劉軍艦, 陳 帥, 袁紅霞, 許 艷, 張西波, 李忠廉

1 天津市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院肝膽胰外科二, 天津 300100; 2 徐州市中醫(yī)院胸外科, 江蘇 徐州 221003;3 天津中醫(yī)藥大學(xué)管理學(xué)院, 天津 301617; 4 天津醫(yī)科大學(xué)研究生院, 天津 300070

阻塞性黃疸患者通常伴有不同程度的腎損傷,手術(shù)打擊可導(dǎo)致并發(fā)急性腎衰竭乃至死亡,因此采取有效措施防治腎衰竭的發(fā)生具有重要意義[1]。阻塞性黃疸引起腎損傷的原因未明,氧化應(yīng)激損傷可能是導(dǎo)致腎損傷的重要機(jī)制[2]。核因子E2相關(guān)因子2(NF-E2 related factor 2, Nrf2)是組織和細(xì)胞中抗氧化劑減少的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。在正常情況下,Nrf2與細(xì)胞質(zhì)中的Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白1(Kelch-like ECH-associated protein 1, Keap1)結(jié)合,可通過(guò)泛素-蛋白酶體途徑快速降解[3]。當(dāng)身體受到氧化應(yīng)激刺激時(shí),Nrf2從隔離狀態(tài)釋放并轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核,在細(xì)胞核中促進(jìn)抗氧化和細(xì)胞保護(hù)基因的轉(zhuǎn)錄。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)構(gòu)建阻塞性黃疸大鼠模型,研究茵陳蒿湯對(duì)大鼠膽道梗阻時(shí)腎損傷的影響與調(diào)節(jié)Nrf2表達(dá)及核異位的關(guān)系,為臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康SPF級(jí)雄性SD大鼠32只,體質(zhì)量200～230 g,購(gòu)買(mǎi)于北京華阜康生物科技股份有限公司[實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào):SCXK(京)2019-0010;實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào):SCXK(津)2020-0008],飼養(yǎng)于天津市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室。大鼠標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng),飲用水自由,均分籠飼養(yǎng),每籠5只,光照與黑暗各12 h交替處理,濕度為50%～60%,溫度為20～22 ℃,適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)藥物和試劑 中藥購(gòu)于天津市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院中藥飲片藥房,按照《傷寒論》中茵陳蒿湯劑量組成換算:茵陳120 g,梔子80 g,大黃40 g,共計(jì)240 g[4]。中藥浸泡30 min后,煎煮2次,取2次煎煮液濃縮至240 mL,所得茵陳蒿湯含生藥量1 g/mL。血清總膽紅素(TBil)、直接膽紅素(DBil)、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷氨酰轉(zhuǎn)移酶(GGT)、尿素氮(BUN)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)水平檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司(貨號(hào):BC5180、BC5170、BC1550、BC1220、BC1530、BC0170、BC0020);血肌酐(Cr)水平檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京艾普希隆生物科技有限公司(貨號(hào):G1204F);Nrf2、Keap1抗體、蛋白Marker購(gòu)自賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司(貨號(hào):PA5-27882、PA5-99434、PA5-26617);醌氧化還原酶1(NQO1)抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam公司(貨號(hào):ab138491);β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)多克隆抗體購(gòu)自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司(貨號(hào):66009-1-Ig);辣根酶標(biāo)記山羊抗兔/抗小鼠IgG、SP法二抗試劑盒購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司(貨號(hào):ZB-2301、ZB-2305)。0.45 μm PVDF膜、化學(xué)發(fā)光底物ECL試劑盒、RIPA裂解液購(gòu)自密理博(中國(guó))有限公司(貨號(hào):IPHV00010、WBKLS0500、20-188);蛋白定量試劑盒、5×蛋白上樣緩沖液購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司(貨號(hào):PC0020、P1041)。

1.1.3 主要設(shè)備和儀器 3-30型號(hào)K低溫離心機(jī)(德國(guó)Sigma公司);電泳儀(BIO-RAD公司,PowerPace Basic);酶標(biāo)儀(上?？迫A生物工程股份有限公司,ST-360);凝膠成像儀(上海天能科技有限公司,4800Multi);QuantStudio 3型PCR擴(kuò)增儀(美國(guó)ABI公司);T100型熱循環(huán)PCR儀(美國(guó)Bio-Rad公司);倒置相差顯微鏡(日本OLYMPUS)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 大鼠分組及干預(yù)方法 將32只大鼠采用隨機(jī)數(shù)字表法分為假手術(shù)組(S組)、模型組(O組)、低劑量茵陳蒿湯組(LY組)、高劑量茵陳蒿湯組(HY組),每組8只。將O組、LY組、HY組大鼠采用膽管雙重結(jié)扎的方法建立阻塞性黃疸模型,具體步驟如下:術(shù)前12 h禁食水,予面罩吸入異氟烷麻醉,充分消毒大鼠腹部,于上腹正中切口入腹。于膽總管中上1/3行雙重結(jié)扎建立阻塞性黃疸模型。S組大鼠僅游離上段膽總管但不予結(jié)扎。手術(shù)后7天,觀察大鼠小便、皮毛、爪尾顏色變黃,并且出現(xiàn)活動(dòng)減少、被毛松散、條狀稀便且臭穢等表現(xiàn)后即表明阻塞性黃疸模型建立成功。建模成功后,LY組大鼠每日定時(shí)予茵陳蒿湯6.3 mL/kg灌胃,HY組大鼠予茵陳蒿湯18.9 mL/kg灌胃,S組和O組大鼠予6.3 mL/kg蒸餾水灌胃。連續(xù)灌胃7天。采取異氟烷吸入麻醉,下腔靜脈采血,離心后備用;充分顯露腎臟,取部分腎組織置于塑料試管中,編號(hào)保存于-80 ℃冰箱中備用,取部分腎組織放入4%多聚甲醛中固定后包埋蠟塊備用。

1.2.2 血清肝、腎功能測(cè)定 血液標(biāo)本靜置30 min,以3 000 r/min離心10 min后取血清,按照試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟分別檢測(cè)各組大鼠血清TBil、DBil、ALT、GGT、BUN、Cr水平。

1.2.3 檢測(cè)大鼠腎組織SOD、MDA水平 取另一部分的腎組織按要求制備腎組織勻漿液,以4 000 r/min離心15 min,分離上清液,按照試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)腎組織中SOD、MDA水平。

1.2.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)大鼠腎組織中Nrf2、Keap1、NQO1 mRNA的水平 采用Prime5.0軟件設(shè)計(jì)Nrf2、Keap1、NQO1、β-actin基因引物序列(表1),由北京賽百盛基因技術(shù)有限公司合成。按照說(shuō)明書(shū)裂解組織,提取總RNA并檢測(cè)其濃度和純度。按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒對(duì)RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄,合成擴(kuò)增前cDNA。以2 μL cDNA為模板,β-actin為內(nèi)參mRNA,采用SYBR Green依次按照95 ℃預(yù)變性2 min,94 ℃變性20 s,60 ℃退火20 s,72 ℃延伸30 s,共40個(gè)循環(huán),檢測(cè)基因的表達(dá)水平按照2-ΔΔCt法進(jìn)行定量分析。

1.2.5 蛋白免疫印跡檢測(cè)腎組織中Nrf2、Keap1、NQO1蛋白的表達(dá) 液氮研磨-80 ℃下保存的腎組織50 mg,加入裂解液(含蛋白酶抑制劑),置于冰上裂解,18 759×g離心30 min,吸取上清液,測(cè)定樣品蛋白濃度,加入SDS-loading buffer,100 ℃金屬浴10 min,每孔上樣20 μg,進(jìn)行電泳分析,轉(zhuǎn)膜,封閉,加入Nrf2(1∶500)、Keap1(1∶500)、NQO1(1∶10 000)、β-actin(1∶5 000)一抗4 ℃孵育過(guò)夜;TBST洗膜,加入HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG二抗(1∶8 000)孵育1 h,洗膜,顯色液孵育2 min,成像儀上進(jìn)行信號(hào)檢測(cè),分析條帶。數(shù)碼凝膠圖像分析系統(tǒng)檢測(cè)蛋白陽(yáng)性表達(dá)情況,比較各組蛋白表達(dá)水平。

1.2.6 免疫組化檢測(cè)腎組織中Nrf2蛋白的核異位情況 標(biāo)本常規(guī)石蠟包埋制成5 μm切片,采用免疫組化法進(jìn)行染色。取3組大鼠腎組織包埋成石蠟組織塊,石蠟切片常規(guī)脫蠟水化;在pH=6的0.01 mmol/L檸檬酸鈉緩沖液中,微波大火熱抗原修復(fù)15 min;3%過(guò)氧化氫溶液封閉15 min;磷酸鹽緩沖液浸洗后Nrf2一抗(1∶100)濕盒中4 ℃過(guò)夜進(jìn)行孵育;二抗(1∶1 000),37 ℃孵育20 min;二氨基聯(lián)苯胺顯色,二次蒸餾水浸洗后蘇木素復(fù)染細(xì)胞核1 min;梯度酒精分色,二甲苯脫水透明5 min兩次,風(fēng)干后中性樹(shù)脂封片。倒置顯微鏡觀察記錄,選擇各組的陽(yáng)性和陰性組織相,進(jìn)行200×的顯微照相。選擇有意義的組織相,按樣本編號(hào)保存圖像。并對(duì)每張切片隨機(jī)選取3個(gè)視野,計(jì)數(shù)核內(nèi)陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞數(shù),結(jié)果以陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)百分比表示。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠血清中肝、腎功能指標(biāo)變化比較 與S組比較,O組大鼠血清中TBil、DBil、ALT、GGT、BUN、Cr水平均明顯升高(P值均<0.05);與O組比較,茵陳蒿湯各劑量組上述指標(biāo)顯著降低(P值均<0.05),且以茵陳蒿湯高劑量組效果最為明顯(P值均<0.05)(表2)。

2.2 各組大鼠腎組織SOD、MDA水平比較 與S組比較,O組大鼠腎組織SOD活性減弱,MDA水平升高(P值均<0.05);與O組比較,茵陳蒿湯各劑量組SOD活性均增強(qiáng),MDA水平均下降,并以茵陳蒿湯高劑量組效果最為明顯(P值均<0.05)(表3)。

表2 大鼠血清中TBil、DBil、ALT、GGT、BUN、Cr水平比較

表3 大鼠腎組織SOD、MDA水平比較

2.3 各組大鼠腎組織中Nrf2、Keap1、NQO1 mRNA的表達(dá) 各組大鼠腎組織中Keap1 mRNA的表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與S組相比,O組大鼠腎組織中Nrf2、NQO1 mRNA的表達(dá)均顯著降低(P值均<0.05);茵陳蒿湯各劑量組Nrf2、NQO1 mRNA的表達(dá)與O組相比均有不同程度的升高(P值均<0.05),以茵陳蒿湯高劑量組效果最為明顯(P值均<0.01)(圖1)。

圖1 大鼠腎組織中Nrf2、Keap1、NQO1 mRNA表達(dá)水平比較

expression in renal tissue of rats

2.4 各組大鼠腎組織中Nrf2、Keap1、NQO1蛋白的表達(dá) 各組大鼠腎組織中Keap1蛋白的表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與S組比較,O組大鼠腎組織中Nrf2、NQO1蛋白的表達(dá)均降低(P值均<0.05);與O組相比,茵陳蒿湯各劑量組Nrf2、NQO1蛋白的表達(dá)均有不同程度的升高(P值均<0.05),以茵陳蒿湯高劑量組效果最為明顯(P值均<0.01)(圖2、3)。

圖2 大鼠腎組織中Nrf2、Keap1、NQO1蛋白表達(dá)

圖3 大鼠腎組織中Nrf2、Keap1、NQO1蛋白表達(dá)水平比較

expression in renal tissue of rats

2.5 各組大鼠腎組織中Nrf2蛋白核異位情況 S組大鼠腎小管上皮細(xì)胞有少量棕黃色顆粒,整體顏色較淺;O組棕黃色顆粒較S組減少;茵陳蒿湯各劑量組中可見(jiàn)大量棕黃色顆粒,整體顏色較深,且大部分細(xì)胞核呈棕黃色(圖4)。與S組比較,O組大鼠腎皮質(zhì)組織中Nrf2細(xì)胞核內(nèi)陽(yáng)性率降低(P<0.05);與O組相比,茵陳蒿湯各劑量組Nrf2細(xì)胞核內(nèi)陽(yáng)性率均顯著升高(P值均<0.01)(圖5)。

圖4 大鼠腎組織中Nrf2蛋白核異位情況(免疫組化染色)

圖5 大鼠腎組織中Nrf2蛋白細(xì)胞核陽(yáng)性率比較

3 討論

阻塞性黃疸是由各種原因引起的細(xì)小膽管、肝總管或膽總管機(jī)械性梗阻所致,是臨床肝膽外科常見(jiàn)的疾病。它會(huì)對(duì)全身各個(gè)臟器造成不同程度的損傷,腎臟是對(duì)由阻塞性黃疸引起的各種損傷中最為敏感的器官之一。急性腎衰竭是阻塞性黃疸患者嚴(yán)重的并發(fā)癥之一,其發(fā)生率為6%～8%,病情危險(xiǎn),患者病死率可高達(dá)68%[5]。本研究發(fā)現(xiàn),阻塞性黃疸發(fā)生后,大鼠肝、腎功能均呈現(xiàn)不同程度的損傷,這與以往的研究[6]結(jié)果一致,提示阻塞性黃疸發(fā)生時(shí),除肝臟以外,腎臟是另一重要的損傷靶器官。有臨床研究[1]表明,阻塞性黃疸患者腎小球?yàn)V過(guò)率減少或腎功能障礙與血液中脂質(zhì)過(guò)氧化和抗氧化狀態(tài)的改變有關(guān),但目前發(fā)生機(jī)制仍未完全明確。

茵陳蒿湯是臨床上治療黃疸的中醫(yī)經(jīng)典名方,由茵陳、梔子、大黃組成,主治濕熱黃疸。藥理學(xué)研究[7]表明,茵陳其主要活性成分為香豆素類(lèi)、黃酮類(lèi)、有機(jī)酸類(lèi)、揮發(fā)油等成分,發(fā)揮抗菌、抗炎、抗氧化等藥理活性。大黃中主要包含蒽衍生物類(lèi)、揮發(fā)油類(lèi)、苷類(lèi)化合物、有機(jī)酸類(lèi)等成分,這些成分在保護(hù)肝腎功能、調(diào)節(jié)消化系統(tǒng)功能、消炎利膽及促進(jìn)胰液分泌、抗氧化應(yīng)激、減輕疼痛、抗腫瘤方面起到重要作用[8]。梔子中主要包括環(huán)烯醚萜類(lèi)、萜苷類(lèi)、黃酮類(lèi)、揮發(fā)油、有機(jī)酸酯類(lèi)、各種微量元素等化學(xué)成分。梔子的作用為促進(jìn)膽汁分泌、抗炎、抗氧化、保護(hù)肝功能、促進(jìn)胰腺分泌、降壓降糖降脂、改善胃功能等[9]。筆者團(tuán)隊(duì)前期研究[10-11]發(fā)現(xiàn),茵陳蒿湯可通過(guò)減少線粒體DNA損傷、降低NO產(chǎn)生等途徑減輕阻塞性黃疸大鼠肝臟氧化應(yīng)激損傷,進(jìn)而減輕阻塞性黃疸肝損傷,而茵陳蒿湯對(duì)阻塞性黃疸腎損傷的作用及機(jī)制是另一重要的探索方向。

Nrf2是對(duì)抗氧化應(yīng)激的上游轉(zhuǎn)錄因子,調(diào)控抗氧化酶、Ⅱ相解毒酶等多種保護(hù)性蛋白的轉(zhuǎn)錄表達(dá)[12]。Nrf2是組織和細(xì)胞抗氧化還原的中樞調(diào)節(jié)者,而Keap1蛋白是一種對(duì)Nrf2具有抑制作用的特異負(fù)性調(diào)節(jié)蛋白[3]。正常生理狀態(tài)下,Nrf2與Keap1蛋白偶聯(lián)存在細(xì)胞質(zhì)中,并處于穩(wěn)定狀態(tài),可以在泛素-蛋白酶體途徑作用下迅速降解[13]。機(jī)體受到刺激發(fā)生氧化應(yīng)激時(shí),活性氧自由基通過(guò)對(duì)Keap1進(jìn)行修飾,導(dǎo)致其構(gòu)象發(fā)生改變,造成Nrf2與Keap1解偶聯(lián),從而使Nrf2活化[14-15],Nrf2被激活并轉(zhuǎn)移進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi),與小Maf蛋白結(jié)合成異二聚體。之后異二聚體與抗氧化反應(yīng)元件相結(jié)合,啟動(dòng)NQO1、谷胱甘肽、谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶、血紅素氧化酶等下游抗氧化保護(hù)基因及Ⅱ相解毒酶基因的轉(zhuǎn)錄,這些細(xì)胞因子在減輕機(jī)體組織氧化應(yīng)激損傷、調(diào)節(jié)機(jī)體解毒代謝方面發(fā)揮了重要作用[16-17]。

本研究發(fā)現(xiàn),阻塞性黃疸大鼠出現(xiàn)肝、腎損傷,腎組織中SOD活性減弱,MDA水平升高,Nrf2、NQO1 mRNA及蛋白表達(dá)水平均降低,表明阻塞性黃疸可抑制Nrf2信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá),導(dǎo)致腎臟的抗氧化應(yīng)激損傷;茵陳蒿湯可以改善阻塞性黃疸大鼠的肝、腎損傷,并增強(qiáng)腎組織中SOD活性,降低MDA水平,提高大鼠腎組織中Nrf2、NQO1 mRNA及蛋白表達(dá)水平,而對(duì)Keap1表達(dá)無(wú)明顯影響,提示茵陳蒿湯可能上調(diào)Nrf2蛋白表達(dá),而并非通過(guò)調(diào)節(jié)Keap1的表達(dá)來(lái)啟動(dòng)下游NQO1基因,發(fā)揮抗氧化應(yīng)激作用,這與Lu等[18]關(guān)于氧化應(yīng)激損傷的細(xì)胞中Nrf2的調(diào)節(jié)作用與Keap1不相關(guān)的研究結(jié)果一致。另外,Nrf2只能在細(xì)胞核中發(fā)揮作用[19],免疫組化結(jié)果顯示茵陳蒿湯可明顯促進(jìn)大鼠腎組織中Nrf2細(xì)胞核內(nèi)聚集,表明茵陳蒿湯不僅可以上調(diào)腎組織中Nrf2蛋白的表達(dá),并通過(guò)促進(jìn)Nrf2蛋白核異位來(lái)啟動(dòng)下游抗氧化應(yīng)激反應(yīng)相關(guān)蛋白的表達(dá)。

綜上所述,茵陳蒿湯可以有效減輕阻塞性黃疸引起的腎損傷,其作用機(jī)制可能是通過(guò)上調(diào)大鼠腎組織中Nrf2蛋白的表達(dá),并促進(jìn)Nrf2蛋白核異位來(lái)介導(dǎo)下游蛋白的表達(dá),調(diào)節(jié)阻塞性黃疸引起的氧化應(yīng)激反應(yīng),進(jìn)而減少阻塞性黃疸大鼠腎氧化應(yīng)激損傷。

倫理學(xué)聲明：本研究方案于2021年3月經(jīng)由天津市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院(天津市南開(kāi)醫(yī)院)審批,批號(hào):NKYY-DWLL-2021-102,符合實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物管理與使用準(zhǔn)則。

利益沖突聲明：本文不存在任何利益沖突。

作者貢獻(xiàn)聲明：劉軍艦負(fù)責(zé)課題設(shè)計(jì),資料分析,撰寫(xiě)論文;陳帥、許艷參與實(shí)驗(yàn)操作及數(shù)據(jù)分析;袁紅霞、張西波參與修改論文;李忠廉負(fù)責(zé)擬定寫(xiě)作思路,指導(dǎo)撰寫(xiě)文章并最后定稿。