王 銘, 徐建虎,2, 馬 麗,2

1 寧夏醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)學(xué)院, 銀川 750004; 2 寧夏少數(shù)民族醫(yī)藥現(xiàn)代化教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 銀川 750004

隨著人們生活水平的提高,“酒精濫用”和“酒精依賴(lài)”成為普遍現(xiàn)象,酒精性肝病(alcoholic liver disease, ALD)的發(fā)病率也逐年上升,已成為僅次于病毒性肝炎的第二大肝病[1]。ALD是由于長(zhǎng)期大量飲酒導(dǎo)致肝臟代謝障礙的疾病,初期表現(xiàn)為酒精性脂肪肝,繼而向酒精性肝炎、肝纖維化、肝硬化、肝癌危重癥轉(zhuǎn)變[2]。據(jù)統(tǒng)計(jì),因飲酒導(dǎo)致的肝病占我國(guó)肝癌死亡總數(shù)的35.5%[3],因此ALD的防治為當(dāng)前亟待解決的問(wèn)題。ALD的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜多樣[4],其中乙醇在代謝過(guò)程中產(chǎn)生的氧化應(yīng)激反應(yīng)是導(dǎo)致ALD發(fā)生發(fā)展的一個(gè)主要因素[5]。Kelch樣ECH相關(guān)蛋白1(Kelch-like ECH-associated protein 1, Keap1)/核轉(zhuǎn)錄因子E2相關(guān)因子2(nuclear factor erythroid 2 related factor 2, Nrf2)信號(hào)通路在調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激反應(yīng)中發(fā)揮著極為重要的作用,可通過(guò)調(diào)節(jié)下游因子的表達(dá),保護(hù)機(jī)體免受氧化應(yīng)激損傷[6]。相關(guān)研究[7-8]表明,上調(diào)Nrf2或促進(jìn)Nrf2核移位可防治ALD的發(fā)生發(fā)展。因此,以Keap1/Nrf2信號(hào)通路為切入點(diǎn),將可能成為ALD防治的新靶點(diǎn)。

大多數(shù)醫(yī)家認(rèn)為ALD早期應(yīng)以“濕熱論治”,以健脾化濕、清熱利濕為主要治法[9-12]。本課題組結(jié)合多年的臨床經(jīng)驗(yàn)認(rèn)為,單從“濕熱論治”并不完全符合ALD早期的發(fā)病機(jī)制,“肝氣不疏,氣滯血瘀”“酒毒傷肝,毒損肝絡(luò)”強(qiáng)調(diào)“瘀血”在ALD的發(fā)病中也同樣起著關(guān)鍵作用。因此,在“濕熱論治”的基礎(chǔ)上提出“活血調(diào)肝”的治法,并以葛花解酲湯為基礎(chǔ)方進(jìn)行化裁,組方丹葛解酲湯。前期研究[13]表明,丹葛解酲湯可降低丙二醛的含量,升高超氧化物歧化酶水平,對(duì)ALD大鼠起到抗氧化的作用,但其對(duì)ALD的防治機(jī)制尚不能全面揭示。本研究在此基礎(chǔ)上,以Keap1/Nrf2信號(hào)通路為視角,觀(guān)察其相關(guān)蛋白及mRNA的表達(dá)水平,進(jìn)一步闡明丹葛解酲湯干預(yù)ALD的分子機(jī)制,為其防治ALD提供理論支持及實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)SD大鼠96只,雌雄各半,體質(zhì)量180～220 g,購(gòu)自寧夏醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心[實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào):SCXK(寧)2020-0001;實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào):SYXK(寧)2020-0001],所有動(dòng)物飼養(yǎng)于SPF動(dòng)物房中。

1.2 藥物 丹葛解酲湯由丹參(15 g)、葛根(15 g)、柴胡(10 g)、黃芩(10 g)、茯苓(10 g)、白術(shù)(10 g)、澤瀉(10 g)、陳皮(10 g)、川芎(10 g)、枸杞(5 g)、白芍(5 g)、枳實(shí)(5 g)、當(dāng)歸(5 g)、山楂(5 g)、干姜(5 g)、黨參(5 g)、砂仁(5 g)組成。方中所有藥材均購(gòu)自寧夏醫(yī)科大學(xué)附屬回醫(yī)中醫(yī)院門(mén)診部。將上述藥材加10倍水浸泡1 h,大火煮沸后小火煎煮1 h,紗布過(guò)濾,收集藥液。再加8倍水煮沸后煎煮1 h,收集藥液。將兩次藥液混合,濃縮至含生藥3 g/mL,冷藏儲(chǔ)存?zhèn)溆?。益肝靈片(吉林紫鑫藥業(yè)股份有限公司,批號(hào):Z22025133,規(guī)格:每片含水飛薊素以水飛薊賓計(jì)為21 mg)。56度紅星二鍋頭(北京紅星股份有限公司,批號(hào):SC11511160310087)。

1.3 主要試劑及儀器 蘇木素染色液(珠海貝索生物技術(shù)有限公司,批號(hào):BA-4041);伊紅染液(珠海貝索生物技術(shù)有限公司,批號(hào):BA-4024);亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)胞核與胞漿蛋白抽提試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司,批號(hào):AR0106);抗體Keap1(美國(guó)Affinity公司,批號(hào):AF5266);Nrf2(美國(guó)Affinity公司,批號(hào):AF0639);血紅素氧合酶1(heme oxygenase-1, HO-1)(美國(guó)Affinity公司,批號(hào):AF5393);內(nèi)參β-actin(美國(guó)Affinity公司,批號(hào):AF7018),Lamin B1(美國(guó)Affinity公司,批號(hào):AF5161);石蠟切片機(jī)(德國(guó)萊卡,型號(hào):RM2135);電泳儀(北京六一公司,型號(hào):DYCZ-24DN);核酸蛋白定量?jī)x(美國(guó)丹諾爾,型號(hào):DS-11);熒光定量PCR儀(BIO-RAD,型號(hào):CFX ConnectTM)。

1.4 方法

1.4.1 建立模型 采用計(jì)算機(jī)隨機(jī)數(shù)字法將96只SD大鼠隨機(jī)分為空白組(n=13)和ALD組(n=83),ALD組參照文獻(xiàn)[14]將56度紅星二鍋頭用純水兌至含40%酒精濃度的白酒,按照10 mL/kg的劑量每日分2次進(jìn)行灌胃造模(灌胃時(shí)間為上午8時(shí)和下午4時(shí)),連續(xù)8周。ALD組大鼠造模過(guò)程中死亡15只,8周結(jié)束后,存活68只。每組隨機(jī)選取3只大鼠,HE染色觀(guān)察肝臟病理學(xué)變化,以肝臟出現(xiàn)明顯的病理變化為ALD模型復(fù)制成功的評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)。

1.4.2 分組及干預(yù) 采用隨機(jī)數(shù)字法將存活A(yù)LD大鼠分為模型組、益肝靈片組、丹葛解酲湯(以下簡(jiǎn)稱(chēng)中藥)低劑量組和中藥高劑量組,每組各17只。其中選用益肝靈片作為陽(yáng)性對(duì)照組,因其主要成分為水飛薊素,具有抗氧化的作用,與本研究中Keap1/Nrf2通路的作用相一致。分別給予益肝靈片藥液(21 mg/kg)和丹葛解酲湯藥液低(6 g/kg)、高(24 g/kg)劑量灌胃(給藥劑量按照成人與大鼠體表面積換算,益肝靈片劑量等于成人等效劑量,中藥高、低劑量分別相當(dāng)于成人等效劑量的2倍、0.5倍)?？瞻捉M和模型組給予同體積的生理鹽水灌胃,每日1次,連續(xù)4周。

1.4.3 樣本收集 實(shí)驗(yàn)12周結(jié)束后,各組大鼠禁食不禁水12 h,用1.5%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉,心臟采血,血液在室溫靜置一段時(shí)間后,3 000 r/min,離心15 min,取上清,于-80 ℃冰箱保存。取血結(jié)束后,摘取肝臟,取肝大葉部分組織置于4%多聚甲醛固定液中,其余分裝入凍存管中,液氮速凍,-80 ℃冰箱保存,待檢。

1.4.4 一般情況觀(guān)察 實(shí)驗(yàn)過(guò)程中觀(guān)察各組大鼠精神狀態(tài)、活動(dòng)情況、大小便是否正常、毛色是否光澤。每周測(cè)量1次體質(zhì)量。

1.4.5 HE染色觀(guān)察肝臟病理學(xué)變化 將肝組織從多聚甲醛中取出,經(jīng)沖水、梯度酒精脫水、透明、浸蠟、包埋等步驟后,制成切片,烤片65 ℃,4.5 h。進(jìn)行脫蠟、梯度酒精脫水、蘇木精染色、分化液分化、伊紅染色、透明、封片。光學(xué)顯微鏡下觀(guān)察肝組織病理學(xué)變化并拍照。

1.4.6 Western Blot檢測(cè)肝組織中Keap1、Nrf2、HO-1蛋白表達(dá)量 將50 mg肝組織加RIPA裂解液,4 ℃過(guò)夜裂解,離心取上清,測(cè)定蛋白濃度。另取0.1 g肝組織亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)胞核與胞漿蛋白抽提試劑盒提取細(xì)胞核蛋白,測(cè)定蛋白濃度。根據(jù)蛋白定量的結(jié)果,加入相應(yīng)體積的總蛋白樣品與4×上樣緩沖液,95 ℃變性10 min,室溫平衡。將樣品加入配好的凝膠孔中,50V進(jìn)行SDS-PAGE電泳,后濕轉(zhuǎn)至PVDF膜上,5%脫脂奶粉封閉2 h,分別在孵育盒中孵育一抗Keap1(1∶1 200)、Nrf2(1∶1 200)、HO-1(1∶1 000),4 ℃反應(yīng)過(guò)夜。孵育二抗,常溫90 min。ECL試劑盒曝光膠片,將膠片掃描后,用Image J軟件測(cè)定條帶灰度值。Keap1、HO-1以β-actin為內(nèi)參,Nrf2以L(fǎng)amin B1為內(nèi)參。蛋白表達(dá)量=蛋白灰度值/內(nèi)參灰度值。

1.4.7 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)肝臟組織中Keap1、HO-1 mRNA表達(dá)水平 用Trizol提取肝組織中總RNA,逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)。將樣品放入實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò)增儀中預(yù)變性95 ℃ 15 min后,95 ℃變性10 s、退火30 s、72 ℃延伸30 s,40個(gè)循環(huán)。用Keap1、HO-1基因引物和β-actin內(nèi)參基因引物(表1)進(jìn)行擴(kuò)增。同時(shí)在60～95 ℃進(jìn)行溶解曲線(xiàn)分析利用PCR儀繪出擴(kuò)增曲線(xiàn),進(jìn)行結(jié)果分析。

表1 引物序列

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠一般情況觀(guān)察 實(shí)驗(yàn)過(guò)程中,灌胃造模期間由于灌胃手法操作不當(dāng)以及酒精中毒導(dǎo)致大鼠死亡15只,灌酒后大鼠普遍出現(xiàn)精神萎靡、反應(yīng)遲緩、嗜睡、毛色發(fā)黃等癥狀,個(gè)別大鼠出現(xiàn)渾身癱軟、步履蹣跚、眼眶出血及大便稀的癥狀?？瞻捉M大鼠精神狀態(tài)良好,反應(yīng)靈敏,食欲大小便均正常。在藥物干預(yù)期間,模型組大鼠精神萎靡、行動(dòng)遲緩、反應(yīng)遲鈍。與模型組相比,益肝靈片組大鼠精神狀態(tài)逐步好轉(zhuǎn);中藥低劑量大鼠尿量增多、精神狀態(tài)逐步好轉(zhuǎn);中藥高劑量組大鼠尿量增多、體質(zhì)量減輕、精神狀態(tài)逐步好轉(zhuǎn)。

2.2 各組大鼠肝臟病理學(xué)變化 空白組大鼠肝細(xì)胞排列有序,無(wú)炎性細(xì)胞浸潤(rùn),無(wú)壞死,以中心靜脈為中心肝細(xì)胞呈放射狀排列;模型組大鼠肝細(xì)胞排列紊亂,出現(xiàn)肝細(xì)胞壞死,有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn),并伴有大量的脂滴空泡。與模型組相比,益肝靈片組肝細(xì)胞排列整齊,少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn),未見(jiàn)脂滴空泡;中藥低劑量組細(xì)胞排列稍變整齊,少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn),偶見(jiàn)脂滴空泡;中藥高劑量組肝組織結(jié)構(gòu)基本正常,肝細(xì)胞排列整齊,偶見(jiàn)炎性細(xì)胞,未見(jiàn)脂滴空泡(圖1)。

2.3 各組大鼠肝組織中Keap1、Nrf2、HO-1蛋白表達(dá)量 與空白組相比,模型組Keap1蛋白表達(dá)量明顯升高(P<0.05),Nrf2、HO-1蛋白表達(dá)量明顯降低(P值均<0.05)。與模型組相比,益肝靈片組、中藥低劑量組和中藥高劑量組Keap1蛋白表達(dá)量均降低,Nrf2、HO-1蛋白表達(dá)量均升高,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.05)(表2,圖2)。

表2 各組大鼠Keap1、Nrf2、HO-1蛋白表達(dá)量比較

注:a,空白組;b,模型組;c,益肝靈片組;d,中藥低劑量組;e,中藥高劑量組。

2.4 各組大鼠肝組織中Keap1、HO-1 mRNA表達(dá)水平 與空白組相比,模型組Keap1 mRNA表達(dá)水平顯著升高(P<0.05),HO-1 mRNA表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)。與模型組相比,益肝靈片組、中藥低劑量組和中藥高劑量組Keap1 mRNA表達(dá)水平均降低,HO-1 mRNA表達(dá)水平均升高,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.05)(表3)。

表3 各組大鼠Keap1、HO-1 mRNA表達(dá)水平比較

3 討論

ALD歸屬于中醫(yī)“傷酒”“脅痛”“酒癖”“酒疸”“酒臌”等范疇?！吨T病源候論·惡酒候》曰:“酒者,水谷之精也,其氣慓悍而有大毒。入于胃則胃脹氣逆,上逆于胸,內(nèi)蘸于肝膽,故令肝浮膽橫”,指出酒為有毒之邪,易傷及脾胃、肝膽?！堆C論·臟腑病機(jī)論》曰“木之性主于疏泄,食氣入胃,全賴(lài)肝木之氣以疏泄之,則水谷乃化。設(shè)肝之清陽(yáng)不升,不能疏泄水谷,滲瀉中滿(mǎn)之證在所不免”,指出肝的疏泄功能在脾胃運(yùn)化中起到關(guān)鍵作用。同時(shí),肝以血為體,以氣為用。嗜酒過(guò)度,導(dǎo)致濕熱酒毒之邪蘊(yùn)結(jié)于體內(nèi),損肝傷脾,肝失疏泄則氣滯血瘀,脾失健運(yùn)則痰濕內(nèi)生。再者“毒損肝絡(luò)”理論的提出,更加突出了“瘀血”在ALD發(fā)生發(fā)展中的關(guān)鍵作用,酒毒傷肝,肝絡(luò)受損,肝脈不暢,氣滯血瘀,日久則酒毒、濕熱、瘀血聚積肝絡(luò),進(jìn)一步加重肝絡(luò)損傷。據(jù)此,本課題組以理氣健脾、分消酒濕的葛花解酲湯為主方進(jìn)行化裁,以葛根為君藥,葛根味甘、辛,發(fā)散解肌,可疏散酒邪?，F(xiàn)代研究[15]表明,葛根的解酒效果優(yōu)于葛花。山楂消除酒食之積;柴胡、川芎疏肝氣,陳皮、砂仁、枳實(shí)行脾胃之氣;澤瀉、茯苓滲濕利水,使酒濕從小便而出;丹參、當(dāng)歸補(bǔ)血活血;共為臣藥。黨參、白術(shù)補(bǔ)中健脾,干姜溫脾化飲;白芍、枸杞柔肝養(yǎng)肝;黃芩清肝膽濕熱;共為佐藥。諸藥合用,共行分消酒濕、理氣健脾、活血調(diào)肝之效。

本研究采用酒精攝入方式誘導(dǎo),即酒精灌胃法建立ALD大鼠模型,通過(guò)HE染色顯示模型組大鼠肝細(xì)胞排列紊亂,出現(xiàn)肝細(xì)胞壞死,有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn),并伴有大量的脂滴空泡,表明造模成功。通過(guò)對(duì)大鼠的一般情況、HE染色結(jié)果進(jìn)行觀(guān)察,發(fā)現(xiàn)丹葛解酲湯可在不同程度上改善大鼠的一般情況及病理變化,且以高劑量組改善效果顯著。

ALD是涉及脂質(zhì)代謝受損、肝細(xì)胞損傷、炎癥反應(yīng)、抗氧化以及纖維化的慢性疾病[16]。氧化應(yīng)激被認(rèn)為是ALD進(jìn)展的重要促成因素。Nrf2是細(xì)胞內(nèi)抗氧化應(yīng)激反應(yīng)的主要調(diào)節(jié)劑,其有助于控制氧化還原穩(wěn)態(tài)。研究[16]表明Nrf2激活在ALD的細(xì)胞保護(hù)和脂質(zhì)代謝中起著至關(guān)重要的作用。Keap1是Nrf2最主要的調(diào)節(jié)蛋白之一,可以對(duì)Nrf2進(jìn)行負(fù)調(diào)節(jié)。在正常情況下,Nrf2與內(nèi)源性抑制劑Keap1在細(xì)胞質(zhì)中結(jié)合,處于非活性狀態(tài),并通過(guò)泛化素-蛋白酶途徑迅速降解[17]。在受到氧化應(yīng)激刺激后,Nrf2與Keap1解體,活化的Nrf2轉(zhuǎn)入細(xì)胞核,與Maf蛋白形成異質(zhì)二聚體,Nrf2-Maf異質(zhì)二聚體再與抗氧化反應(yīng)元件結(jié)合,調(diào)控下游靶蛋白(如抗氧化蛋白HO-1),發(fā)揮抗氧化作用[18]。Keap1/Nrf2信號(hào)通路在機(jī)體抗氧化應(yīng)激損傷、維系體內(nèi)“氧化-抗氧化系統(tǒng)”穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮著極其重要的作用,且與ALD氧化應(yīng)激損傷的病理生理密切關(guān)聯(lián)[19-20]。另外,該信號(hào)通路通過(guò)加強(qiáng)抗氧化物和解毒酶基因的表達(dá),保護(hù)肝細(xì)胞免受脂質(zhì)過(guò)氧化的損傷[21]。HO-1是Keap1/Nrf2信號(hào)通路下游的靶蛋白,也是強(qiáng)大的細(xì)胞保護(hù)酶之一,在抗氧化中起著關(guān)鍵作用[22]。HO-1可催化血紅素降解為膽綠素、一氧化碳和鐵離子。膽綠素通過(guò)膽綠素還原酶進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為膽紅素,膽綠素和膽紅素作為內(nèi)源性活性氧的有效清除劑,可抑制氧化應(yīng)激反應(yīng),減輕肝細(xì)胞損傷[23]。越來(lái)越多的證據(jù)表明Keap1/Nrf2信號(hào)通路是治療肝臟疾病的關(guān)鍵藥理靶點(diǎn)。本研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)丹葛解酲湯干預(yù)后,Keap1蛋白表達(dá)明顯下調(diào),而Nrf2、HO-1蛋白表達(dá)明顯上調(diào),表明該信號(hào)通路明顯被激活。結(jié)合前期丙二醛含量下降,超氧化物歧化酶水平上升的研究結(jié)果[13],提示丹葛解酲湯可抑制Keap1表達(dá),促使Nrf2入核,激活下游HO-1的表達(dá),發(fā)揮抗氧化的作用,從而減輕ALD大鼠的肝組織損傷。

綜上所述,丹葛解酲湯可能通過(guò)調(diào)節(jié)Keap1/Nrf2通路,促使Nrf2入核,激活HO-1的表達(dá),減輕氧化應(yīng)激反應(yīng),進(jìn)而對(duì)ALD大鼠起到保護(hù)作用。同時(shí)也為丹葛解酲湯及活血調(diào)肝法應(yīng)用于臨床提供了科學(xué)依據(jù)。

倫理學(xué)聲明：本研究方案于2022年4月7日經(jīng)由寧夏醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審批,批號(hào):IACUC-NYLAC-2021-119,符合實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物管理與使用準(zhǔn)則。

利益沖突聲明：本文不存在任何利益沖突。

作者貢獻(xiàn)聲明：王銘負(fù)責(zé)實(shí)驗(yàn)操作,整理數(shù)據(jù),撰寫(xiě)文章;徐建虎負(fù)責(zé)指導(dǎo)實(shí)驗(yàn)和寫(xiě)作,分析數(shù)據(jù);馬麗負(fù)責(zé)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì),數(shù)據(jù)分析,擬定寫(xiě)作思路,修改文章及定稿。