汪 鵬, 仇建南, 王忠夏, 吳俊華, 江春平

1 南京大學醫(yī)學院附屬鼓樓醫(yī)院肝膽胰中心, 南京 210008; 2 南京大學醫(yī)學院, 南京 210093

肝細胞癌 (HCC) 大約占所有原發(fā)性肝癌類型的90%以上,同時也是全球癌癥相關(guān)死亡的第三大癌種。70%～80%的肝癌患者早期臨床癥狀不明顯,加上肝癌早期篩查的不足,一些患者確診時已是晚期而錯失最佳的手術(shù)機會[1]。盡管肝動脈化療栓塞手術(shù)、索拉非尼等分子靶向藥物、以及PD-1/PD-L1抗體等免疫檢查點抑制劑能夠一定程度延緩腫瘤進展,延長患者生存時間,但其效果仍然有限。另外,臨床試驗的數(shù)據(jù)顯示,單獨使用PD-1單抗治療肝癌患者并不能顯著改善病情,而且免疫靶向的藥物在治療肝癌伴有非酒精性脂肪性肝炎患者時,效果會明顯下降,這一方面是由于原發(fā)性或獲得性抗PD-1抵抗導致,另一方面與腫瘤微環(huán)境中免疫細胞功能改變有關(guān)[2-4]。

腫瘤相關(guān)巨噬細胞(tumor associated macrophages, TAM)是存在于各類腫瘤微環(huán)境中的一群巨噬細胞,主要維持慢性炎癥及免疫耐受微環(huán)境并且促進腫瘤生長[5],可因微環(huán)境的改變而發(fā)生功能改變。TAM作為肝癌腫瘤微環(huán)境中的重要組分,在腫瘤免疫逃避中發(fā)揮著不可或缺的作用,并且與獲得性抗PD-1治療抵抗有關(guān)。本文總結(jié)TAM在肝癌發(fā)生發(fā)展過程中的作用,并對TAM對肝癌免疫微環(huán)境的影響以及最新的靶向TAM的治療手段進行綜述,為肝癌免疫治療發(fā)展提供一些新思路。

1 肝內(nèi)正常的巨噬細胞

肝臟是人體最大的實體器官,同時也是免疫豁免器官,是人體中組織駐留巨噬細胞含量最豐富的器官之一。肝內(nèi)巨噬細胞在肝臟免疫豁免中發(fā)揮關(guān)鍵作用。正常情況下,肝臟巨噬細胞大體分為兩群,一群是定居于肝內(nèi)并能增殖和自我更新,主要來源于胎兒肝臟中卵黃囊衍生的紅細胞髓系祖細胞, 即常說的Kupffer細胞,約占肝內(nèi)總巨噬細胞數(shù)的80%左右;另一群是來自循環(huán)的單核細胞,這些單核細胞是由骨髓定居的造血干細胞分化而來,經(jīng)過血液循環(huán)到達肝臟。在非疾病狀態(tài)下,這些巨噬細胞可以分泌IL-10和PD-L1分子促進肝臟形成免疫耐受狀態(tài)而維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定。肝內(nèi)巨噬細胞可分化成促炎性的M1型和抗炎的M2型巨噬細胞,兩種類型的巨噬細胞所分泌的效應因子有差異,發(fā)揮的功能也不同,在肝臟微環(huán)境中,兩種類型的巨噬細胞的比例保持著微妙的平衡,共同維持肝臟內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定。在炎癥性疾病的早期階段,Kupffer細胞招募中性粒細胞和外周單核細胞進入肝臟損傷部位,促進炎癥發(fā)展和纖維溶解,這一階段M1型巨噬細胞占據(jù)主導地位;隨著疾病進展,巨噬細胞轉(zhuǎn)為M2型,發(fā)揮免疫抑制和纖維形成作用,炎癥也逐漸由急性轉(zhuǎn)為慢性[6]。

2 腫瘤相關(guān)巨噬細胞(TAM)

TAM是一群浸潤或鄰近腫瘤組織的巨噬細胞,在腫瘤免疫微環(huán)境中含量豐富,可占到實體瘤免疫細胞群體的50%以上。多數(shù)報道認為,存在于腫瘤微環(huán)境的巨噬細胞就屬于TAM, 因此肝癌中的TAM來源除了骨髓來源的單核細胞,還有一部分的Kupffer細胞。早期研究認為Kupffer細胞在肝癌免疫微環(huán)境中的作用僅僅是參與抗腫瘤免疫,但后期也有研究證據(jù)顯示Kupffer細胞是TAM群體的一部分并且促進腫瘤進展[7]。對肝癌組織進行免疫熒光染色發(fā)現(xiàn),TAM主要聚集在癌組織周圍而非癌中心位置,并且其糖酵解水平增高[8]。TAM可通過直接吞噬作用或分泌細胞因子等方式發(fā)揮調(diào)節(jié)功能。TAM可根據(jù)具體的功能可分M1樣和M2樣細胞,這兩種不同的極化狀態(tài)分泌的效應因子不同。M1樣TAM主要產(chǎn)生一型的促進炎癥的細胞因子,如 IL-1β、IL-1α、IL-12、TNF-α和GFAP, 起著促進適應性免疫和抗腫瘤作用。而M2樣TAM主要分泌二型細胞因子,如TGF-β、IL-10、CCL17等,并且PD-L1表達水平升高, 發(fā)揮著抗炎作用從而促進腫瘤的發(fā)展[9-10]。一般認為,在腫瘤發(fā)生的初期,TAM能夠識別并清除腫瘤細胞,抑制腫瘤的形成;但隨著腫瘤的發(fā)展,TAM對腫瘤細胞的生長、侵襲和腫瘤免疫逃逸狀態(tài)的維持起促進作用。

3 TAM在腫瘤中的作用

3.1 TAM促進肝癌內(nèi)血管形成 肝癌腫瘤為了更好地提供充足的營養(yǎng)給腫瘤細胞,會形成大量的微血管。臨床數(shù)據(jù)[11]顯示,腫瘤組織中的微血管密度與TAM的數(shù)目呈現(xiàn)相關(guān)性,提示TAM可以促進肝癌組織血管生成。進一步研究表明TAM可分泌VEGF-A、EGF、PIGF、 TGF-β、TNF-α、IL-1β、IL-8、CCL2、IL-1、IL-6、CXCL8和 CXCL12等促血管生成細胞因子,促進腫瘤組織形成血管。另外,TAM還能產(chǎn)生血管生成調(diào)節(jié)酶如環(huán)氧合酶-2(cyclooxygenase-2, COX-2)和基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase, MMP)進一步調(diào)節(jié)腫瘤內(nèi)微血管的形成[12-15]。低氧環(huán)境會誘導血管生成增多,在低氧誘導的血管生成過程中,HIF-1a通路至關(guān)重要。同時TAM中的HIF-1a激活也促進血管的生成。巨噬細胞傾向于低氧區(qū)域通過HIF-1a途徑促進其產(chǎn)生VEGF-A、CCL2、CCL5、IL-8 (CXCL8)、CXCL10、CXCL12和CXCL13等,這些細胞因子可促進腫瘤內(nèi)血管生成。在腫瘤微環(huán)境中,還存在一些表達TIE2的TAM,其與腫瘤內(nèi)微血管密度存在相關(guān)性,通過分泌促血管生成因子影響腫瘤血管再生[16]。除了TIE2+TAM, 以CCR2+為標志的一群TAM在肝癌血管生成中也有促進作用,研究發(fā)現(xiàn)CCR2+TAM分布在腫瘤血管豐富的邊界區(qū)域,通過RNA-seq分析CCR2+TAM發(fā)現(xiàn)這一群細胞內(nèi)促炎與促血管生成的相關(guān)信號通路明顯增多,并且靶向CCR2+TAM可抑制肝癌血管的形成[17]。肝癌細胞內(nèi)YAP/TEAD4通路促使CCL2表達增多,招募更多的巨噬細胞,但這群細胞未成熟,且高表達CCR2、Cx3cr1以及促血管生成血小板源性生長因子。這群M0型巨噬細胞與肝癌的血管形成呈相關(guān)性并與疾病的不良預后密不可分[18]。這些結(jié)果均表明,TAM在肝癌微環(huán)境中,對血管形成過程進行調(diào)控,促進腫瘤進展,此外,這些研究也表明肝癌微環(huán)境中TAM具有異質(zhì)性,發(fā)揮的功能特性在不同的時空位置是不同的。

3.2 TAM促進肝癌侵襲轉(zhuǎn)移 轉(zhuǎn)移灶的出現(xiàn)是肝癌手術(shù)切除療效差的重要因素之一,肝癌侵襲轉(zhuǎn)移的發(fā)生與多種機制相關(guān);研究表明TAM能增強肝癌的侵襲和轉(zhuǎn)移能力。臨床數(shù)據(jù)顯示,TAM的增多與腫瘤體積、血管侵襲、腫瘤數(shù)目和分期呈現(xiàn)正相關(guān),TAM的密度與患者的長期總體生存率和無病生存期負相關(guān)[19-20]。TAM對腫瘤侵襲性的調(diào)控可通過其調(diào)節(jié)基質(zhì)環(huán)境的能力實現(xiàn),巨噬細胞是組織蛋白酶、MMP和絲氨酸蛋白酶的主要來源之一,可有效調(diào)節(jié)細胞外基質(zhì)環(huán)境。研究發(fā)現(xiàn)MMP9+TAM可通過降解細胞外基質(zhì)促進肝癌細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移[21]。除了改變腫瘤組織中細胞外基質(zhì)和基底膜的組成,TAM還能促進腫瘤細胞發(fā)生上皮間充質(zhì)細胞轉(zhuǎn)變(epithelial-mesenchymal transition, EMT),增強腫瘤細胞自身遷移侵襲能力,促進肝癌轉(zhuǎn)移。TAM分泌的IL-6、IL-8、TNF-α、TGF-β、EGF、VEGF、MMP-2和 MMP-9均可促進腫瘤細胞發(fā)生EMT[22]。另外,TAM來源的CCL22可激活腫瘤細胞內(nèi)Snail信號,使其發(fā)生EMT[23]。另一項研究[24]顯示,壞死小體誘導TAM分泌的IL-1β可促進腫瘤細胞發(fā)生EMT和轉(zhuǎn)移發(fā)生。此外,腫瘤細胞內(nèi)的HDAC6-let-7i-5p-TSP1通路激活,TSP1蛋白分泌增多,可競爭性結(jié)合CD47, 抑制細胞之間的CD47-SIRPα相互作用,從而重新激活“eat me”信號,使得腫瘤轉(zhuǎn)移和血管形成能力下降[25]。這一研究說明,TAM 的“eat me”信號在腫瘤轉(zhuǎn)移上發(fā)揮抑制作用。綜上所述,TAM除了分泌各種基質(zhì)調(diào)節(jié)蛋白導致腫瘤外部因素發(fā)生改變從而促進腫瘤轉(zhuǎn)移,另一方面,TAM還可通過分泌各種細胞因子或者吞噬作用而調(diào)控腫瘤細胞內(nèi)在因素的改變,促進腫瘤細胞自身侵襲能力的改變,導致肝癌細胞遠端轉(zhuǎn)移的發(fā)生。

3.3 TAM增強肝癌細胞干細胞特性 腫瘤內(nèi)有一些未成熟的低分化的細胞,是有自我復制和多細胞分化能力的一類細胞亞群,表現(xiàn)出干細胞特性,稱為腫瘤干細胞。在人源肝癌組織中,TAM的數(shù)目與腫瘤干細胞的密度呈正相關(guān),并且這種腫瘤干細胞的增多是由TAM分泌的TGF-β導致的,另外還有報道稱TNF-α也會導致腫瘤細胞干細胞特性的產(chǎn)生[26-27]。除了分泌細胞因子,TAM也可分泌外泌體和S100鈣結(jié)合蛋白A9(S100 calcium-binding protein A9)對腫瘤細胞的干細胞特性進行調(diào)節(jié)[28-29]。有研究[30]報道,CD44+的腫瘤細胞具有干細胞特性,而腫瘤微環(huán)境中的巨噬細胞所分泌的IL-6可通過STAT3通路促進CD44+腫瘤細胞增殖和成瘤能力,而使用tocilizumab抑制IL-6R會減少CD44+腫瘤細胞的數(shù)目。盡管TAM與肝癌細胞干細胞相關(guān)報道并不多,但是現(xiàn)有數(shù)據(jù)均支持TAM促進腫瘤干細胞特性的產(chǎn)生和維持,導致腫瘤的復發(fā)和轉(zhuǎn)移。TAM不僅僅被腫瘤微環(huán)境“教育”,TAM也能反過來調(diào)節(jié)腫瘤細胞的干細胞特性,形成惡性循環(huán),打破這種惡性循環(huán)是探索治療新方案的重點。

3.4 TAM抑制抗腫瘤免疫 肝癌中的腫瘤微環(huán)境極其復雜,它由大量的非正常細胞外基質(zhì)、免疫細胞、腫瘤相關(guān)成纖維細胞(cancer-associated fibroblasts, CAF)、腫瘤相關(guān)內(nèi)皮細胞組成[31]。

TAM可通過分泌的細胞因子對免疫微環(huán)境中各類T淋巴細胞的功能進行調(diào)節(jié),維持腫瘤免疫逃逸狀態(tài)。巨噬細胞來源的IL-12和IL-10可調(diào)控T淋巴細胞的活力和功能,IL-12可促進Th1 細胞活化,相反,IL-10主要促進Th2細胞的活化和細胞毒性T淋巴細胞的減少。腫瘤微環(huán)境中TAM分泌IL-12減少,而IL-10分泌增多,總體起到免疫抑制的作用[10]。TAM所分泌的前列腺素E2及 IL-10可誘導腫瘤微環(huán)境中調(diào)節(jié)性T淋巴細胞的產(chǎn)生,此外,其分泌的趨化因子CCL17、CCL18和CCL22促進調(diào)節(jié)性T淋巴細胞向腫瘤位置遷移,間接抑制細胞毒性T淋巴細胞的功能[32]。TAM的cGAS-Sting信號通路的激活會導致IRF3活化,Ⅰ型IFN分泌增多,T淋巴細胞和單核細胞浸潤增加[33]。同時IFN-α可促進TAM持續(xù)表達PD-L1, 從而重塑免疫抑制微環(huán)境[34]。除了分泌的各類細胞因子,TAM細胞表面表達的一些蛋白分子也發(fā)揮著免疫調(diào)節(jié)作用。TAM細胞表面高表達PD-L1,與CD8+T淋巴細胞的PD-1受體結(jié)合,抑制細胞毒性抗腫瘤免疫效應[35]。此外,高表達于Kupffer細胞上的galectin-9,是一種Tim3的配體,galectin-9/Tim-3信號通路可促進T淋巴細胞的衰老發(fā)生,抑制galectin-9/Tim-3信號通路可促進浸潤腫瘤的Tim-3+T淋巴細胞增殖和相關(guān)效應分子的表達,從而改善腫瘤的免疫抑制環(huán)境[36-37]。巨噬細胞作為固有免疫的組成部分,可通過吞噬作用在腫瘤早期發(fā)揮抗腫瘤作用,可隨著腫瘤細胞表達的CD47增多,與TAM表達SIRPα受體結(jié)合,“don’t eat me signal”激活,抑制巨噬細胞對腫瘤細胞的吞噬殺傷作用[38]。

免疫抑制酶可通過調(diào)節(jié)細胞外介質(zhì)的營養(yǎng)組成和生成調(diào)節(jié)性代謝物影響T淋巴細胞的免疫反應。TAM可分泌各類免疫抑制酶,如Indoleamine-pyrrole 2,3,它可抑制細胞毒性T淋巴細胞反應,并可促進調(diào)節(jié)性T淋巴細胞的遷移、分化和成熟;除此之外,誘導型一氧化氮合酶(iNOS)、精氨酸酶以及胞外酶 CD39和CD73等均在TAM上有不同程度的表達,并且發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用[39]。

由此可見,肝癌進展期TAM可通過分泌細胞因子或表達膜分子,通過直接殺傷作用,或者間接調(diào)節(jié)T淋巴細胞的作用,發(fā)揮免疫抑制作用,促進腫瘤進展。盡管肝癌中M1樣TAM有一定的促進適應性免疫的作用,但是對于比例更高的M2樣TAM,其抗腫瘤效果是微乎其微。M2樣TAM在肝癌中的占比高也可以解釋單獨抗PD-1單抗治療效果有限的部分原因。

4 TAM相關(guān)的抗HCC治療靶點

腫瘤組織內(nèi)的巨噬細胞大多為M2型,并且發(fā)揮促腫瘤作用,因此減少腫瘤內(nèi)TAM的數(shù)量是一種有效的抗腫瘤治療策略。研究[40]發(fā)現(xiàn)單獨使用索拉非尼治療肝癌雖然可以抑制腫瘤增殖和轉(zhuǎn)移,但伴隨著TAM的增多,通過使用負載氯磷酸鹽脂質(zhì)體(clodrolip) 或唑來膦酸(zoledronic acid)清除腫瘤內(nèi)的巨噬細胞,可增強索拉非尼對小鼠肝癌的增長和血管形成以及轉(zhuǎn)移的治療作用,兩藥聯(lián)合獲得了更好的治療效果。HIF抑制劑32-134D可減少腫瘤組織內(nèi)TAM和髓系來源抑制性細胞(myeloid-derived suppressor cell, MDSC)的比例,提高CD8+T淋巴細胞的占比,聯(lián)合抗PD-1治療在小鼠Hepa1-6模型上效果顯著[41]。含有C6神經(jīng)酰胺的納米脂質(zhì)體可抑制肝臟腫瘤生長,部分原因是通過抑制TAM的數(shù)量和M2極化[42]。

CCL2/CCR2軸是單核細胞由外周血液循環(huán)向炎癥或腫瘤部位遷移的重要信號通路,針對CCL2/CCR2軸的中和抗體和小分子藥物以及核酸適配體抑制劑均對肝癌有治療作用[43]。堪非醇,一種長苞冷杉的天然提取物,是CCR2的拮抗物,可增強索拉非尼對肝癌的治療作用[44]。此外,研究[45-46]發(fā)現(xiàn)CSF1/CSF1R軸招募TAM和MDSC促進腫瘤進展,針對CSF1R的抑制劑BLZ945與抗PD-1單抗聯(lián)用能有效治療小鼠原位肝癌。同樣地,G?6976靶向PKCα/ZFP64/CSF1軸與抗PD-1聯(lián)用效果較單獨使用抗PD-1治療小鼠肝癌模型效果更好。

除了改變腫瘤組織內(nèi)巨噬細胞的數(shù)量,多種藥物可通過改變存在于瘤內(nèi)巨噬細胞的極化狀態(tài)來發(fā)揮抗腫瘤效果。中藥黃芩苷可促進M2樣TAM向M1樣轉(zhuǎn)化,小分子藥物BrMC以及針對CSFR的抑制劑均對TAM的極化狀態(tài)有調(diào)節(jié)作用[47]。研究表明低劑量的索拉非尼可抑制TAM向M2型轉(zhuǎn)化,促進其向M1型促炎性巨噬細胞分化,并產(chǎn)生更多的IL-12, 增強抗腫瘤免疫反應。另外,17β-雌二醇(17β-estradiol)可通過調(diào)節(jié)巨噬細胞極化而抑制HCC生長,在機制上主要通過抑制雌激素受體β (ER-β)與ATP5J的相互作用,阻斷JAK1-STAT6信號通路,從而促進巨噬細胞向M1極化[48]。蟾毒靈可驅(qū)動肝癌內(nèi)巨噬細胞向M1極化,促進肝癌的抗腫瘤免疫,機制上,蟾毒靈促進p65-p50異質(zhì)二聚體形成多于p50同二聚體,NF-κB信號通路被激活,從而促進肝癌抗腫瘤免疫[49]。另外,針對CD47的單克隆抗體促進巨噬細胞向腫瘤組織遷移以及對腫瘤細胞的吞噬作用,抑制肝癌進展[50]。

5 總結(jié)與展望

綜上所述,TAM與肝癌發(fā)生發(fā)展的整個過程均密切相關(guān),并且在腫瘤中主要以M2樣的狀態(tài)促進腫瘤免疫耐受,導致肝癌惡性進展。TAM既可以通過分泌各類細胞因子等對腫瘤細胞行為進行調(diào)節(jié),也可以改變腫瘤細胞所處的微環(huán)境而發(fā)揮促瘤作用。盡管TAM在肝癌中的作用已有大量報道,但其錯綜復雜的調(diào)控機制仍然有待深入探究,這些調(diào)控機制的發(fā)現(xiàn)對未來發(fā)展新的肝癌治療靶點有重要的指導意義。以TAM為靶點,針對TAM數(shù)目和功能的治療措施聯(lián)合常規(guī)治療方式如索拉非尼或抗PD-1等在小鼠肝癌模型中取得了令人鼓舞的成績,但是目前大部分證據(jù)僅局限于動物模型上,如何從基礎(chǔ)研究實現(xiàn)臨床轉(zhuǎn)化,對于廣大科研工作者仍是巨大挑戰(zhàn)。相信隨著研究深入,圍繞TAM的治療方式一定能取得更大的突破,為肝癌患者帶來新的希望。

利益沖突聲明：本文不存在任何利益沖突。

作者貢獻聲明：汪鵬、仇建南負責收集數(shù)據(jù),資料分析,撰寫論文;王忠夏負責修改文章;江春平、吳俊華提供寫作思路,指導撰寫文章,修改文章并最后定稿。