文 琳, 曾家月, 馬鳳雨, 陳 霞,2

1 西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院消化內(nèi)科, 四川 瀘州 646000; 2 成都醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院消化內(nèi)科,成都 610000

急性胰腺炎是一種胰腺急性炎癥和組織學(xué)上腺泡細(xì)胞破壞為特征的急腹癥[1],其發(fā)病率逐年上升,其中20%～25%的患者病情危重, 可出現(xiàn)局部或全身并發(fā)癥, 進(jìn)而導(dǎo)致多器官功能衰竭, 甚至危及生命, 稱為重癥急性胰腺炎 (severe acute pancreatitis, SAP) ,病死率可高達(dá)20%～40%[2]。在SAP中腸道不僅是全身炎癥反應(yīng)的一個(gè)靶器官,而且腸黏膜屏障功能的完整性與SAP病情嚴(yán)重程度密切相關(guān)。近年來對SAP腸黏膜屏障損傷的發(fā)病機(jī)制進(jìn)行了大量研究[3-4],發(fā)現(xiàn)SAP腸黏膜屏障損傷是多因素共同作用的病理生理過程,但其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜,至今尚未完全闡明。

Hedgehog信號通路由一組自分泌的細(xì)胞間信號分子激活,這些分子對胰腺的形態(tài)發(fā)生和穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要。在哺乳動(dòng)物中,三種蛋白質(zhì)組成Hedgehog家族:Sonic Hedgehog(Shh)、Desert Hedgehog(Dhh)、Indian Hedgehog(Ihh)[5]。Shh是人類胰腺中最重要的Hedgehog配體之一[6],該通路主要包括Shh信號蛋白、細(xì)胞膜表面的特異性受體Patched (Ptch)、Smoothened(Smo)跨膜蛋白體和下游胞內(nèi)核轉(zhuǎn)錄因子膠質(zhì)瘤相關(guān)癌基因(Glioma-associated oncogene homolog,Gli)等組成。在Shh蛋白缺失的情況下,Ptch與Smo相互作用,抑制Smo的活性,從而阻斷信號傳導(dǎo)。當(dāng)Shh蛋白存在時(shí),它與Ptch相互作用,導(dǎo)致Smo的去抑制,從而激活下游轉(zhuǎn)錄因子Gli等[7]。既往研究[8-9]利用雨蛙素誘發(fā)小鼠急性胰腺炎,結(jié)果顯示Shh可以通過調(diào)節(jié)IL-10對胰腺組織發(fā)揮保護(hù)性的抗炎作用。近年研究[10]表明Shh信號可能參與了急性胰腺炎過程中遠(yuǎn)隔組織(肝、小腸、肺、腎)損傷和修復(fù)過程。然而,Shh信號通路對SAP腸黏膜屏障功能是否具有保護(hù)作用國內(nèi)外尚無研究報(bào)道。因此,本研究構(gòu)建了大鼠SAP損傷模型,檢測Shh信號通路的干預(yù)對胰腺、腸道組織病理改變、生化指標(biāo)、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡及下游信號通路Ptch1、Gli1的影響,以期揭示Shh信號通路在SAP腸黏膜屏障損傷治療中的潛在價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 健康雄性SD大鼠48只,體質(zhì)量200～220 g,22 ℃飼養(yǎng),給予12 h晝夜交替光照,自由獲取食物和水,購自并飼養(yǎng)于西南醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證編號:XNYK(川)2018-065;實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證編號:SCXK(川)2018-17]。適應(yīng)性飼養(yǎng)一周后,將大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為假手術(shù)組(sham組)、SAP組、Shh信號通路特異性激動(dòng)劑嘌呤胺[11]干預(yù)組(PUR+SAP組)、Shh信號通路特異性抑制劑環(huán)巴胺[12-13]干預(yù)組(CYC+SAP組),每組12只大鼠,各組分為12 h、24 h兩個(gè)亞組,每個(gè)亞組6只。

1.2 SAP模型建立及標(biāo)本采集 根據(jù)Perides等[6]發(fā)表在NatureProtocol上的誘導(dǎo)胰腺炎方案,并進(jìn)行了輕微的修改。清潔健康的SD大鼠,實(shí)驗(yàn)前12 h開始禁食,自由飲水。2%戊巴比妥鈉(45 mg/kg) 經(jīng)腹腔注射麻醉后取仰臥位并固定于操作臺上,備皮、消毒皮膚后于下腹中線切開進(jìn)入腹腔,暴露胰腺和膽胰管,用無創(chuàng)血管夾在近肝門處夾閉膽管,將靜脈針從十二指腸逆行插入膽胰管末端,使用注射泵以0.2 mL/min(0.1 mg/100 g)的均勻速度注射新鮮配制的5%牛磺膽酸鈉溶液,夾閉膽管觀察10 min后關(guān)閉腹腔。CYC+SAP組、PUR+SAP組大鼠分別于造膜前1 h給予環(huán)巴胺溶液0.69 mg/kg和嘌呤胺溶液0.69 mg/kg 腹腔注射1次,Sham組和SAP組給予等體積的生理鹽水腹腔注射1次。Sham組開腹僅翻動(dòng)胰腺數(shù)次后關(guān)腹。造模后12 h和24 h分批麻醉SD大鼠,每次麻醉24只,共分為4個(gè)組,每組6只,經(jīng)原腹部切口入腹。取心臟血后于室溫下2 000 r/min離心10 min,迅速置于-80 ℃保存,用于生化指標(biāo)檢測。切取適量胰腺、回腸組織,立即投入液氮罐中保存、備檢。

1.3 血清指標(biāo)檢測 按照生化試劑盒說明書步驟,檢測血清淀粉酶、脂肪酶、二胺氧化酶(diamine oxidase, DAO)、內(nèi)毒素核心抗體(endotoxin core antibodies, EndoCAb)水平。

1.4 主要試劑 ?；悄懰徕c(美國Sigma公司),微量泵(中國Lifepump公司),淀粉酶測試盒和脂肪酶試劑盒(中國ELK Biotechnology公司),BCA 蛋白濃度測定試劑盒(中國Aspen Biotechnology公司),TUNEL染色試劑盒(美國Roche Diagnostics公司),Shh一抗(英國Cell Signaling Technology公司),特異性受體Patched(Ptch1)一抗、Gli一抗(中國Santa Cruz公司),增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光試劑盒(中國Aspen Biotechnology公司)。

1.5 組織病理學(xué)檢查 胰腺和回腸組織標(biāo)本用4%甲醛清洗固定,石蠟包埋后,切取4 μm厚組織切片,切片脫蠟后,HE染色,光鏡下進(jìn)行形態(tài)學(xué)分析。根據(jù)Schmidt評分(最高分為16分)分析胰腺的組織病理學(xué)變化,包括:小葉間隙、胰泡間隙、細(xì)胞間隙水腫擴(kuò)展程度(0～4分);高倍視野下彌漫發(fā)生、局部發(fā)生的腺泡細(xì)胞壞死數(shù)(0～4分);出血和脂肪壞死的區(qū)域(0～4分);高倍視野下小葉內(nèi)或血管周圍浸潤的白細(xì)胞數(shù)(0～4分)。根據(jù)Chiu評分(最高分為5分)分析回腸組織病理學(xué)變化,評分標(biāo)準(zhǔn)為:(1)0分,正常黏膜絨毛;(2)1分,絨毛頂端上皮下出現(xiàn)間隙,炎癥細(xì)胞局部增多;(3)2分,上皮下間隙擴(kuò)大,固有層局部水腫出血;(4)3分,固有層明顯水腫,彌漫出血,炎癥細(xì)胞皮下聚集;(5)4分,剝脫的絨毛有固有層和擴(kuò)張的毛細(xì)血管暴露;(6)5分,固有層消化崩解、出血、潰瘍。從每個(gè)胰腺、回腸組織節(jié)段中隨機(jī)選擇5個(gè)區(qū)域進(jìn)行病理評估。

1.6 TUNEL法檢測回腸黏膜凋亡細(xì)胞 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)步驟對回腸組織進(jìn)行取材、脫水、包埋、切片,然后石蠟切片進(jìn)行脫蠟至水合,配制蛋白酶K工作液37 ℃水浴鍋孵育30 min,配制破膜液,室溫孵育10 min,取TUNEL試劑盒內(nèi)試劑1和試劑2按1∶10混合,配制適量孵育液,避光37 ℃孵育1.5 h。PBS洗3次,滴加DAPI染核,室溫避光孵育20～30 min,PBS洗后用抗熒光淬滅封片劑封片,顯微鏡下觀察拍照。熒光圖像中陽性細(xì)胞(綠色)的數(shù)量代表細(xì)胞凋亡,高倍鏡下(×200)每張切片隨機(jī)擇5個(gè)視野,應(yīng)用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件計(jì)算每個(gè)視野中的積分光密度(IOD)值計(jì)算細(xì)胞凋亡的半定量結(jié)果,5個(gè)視野的平均值代表每張切片的IOD值。

1.7 Western Blot測定相關(guān)蛋白表達(dá) 在各組胰腺組織中加入1%苯甲基磺酰氟(PMSF)的RIPA提取總蛋白。勻漿液4 ℃ 12 000 r/min離心5 min,收集上清液。用BCA蛋白測定試劑盒測定蛋白濃度。采用4%～12% SDS-PAGE法分離總樣品(20 μg)。等量的蛋白質(zhì)(20 μg)用4%～12% SDS -聚丙烯酰胺凝膠電泳分離,然后電印跡到PVDF膜上。用含有5%脫脂牛奶的TBST在37 ℃下阻斷1 h后,與抗Shh抗體(1∶1 000稀釋)、抗Ptch1抗體(1∶500稀釋)、抗Gli1抗體(1∶500稀釋)和內(nèi)參抗GAPDH抗體(1∶1 000稀釋)在4 ℃下孵育過夜。加入二抗稀釋液稀釋好的二抗,采用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光試劑盒對條帶進(jìn)行可視化,以GAPDH作為內(nèi)參進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。用AlphaEaseFC軟件處理系統(tǒng)分析目標(biāo)帶的光密度值。

2 結(jié)果

2.1 胰腺和回腸組織的病理學(xué)分析 Sham組胰腺組織形態(tài)正常。與Sham組相比,SAP組光鏡下見胰腺間質(zhì)明顯水腫,胰腺小葉和腺體結(jié)構(gòu)異常,腺泡細(xì)胞壞死,細(xì)胞膜溶解、破裂,片狀壞死灶從胰腺小葉邊緣逐漸擴(kuò)大到核心,壞死區(qū)域周圍可見大量炎性細(xì)胞浸潤,胰腺病理評分升高。PUR+SAP組顯著減輕了胰腺組織的組織學(xué)損傷,胰腺小葉結(jié)構(gòu)清晰,水腫、出血和炎癥細(xì)胞浸潤減輕,壞死區(qū)域減少,12 h及24 h胰腺組織病理學(xué)評分明顯低于SAP組(P值均<0.05);CYC+SAP組胰腺損傷明顯較SAP組加重,胰腺損傷病理評分在2個(gè)時(shí)間點(diǎn)均明顯升高(P值均<0.05)(圖1,表1)。

圖1 胰腺組織病理學(xué)改變(HE染色,×200)

表1 胰腺和回腸組織的病理學(xué)評分

與Sham組相比,SAP組回腸組織固有層脫落,絨毛短、少,固有層明顯水腫,炎癥細(xì)胞增多,回腸病理損傷評分增高(P值均<0.05);PUR+SAP組回腸黏膜損傷相比SAP組明顯緩解,回腸固有層的不規(guī)則性和脫落減少,絨毛的形狀、長度和完整性相對正常;與SAP組相比,CYC+SAP組腸道損傷更為明顯,固有層不規(guī)則脫落,可見擴(kuò)張的毛細(xì)血管,炎癥細(xì)胞皮下聚集,可見部分固有層消化崩解、出血(圖2,表1)。

2.2 血清中淀粉酶、脂肪酶、DAO和EndoCAb水平

與Sham組比較,SAP組血清淀粉酶、脂肪酶、DAO 和 EndoCAb在2個(gè)時(shí)間點(diǎn)均顯著升高(P值均<0.05);應(yīng)用環(huán)巴胺干預(yù)后,PUR+SAP組血清淀粉酶、脂肪酶、DAO和 EndoCAb較SAP組在2個(gè)時(shí)間點(diǎn)均顯著降低(P值均<0.05);與SAP組相比,CYC+SAP組血清淀粉酶、脂肪酶、DAO和 EndoCAb在2個(gè)時(shí)間點(diǎn)均顯著升高(P值均<0.05)(圖3)。

圖2 回腸組織病理學(xué)改變(HE染色,×200)

圖3 血清中淀粉酶、脂肪酶、DAO 和 EndoCAb水平

2.3 腸道黏膜凋亡 用TUNEL法檢測細(xì)胞凋亡,陽性凋亡細(xì)胞核為綠色,正常細(xì)胞核為藍(lán)色。與Sham組比較,在12 h、24 h時(shí)間點(diǎn),SAP模型組小鼠腸道上皮細(xì)胞凋亡顯著增加,嘌呤胺治療后在2個(gè)時(shí)間點(diǎn)腸道上皮細(xì)胞凋亡均顯著減輕,當(dāng)Shh信號通路被環(huán)巴胺阻斷后,在2個(gè)時(shí)間點(diǎn)腸道上皮細(xì)胞凋亡均顯著增加(圖4);TUNEL半定量分析提示與Sham組相比,SAP組IOD值明顯升高,使用嘌呤胺后與SAP組相比IOD值降低,使用環(huán)巴胺后與SAP組相比IOD值升高(P值均<0.05)(圖5)。

2.4 回腸組織Shh/Ptch1/Gli1通路蛋白表達(dá) 在造模后12 h和24 h,與Sham組相比,SAP組回腸組織Shh、Ptch1和Gli1的表達(dá)均增加(P值均<0.05);在造模后12 h和24 h ,PUR+SAP組Shh、Ptch1和Gli1蛋白水平較SAP組均進(jìn)一步明顯升高(P值均<0.05);在造模后12 h,CYC+SAP組回腸組織Shh蛋白水平較SAP組顯著降低(P<0.05),Ptch1和Gli1的蛋白水平與SAP組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均>0.05),在造模后24 h,與SAP組相比,CYC+SAP組回腸組織Shh 、Ptch1和Gli1蛋白水平均顯著降低(P值均<0.05)(圖6)。

3 討論

SAP是一種嚴(yán)重的全身性疾病,其特點(diǎn)是發(fā)病急、進(jìn)展快、病死率高[14]。在SAP中,腸道是最常受累的靶器官之一,出現(xiàn)腸黏膜通透性增加,腸屏障功能障礙[15-16],腸黏膜屏障損傷后腸內(nèi)細(xì)菌和內(nèi)毒素的移位是導(dǎo)致SAP并發(fā)感染、誘發(fā)和加重全身炎癥反應(yīng)綜合征和多器官功能障礙, 且病死率居高不下的關(guān)鍵原因[17]。SAP早期治療的主要目標(biāo)之一應(yīng)是維持小腸內(nèi)腸屏障的完整性?！吨袊毙砸认傺自\治指南(2013年,上海)》[18]將營養(yǎng)支持作為 SAP 的重要治療方法之一,并明確指出營養(yǎng)支持的適應(yīng)證和具體實(shí)施方案。但部分患者早期常并發(fā)腸道功能麻痹甚至梗阻、腹腔高壓、消化道出血等并發(fā)癥,無法早期應(yīng)用腸內(nèi)營養(yǎng)[19]。因此,探討有關(guān)細(xì)胞增殖及組織修復(fù)的Shh 信號調(diào)控SAP腸黏膜屏障損傷的機(jī)制可能為SAP潛在治療新靶點(diǎn)提供理論支撐。

圖5 細(xì)胞凋亡的積分光密度值

注:a,Western Blot檢測Shh、Ptch1、Gli1通路相關(guān)蛋白表達(dá),GAPDH作為對照; b、c,Shh、Ptch1和Gli1蛋白相對表達(dá)量。

在本實(shí)驗(yàn)中,采用胰膽管逆行注射5%?；悄懰徕c誘發(fā)SAP。相比Sham組,SAP組出現(xiàn)明顯胰腺損傷病理學(xué)表現(xiàn),如組織水腫、出血、腺泡細(xì)胞壞死和炎癥細(xì)胞浸潤,且SAP組2個(gè)時(shí)間點(diǎn)血清中淀粉酶和脂肪酶均顯著升高,表明SAP大鼠模型誘導(dǎo)成功。進(jìn)一步觀察SAP時(shí)腸黏膜損傷情況,HE染色結(jié)果表明,SAP組回腸黏膜出現(xiàn)大量破壞,絨毛變短、萎縮、斷裂,這些改變導(dǎo)致腸黏膜完整性破壞,腸黏膜屏障功能障礙,腸黏膜通透性增加,引起胰腺壞死組織繼發(fā)感染,加重病情進(jìn)展。為了進(jìn)一步證實(shí)SAP對腸黏膜屏障和通透性的影響,還測定了腸道通透性的指標(biāo):DAO和EndoCAb。DAO[20]是一種細(xì)胞質(zhì)酶,其表達(dá)水平與腸屏障功能呈負(fù)相關(guān)。EndoCAb 是機(jī)體針對內(nèi)毒素產(chǎn)生的抗體[21]。在腸黏膜通透性改變時(shí),內(nèi)毒素進(jìn)入血液,可產(chǎn)生大量的內(nèi)毒素核心抗體。本研究發(fā)現(xiàn),與Sham組相比,SAP組大鼠血清中DAO 和 EndoCAb 水平明顯升高。通過對腸黏膜凋亡檢測后發(fā)現(xiàn),與Sham組相比,SAP 組細(xì)胞凋亡率明顯增高,IOD 值明顯增高。因此,本研究進(jìn)一步證實(shí) SAP大鼠伴有腸黏膜屏障功能損傷。

Shh配體是一種未知的胃腸炎癥抗炎調(diào)節(jié)劑,很可能在炎癥的早期階段,該信號通路被激活,以促進(jìn)細(xì)胞增殖以及受損組織修復(fù)。一些研究表明Shh信號通路與炎癥、氧化應(yīng)激、上皮屏障功能和各種疾病的凋亡抑制有關(guān)。在MPTP(1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氫吡啶)誘導(dǎo)的帕金森病中,Shh表達(dá)增加,并與神經(jīng)毒素誘導(dǎo)損傷的恢復(fù)有關(guān)[22]。在大鼠中,重組人Shh蛋白已被證明上調(diào)ZO-1和occludin的表達(dá),以修復(fù)腦內(nèi)皮細(xì)胞之間破裂的細(xì)胞連接,從而減少缺血性中風(fēng)后血腦屏障的損傷[23]。另一項(xiàng)研究[24]發(fā)現(xiàn),可以通過調(diào)節(jié)MDA、SOD、Bax/Bcl-2和caspase-3的水平,從而激活Shh信號通路,該通路的激活能夠降低葡聚糖硫酸鈉誘導(dǎo)的結(jié)腸炎模型中的氧化應(yīng)激和凋亡,而環(huán)巴胺治療后逆轉(zhuǎn)了這種保護(hù)作用。目前有研究表明Shh通路對于急性胰腺炎具有保護(hù)作用,Zhou等[8]證實(shí)Shh信號通路通過提高IL-10水平來減少重癥胰腺炎的炎癥反應(yīng)。在本研究中,Shh激動(dòng)劑處理的大鼠血清中淀粉酶和脂肪酶、DAO、EndoCAb水平、胰腺組織和回腸組織病理學(xué)評分顯著低于SAP組的大鼠。隨后發(fā)現(xiàn)特異性阻斷Shh信號通路后,血清中淀粉酶、脂肪酶、DAO、EndoCAb的水平顯著升高,胰腺、回腸細(xì)胞病理損傷破壞增加,進(jìn)一步證實(shí)了Shh信號通路的激活能減輕SAP中胰腺和腸道病理損害及功能障礙,而Shh信號通路被阻斷時(shí),這種保護(hù)機(jī)制就會(huì)受到抑制。

小腸是SAP時(shí)受損的遠(yuǎn)端器官之一,由于“第三間隙”液體丟失導(dǎo)致微循環(huán)障礙、低血容量、內(nèi)臟血管收縮,最終導(dǎo)致缺血-再灌注損傷(intestinal ischemia-reperfusion,IR)。腸道IR的發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜,炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡、氧化應(yīng)激、鈣超載等在其發(fā)生、發(fā)展過程中起重要作用[25-26]。最近的研究[25]發(fā)現(xiàn),細(xì)胞凋亡是腸道IR后腸細(xì)胞死亡的關(guān)鍵過程。Meng等[27]發(fā)現(xiàn)虎杖苷通過激活Shh信號通路降低細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激減輕腎IR損傷。 Liang等[28]證實(shí)Hedgehog信號通路在小腸損傷/修復(fù)過程中呈雙相表達(dá),在腸道修復(fù)中可能起著重要的調(diào)節(jié)作用。與之前的研究結(jié)果一致,筆者對大鼠腸上皮細(xì)胞凋亡的研究發(fā)現(xiàn),對比SAP組,激活Shh信號通路可以顯著減少腸上皮細(xì)胞的凋亡,而抑制Shh信號通路的表達(dá)則會(huì)增加腸上皮細(xì)胞的凋亡。這些結(jié)果表明,Shh信號通路可能在SAP引起的腸屏障損傷中具有抑制細(xì)胞凋亡作用。

為了進(jìn)一步研究Shh信號通路在SAP腸屏障損傷后組織修復(fù)中的作用機(jī)制,本研究通過Western Blot進(jìn)一步檢測回腸組織中Shh、Ptch1、Gli1的蛋白表達(dá)。作為Shh信號通路的重要組成部分和主要目的基因,Shh、Ptch1、Gli1在SAP組大鼠回腸組織中的表達(dá)較Sham組明顯增加;應(yīng)用Shh信號通路特異性激動(dòng)劑嘌呤胺后,Shh、Ptch1、Gli1的表達(dá)較SAP組明顯增加;而使用Shh信號通路特異性抑制劑環(huán)巴胺后,Shh、Ptch1、Gli1蛋白表達(dá)較SAP組降低。最近的證據(jù)表明,Hedgehog信號轉(zhuǎn)導(dǎo)在調(diào)節(jié)腸干細(xì)胞的增殖中起著關(guān)鍵作用,從前體細(xì)胞中清除Hedgehog可阻斷右旋糖酐硫酸鈉刺激的腸干細(xì)胞的增殖,提示局部Hedgehog的產(chǎn)生對刺激腸干細(xì)胞增殖至關(guān)重要[29]。因此,推測Shh-Ptch1- Gli1信號通路參與了SAP腸黏膜屏障損傷。

綜上所述,本研究首次揭示了Shh信號通路對SAP所致大鼠腸道損傷的保護(hù)作用。 Shh信號通路的干預(yù)對SAP所致的腸屏障損傷也有較強(qiáng)的保護(hù)作用。提示激動(dòng)Shh信號通路可能是治療SAP所致腸道損害的新靶點(diǎn)。

倫理學(xué)聲明：本研究方案于2022年3月9日經(jīng)由西南醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物保護(hù)與福利委員會(huì)批準(zhǔn),批號:swmu20220019,符合實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物管理與使用準(zhǔn)則。

利益沖突聲明：本文不存在任何利益沖突。

作者貢獻(xiàn)聲明：文琳負(fù)責(zé)課題設(shè)計(jì),資料分析,撰寫論文;曾家月、馬風(fēng)雨參與收集數(shù)據(jù),修改論文;陳霞負(fù)責(zé)擬定寫作思路,指導(dǎo)撰寫文章并最后定稿。