編寫的針對內參基因和目標基因表達量分析的程序,該程序通過計算基因間相關系數(shù)、標準差和變異系數(shù),再比較各值的大小,最終確定最適內參基因[30]。判定原則為相關系數(shù)越大、標準偏差和變異系數(shù)越小,內參基因穩(wěn)定性越好,反之,穩(wěn)定性越差;當標準差>1時,則該內參基因表達不穩(wěn)定。分析結果(表3)顯示,只有B2m、Eloa基因的標準差小于1,且變異系數(shù)最小,分別為2.109、2.555,相關系數(shù)均大于0.85,綜合得出B2m和Eloa基因表達最穩(wěn)定,最適宜作青海湖裸鯉低溫脅迫的內參基因,而Fabp3基因在8個候選基因中表達穩(wěn)定性最差,不宜選為內參基因。

表3 NormFinder方法分析候選基因表達穩(wěn)定性Tab.3 Stability analysis of candidate gene by NormFinder

2.5 相對表達量分析結果

綜合GeNorm、NormFinder、BestKeeper 3種方法分析的結果,可確定B2m是青海湖裸鯉低溫適應過程中多組織轉錄定量的最適內參基因。為了進一步比較分析內參基因在相對定量分析中的可靠性,利用R語言ddCt包,分別以8個候選內參基因中的1個作內參基因,對其余7個基因在不同溫度和不同組織間的表達情況進行相對定量。根據(jù)相對定量結果,比較各基因在青海湖裸鯉0 ℃和17 ℃處理后各組織中的表達差異倍數(shù),并與轉錄組數(shù)據(jù)進行相關性分析。分析結果顯示,以Eloa、B2m做內參基因時,各基因qRT-PCR相對定量的結果的相關性最高,r2分別達到0.95及0.89,表明以Eloa、B2m為內參基因的相對定量結果更可靠,可信度更高(圖8)。同時,Eloa、B2m也是GeNorm及BestKeeper方法共同分析獲得的最適內參基因。

2.6 低溫適應相關基因qRT-PCR分析

根據(jù)多種方法最終篩選獲得在不同組織中表達最穩(wěn)定的基因為Eloa和B2m,以上述2個基因作為內參基因,對青海湖裸鯉幼魚低溫適應脂肪酸代謝途徑中的關鍵基因長鏈脂酰輔酶A合成酶(Acsl1)、肉堿棕櫚酰轉移酶1a(Cpt1a)、超長鏈脂肪酸延伸酶(Elovl1)和溶質載體蛋白27a4(Slc27a4)在不同溫度下腦、肝胰臟和肌肉組織中的表達量進行qRT-PCR分析。結果表明,以Eloa和B2m作為雙內參基因進行2-△△Ct法相對定量分析,4個目標基因在低溫條件下肝胰臟和肌肉組織中的表達量均顯著上調(P<0.01),在肝胰臟中的表達量最高;在腦組織中Acsl1a基因在低溫條件下顯著上調(P<0.01),Cpt1a、Elovl1和Slc27a4基因表達量無顯著差異(P>0.05)(圖9a)。4個目標基因在低溫(0 ℃)與適溫(17 ℃)的相對表達比值與RNAseq的差異表達倍數(shù)的相關性較高,r2均大于0.87(圖9b)。

3 討 論

3.1 候選內參基因的穩(wěn)定性分析

qRT-PCR技術因其靈敏、高效、精確、廉價的特點,是研究基因表達豐度最常用的方法,已廣泛應用于動植物基因功能的研究中。但是,在試驗過程中的誤差會影響定量結果的準確性,因此,需要一個或多個已知的表達穩(wěn)定的基因來校正試驗誤差。水生生物常用的內參基因包括:Act-β[18]、Gapdh[19]、Ef-1α[20-21]、Rpl13[22]、Sdha[23]、HPRT1[24]和18S rRNA[21]等。在功能上,內參基因多參與機體的基礎代謝或是細胞結構的基礎組成成分,例如Act-β基因編碼的肌動蛋白是構成細胞骨架的主要蛋白之一[18],Rpl13基因編碼的核糖體蛋白以及18S rRNA基因編碼核糖體小亞基RNA[22,25]是構成細胞內核糖體的主要成分之一,Gapdh基因編碼的甘油酸-3-磷酸脫氫酶是參與糖酵解活動的關鍵酶[19],Ef-1α基因編碼的延伸因子參與調控蛋白質的翻譯、折疊[20],Sdha基因編碼的琥珀酸脫氫酶亞基A是線粒體內膜的結合酶,能夠調控線粒體的氧化磷酸化和呼吸鏈的電子傳遞過程[23],HPRT1基因編碼次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶1能夠調控細胞內嘌呤核苷酸的合成[24]。然而,基因的表達調控是一個復雜的過程,沒有一個基因的表達水平能夠在不同物種、器官、組織、細胞,或在不同時間、發(fā)育階段、生理狀態(tài)、病理過程,或在不同環(huán)境和試驗處理下保持恒定。Casadei等[18]在對斑馬魚不同發(fā)育時期和不同組織的多個候選內參基因的表達穩(wěn)定性進行分析時發(fā)現(xiàn),bactin2和Ef-1-α在不同發(fā)育時期和不同組織中的表達穩(wěn)定性最高;孫海成等[22]利用實時熒光定量PCR技術比較了尖裸鯉(Oxygymnocyprisstewartii)7個候選內參基因在多個健康組織中的表達量,結果發(fā)現(xiàn),Rpl13在不同組織中的表達較為穩(wěn)定;費越越等[15]對不同處理條件下異育銀鯽組織和尾鰭細胞的4個候選內參基因的表達穩(wěn)定性進行分析,發(fā)現(xiàn)Act-β和Ef-1α基因在健康異育銀鯽的多組織中表達較為穩(wěn)定,而在鯉皰疹病毒Ⅱ型感染條件下,Act-β基因在腎臟和尾鰭細胞中的表達最為穩(wěn)定,Ef-1α基因在脾臟中的表達最為穩(wěn)定。

為挖掘適用于青海湖裸鯉低溫適應過程中表達穩(wěn)定的內參基因,筆者以青海湖裸鯉不同溫度處理的多組織RNA-seq數(shù)據(jù)為依據(jù),篩選得到8個表達穩(wěn)定的候選內參基因Abhd18、Actb、B2m、Bad、Eloa、Dazap2、Fabp3、Gapdh。其中Actb、B2m和Gapdh基因是水生生物常用的內參基因。通過qRT-PCR對其在不同溫度條件下,青海湖裸鯉腦、肝胰臟和肌肉組織的表達豐度進行檢測。利用Genorm、Normfinder和BestKeeper 3種方法對上述8個候選基因在青海湖裸鯉中的表達穩(wěn)定性進行分析。根據(jù)各軟件評價標準[17,24-29],綜合3個軟件分析的結果,最終篩選出最符合要求的內參基因。3個軟件的分析結果表明,在青海湖裸鯉幼魚不同溫度適應下腦、肝胰臟、肌肉組織中表達最穩(wěn)定的基因是B2m和Eloa基因,3種方法分析結果均顯示,Fabp3基因的穩(wěn)定性較差,說明該基因不適合作為青海湖裸鯉的內參基因。微球蛋白-β2(B2m)是由淋巴細胞、血小板、多形核白細胞產生的一種小分子球蛋白,生理狀態(tài)下B2m在多種細胞內的含量很穩(wěn)定,其編碼基因B2m是qRT-PCR分子中常用的內參之一,在鱖(Sinipercachuatsi)[31]、花鱸(Lateolabraxmaculatus)[32]等魚類的分子生物學研究中被用作qRT-PCR分析的內參基因。轉錄延伸蛋白A(Eloa),是一種轉錄因子,具有多種生物學活性,廣泛存在于多種細胞核基因內[33],目前尚無關于Eloa基因作為內參基因的報道。筆者發(fā)現(xiàn),Eloa基因在青海湖裸鯉不同組織和不同溫度處理下的表達量均較穩(wěn)定,是潛在的新的候選內參基因。另外,Gapdh基因也是動植物常用的內參基因[18],然而在本試驗中,通過對RNA-seq數(shù)據(jù)的篩選及qRT-PCR試驗驗證,Gapdh基因在青海湖裸鯉幼魚不同的組織和溫度脅迫下的表達差異較大,對低溫較為敏感。

3.2 低溫對內參基因表達的影響

魚類是變溫動物,由于缺乏體溫調控能力,其生存對環(huán)境溫度的依賴極高。不同于其他環(huán)境因素,溫度對魚類生理活動的影響是廣泛的[34]。由已有的研究報道可知,溫度能顯著影響魚類多組織、多基因的轉錄活動[7,35-37]。筆者通過分析青海湖裸鯉對低溫響應的RNA-seq數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn):在其他魚類研究中常用的內參基因,如Ef-1[20-21]、Rpl13[22]、Sdha[23]、HPRT1[24]基因等,在青海湖裸鯉幼魚0 ℃低溫條件下的多組織中的表達量降低,不同溫度間(17 ℃和0 ℃)或不同組織間的變異系數(shù)>0.2,不能滿足內參基因的篩選標準;而Bad、Eloa、Dazap2等基因的表達豐度受溫度影響較小,是潛在的候選內參基因。Long等[38]在鯉對低溫脅迫下腦、心肌等組織的分子響應中發(fā)現(xiàn),Ef-1基因在不同溫度及不同組織間的表達量較為穩(wěn)定,可作為內參基因;而徐麗華等[7]在研究鯉腦組織低溫差異表達候選基因時,選擇了18S rRNA基因作內參基因。上述關于魚類低溫適應的分子研究篩選的內參基因與本試驗有所差異,可能的原因是,雖然青海湖裸鯉和鯉都屬鯉科魚類,但二者對低溫環(huán)境的耐受能力不同,對低溫脅迫的分子響應機制有差異,同源基因的表達模式具有物種特異性。

除了內參基因的表達活動受到溫度的影響外,耐低溫魚類參與脂類代謝過程的基因也普遍受到低溫脅迫的調控。例如:在低溫條件下,鯉腦組織中的脂肪酸鏈延伸蛋白、?；o酶A脫氫酶、肌醇-1-磷酸合成酶等基因的表達水平顯著上調[7];鯉心臟中Acsl1b、Acsl4a、Elovl5以及PPAR信號通路基因表達顯著上調[38]。本試驗中,對參與脂肪酸代謝過程中的Acsl1、Cpt1a、Elovl1和Slc27a4等4個關鍵基因表達量進行分析,上述基因在0 ℃時肝胰臟和肌肉組織表達量均顯著上調,其結果與徐麗華等[7,38]對鯉的研究一致。Acsl1、Cpt1a、Elovl1和Slc27a4基因分別是參與長鏈脂肪酸活化、脂肪酸轉運、脂肪酸鏈延伸和脂肪酸β氧化過程的關鍵基因,其在低溫環(huán)境下的高表達模式表明青海湖裸鯉幼魚在低溫環(huán)境下脂肪酸的代謝活動增強。脂肪酸是魚類主要能源物質和膜結構組分,耐寒魚類在低溫環(huán)境下通過提高脂肪酸氧化獲能應對低溫下的能量消耗[36];并且通過改變細胞膜組分、增加磷脂不飽和脂肪酸含量,以改善膜流動性及僵化,避免細胞組織受到低溫損害[7]。青海湖裸鯉的物種形成與青藏高原海拔的抬升、青海湖的形成密切相關[2],隨著棲息地海拔的升高、溫度逐漸降低,青海湖裸鯉也演化出復雜的耐低溫機制以應對高寒的氣候條件。已有研究表明,青海湖裸鯉多種能量代謝相關基因發(fā)生了大規(guī)模擴張事件[39],這也暗示著青海湖裸鯉可能進化出特殊的能量代謝過程以應對低溫環(huán)境對能量的需求。

另外,本試驗中使用的3種方法均已編譯成R語言中的軟件包或腳本文件,而相似的研究大多采用的是Excel中相應的3種分析插件。相比于后者,R語言的數(shù)據(jù)處理能力更強,更適用于處理RNA-seq等體量較大的數(shù)據(jù);且R語言軟件包均為開源程序,調用更靈活、高效,適于批量自動化的分析工作,具有更廣泛的應用前景。

4 結 論

筆者基于GeNorm、NormFinder、BestKeeper 3種方法評估了Abhd18、Actb、B2m、Bad、Eloa、Dazap2、Fabp3和Gapdh共8個候選內參基因在青海湖裸鯉低溫脅迫下多個組織中的表達穩(wěn)定性,篩選并驗證得到2個最適內參基因B2m和Eloa。以B2m和Eloa作為雙內參基因對青海湖裸鯉脂類代謝調控基因Acsl1、Cpt1a、Elovl1和Slc27a4在不同溫度下腦、肝胰臟和肌肉組織中的表達量進行qRT-PCR分析,結果顯示,4個目標基因低溫與適溫的相對表達比值與RNAseq的差異表達倍數(shù)高度正相關,說明qRT-PCR定量結果可靠。試驗結果可為高原魚類耐逆分子生物學的研究及內參基因的選擇提供科學依據(jù)。