陳明月, 鄭秀良, 喬亞琴, 沈海濤, 路 燕

安徽醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院消化內(nèi)科, 合肥 230601

近年來藥物性肝損傷發(fā)病率逐漸上升,日益受到人們的關(guān)注。引起藥物性肝損傷的原因較多,例如中草藥、抗菌藥、非甾體類抗炎藥等,且可能在正常劑量使用下引起藥物性肝損傷[1],嚴(yán)重的可導(dǎo)致急性肝衰竭甚至需要肝移植[2],因此藥物性肝損傷也逐漸引起全球公共衛(wèi)生系統(tǒng)關(guān)注并成為加重肝病醫(yī)療系統(tǒng)經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)的因素之一[3]。對(duì)乙酰氨基酚(Acetaminophen, APAP)是引起藥物性肝損傷的主要病因之一,也是導(dǎo)致急性肝衰竭的重要原因[4-5]。肝臟再生對(duì)肝損傷修復(fù)和預(yù)后極為關(guān)鍵,藥物性肝損傷后肝再生失敗可能會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的后果[6-7]。Toll樣受體4(TLR4)是模式識(shí)別受體的一種,主要參與機(jī)體免疫和炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)[8],但Marlini等[9]研究發(fā)現(xiàn),TLR4可能對(duì)肝臟修復(fù)和再生過程有影響。與野生型小鼠相比,C3H/HeJ小鼠(TLR4基因發(fā)生錯(cuò)義突變而導(dǎo)致TLR4表達(dá)缺陷型小鼠[10])行部分肝臟切除術(shù)后肝臟重量恢復(fù)和肝細(xì)胞增殖所需時(shí)間明顯延長(zhǎng)。TLR4是否在APAP引起的肝損傷過程肝臟再生中發(fā)揮作用,目前研究甚少。TAK-242是目前較常用的小分子TLR4抑制劑,可以特異性阻斷TLR4信號(hào)傳導(dǎo)[11]。因此,本研究利用TAK-242來初步探索TLR4在APAP肝損傷過程肝臟再生中的作用,以期為研究肝再生機(jī)制以及藥物性肝損傷治療提供新的見解。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 APAP(HY-66005)、TAK-242(HY-11109)購買于中國(guó)MedChemExpress公司;DMSO(D8371)購買于北京索萊寶科技有限公司;ALT檢測(cè)試劑盒(C009-2-1)購買于南京建成生物工程研究所;RT-PCR逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(R-202)、SYBR Green染料(Q204)購買于新貝生物科技有限公司;Trizol(15596026)購買于美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司;GAPDH抗體(TA-08)、免疫組化試劑盒(SP-9001)、DAB顯色試劑盒(ZLI-9018)購買于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司;4%多聚甲醛組織固定液(BL539A)購買于中國(guó)白鯊生物科技有限公司;PCNA抗體(2586)、Ki-67抗體(12202)、STAT3抗體(9139)和p-STAT3抗體(9145)購買于美國(guó)Cell Signaling Technology公司;Cyclin D1抗體(26939-1-AP)購買于武漢三鷹生物技術(shù)有限公司;WB超敏顯影液(K-12043-D10)購買于美國(guó)Advansta公司;引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。

1.2 動(dòng)物分組及造模 雄性CD-1(ICR)小鼠78只,6～8周齡,購買于維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司[生產(chǎn)許可證編號(hào):SCXK(浙)2019-0001;使用許可證編號(hào):SYXK(皖)2017-006]。采用隨機(jī)數(shù)字表法將小鼠分為9組:對(duì)照組(正常對(duì)照組、溶劑對(duì)照組、抑制劑對(duì)照組)每組6只,實(shí)驗(yàn)組(APAP 24 h組、TAK-242+APAP 24 h組、APAP 48 h組、TAK-242+APAP 48 h組、APAP 72 h組、TAK-242+APAP 72 h組)每組10只。APAP溶液用生理鹽水配置,TAK-242溶液用0.5% DMSO配置。所有小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后再進(jìn)行造模。給藥前所有小鼠禁食12 h。實(shí)驗(yàn)組小鼠給予單劑量腹腔注射APAP(300 mg/kg),TAK-242在APAP注射前3 h以3 mg/kg劑量腹腔注射于相應(yīng)組小鼠(劑量參照文獻(xiàn)[12-13])。正常對(duì)照組小鼠腹腔注射與APAP組等體積生理鹽水,抑制劑對(duì)照組小鼠注射與實(shí)驗(yàn)組小鼠等體積TAK-242溶液,溶劑對(duì)照組小鼠注射與抑制劑對(duì)照組等體積的0.5% DMSO溶液。在注射APAP后24 h、48 h、72 h麻醉后處理小鼠,收集小鼠血液和肝臟并及時(shí)冷凍保存,以便進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 血清ALT檢測(cè) 將血液樣本在室溫下靜置2 h,3 000 r/min離心20 min,將血清轉(zhuǎn)移至另一EP管保存。按照ALT檢測(cè)試劑盒說明測(cè)定ALT水平。

1.3.2 肝臟組織病理觀察 使用4%多聚甲醛組織固定液對(duì)肝左葉進(jìn)行固定,按照常規(guī)步驟進(jìn)行脫水、浸蠟、包埋和切片。將肝組織切片進(jìn)行HE染色,然后在顯微鏡下觀察組織損傷情況并進(jìn)行拍照。

1.3.3 RT-PCR檢測(cè)mRNA水平 取40 mg肝組織放入玻璃研磨器中,同時(shí)加入1 mL Trizol,在冰上充分研磨,經(jīng)過氯仿、異丙醇、75%乙醇萃取、沉淀和洗滌等步驟,提取總RNA。檢測(cè)RNA濃度后,按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA。以GAPDH為內(nèi)參,使用RT-PCR方法檢測(cè)并以2-△△Ct法計(jì)算PCNA、Ki-67、Cyclin D1的mRNA水平。引物序列見表1。

表1 RT-PCR引物序列

1.3.4 Western blot檢測(cè)蛋白水平 在玻璃研磨器中加入70 mg肝臟組織及1 mL RIPA裂解液,充分研磨并經(jīng)過離心后,得到總蛋白。利用BCA法測(cè)定蛋白濃度,加入上樣緩沖液后將蛋白放在加熱器上100 ℃加熱10 min使其變性。將蛋白樣品加入到SDS-PAGE凝膠樣品孔中進(jìn)行電泳,結(jié)束后在冰上進(jìn)行轉(zhuǎn)膜,將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。室溫下使用脫脂牛奶封閉2～3 h,TBST溶液清洗3次,一抗4 ℃孵育過夜(GAPDH,1∶1 000;STAT3,1∶1 000;p-STAT3,1∶2 000;PCNA,1∶1 000;Cyclin D1,1∶5 000)。第2天PVDF洗滌干凈后,二抗室溫孵育1 h。最后顯影,使用Image J進(jìn)行灰度值分析。

1.3.5 免疫組化檢測(cè) 肝臟組織切片進(jìn)行常規(guī)的烘烤、脫蠟、水化,使用檸檬酸鈉進(jìn)行抗原修復(fù),然后阻斷內(nèi)源性過氧化物酶,經(jīng)過封閉后,一抗(Ki-67,1∶300)4 ℃孵育過夜。第2天室溫下復(fù)溫30 min,洗滌后二抗孵育45 min。DAB顯色,最后使用中性樹膠封片并拍照。

2 結(jié)果

2.1 觀察抑制劑和溶劑對(duì)正常小鼠肝臟的影響 結(jié)果顯示,正常對(duì)照組、溶劑對(duì)照組和抑制劑對(duì)照組小鼠血清ALT水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(圖1),且與正常對(duì)照組相比,溶劑對(duì)照組和抑制劑對(duì)照組小鼠的肝臟HE染色未發(fā)現(xiàn)明顯的病理改變(圖2)。

圖1 小鼠血清ALT水平比較

2.2 抑制TLR4可能延遲APAP誘導(dǎo)的肝損傷過程中肝臟的恢復(fù) APAP 24 h組和APAP 48 h組血清ALT水平均明顯高于正常對(duì)照組(P值均<0.05),而TAK-242+APAP 24 h組及TAK-242+APAP 48 h組的ALT水平明顯高于同時(shí)間點(diǎn)APAP組(P值均<0.05);小鼠肝組織HE染色結(jié)果顯示,正常對(duì)照組小鼠肝小葉結(jié)構(gòu)清晰,肝細(xì)胞排列整齊,APAP處理的小鼠肝臟可見典型的小葉中心性壞死。與相同時(shí)間點(diǎn)APAP組相比,TAK-242+APAP 24 h組和TAK-242+APAP 48 h組小鼠肝臟壞死面積明顯較大(P值均<0.05)(表2、3,圖3)。

注:a,正常對(duì)照組;b,溶劑對(duì)照組;c,抑制劑對(duì)照組。

2.3 抑制TLR4下調(diào)肝臟Cyclin D1、PCNA、Ki-67的mRNA水平和蛋白表達(dá) APAP 48 h組和APAP72 h 組Cyclin D1、PCNA、Ki-67 mRNA水平均明顯高于正常對(duì)照組(P值均<0.05),APAP 24 h組PCNA mRNA水平顯著高于正常對(duì)照組(P<0.05);TAK-242+APAP 24 h組、TAK-242+APAP 48 h組和TAK-242+APAP 72 h組的Cyclin D1、PCNA mRNA水平均低于同時(shí)間點(diǎn)APAP組,TAK-242+APAP 24 h組和TAK-242+APAP 72 h組的Ki-67 mRNA水平均低于同時(shí)間點(diǎn)APAP組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.05)(表4、5)。Western blot檢測(cè)Cyclin D1、PCNA蛋白表達(dá)結(jié)果顯示,TAK-242+APAP 24 h組和TAK-242+APAP 48 h組的Cyclin D1、PCNA蛋白表達(dá)明顯低于同時(shí)間點(diǎn)APAP組(P值均<0.05)(圖4)。免疫組化染色及Ki-67陽性細(xì)胞累積光密度值比較結(jié)果顯示,APAP 48 h組和APAP 72 h組Ki-67蛋白表達(dá)顯著高于正常對(duì)照組(P值均<0.05),而TAK-242+APAP 24 h組、TAK-242+APAP 48 h組及TAK-242+APAP 72 h組的Ki-67蛋白表達(dá)明顯低于同時(shí)間點(diǎn)APAP組(P值均<0.05)(圖5、6)。

表2 APAP對(duì)小鼠血清ALT及肝臟組織的影響

表3 抑制TLR4在各時(shí)間點(diǎn)對(duì)APAP肝損傷小鼠血清ALT及肝臟組織的影響

表4 APAP對(duì)小鼠肝組織Ki-67 mRNA、Cyclin D1 mRNA、PCNA mRNA表達(dá)的影響

注:a,正常對(duì)照組;b,APAP 24 h組;c,TAK-242+APAP 24 h組;d,APAP 48 h組;e,TAK-242+APAP 48 h組;f,APAP 72 h組;g,TAK-242+APAP 72 h組。

表5 抑制TLR4對(duì)小鼠肝組織Ki-67 mRNA、Cyclin D1 mRNA、PCNA mRNA表達(dá)的影響

注:a,Cyclin D1蛋白表達(dá)水平;b,PCNA蛋白表達(dá)水平。

圖6 各組Ki-67陽性細(xì)胞累積光密度值比較

2.4 抑制TLR4下調(diào)p-STAT3水平 課題組前期體外研究[14]發(fā)現(xiàn),STAT3在APAP肝損傷后肝細(xì)胞再生過程中發(fā)揮重要作用,為探索TLR4參與肝臟再生過程是否與STAT3有關(guān),應(yīng)用Western blot方法檢測(cè)STAT3蛋白磷酸化(p-STAT3)水平。結(jié)果顯示,APAP 24 h組和APAP 48 h組p-STAT3水平均顯著高于正常對(duì)照組(P值均<0.01),而TAK-242+APAP 24 h組及TAK-242+APAP 48 h組p-STAT3水平均明顯低于同時(shí)間點(diǎn)APAP組(P值均<0.05)(圖7)。

圖7 肝組織STAT3磷酸化蛋白的表達(dá)

3 討論

肝臟是具有極強(qiáng)再生能力的器官,也是唯一能夠在被部分/大部分切除后恢復(fù)原有重量的內(nèi)臟器官[15]。據(jù)報(bào)道[16],存在肝臟炎癥和肝細(xì)胞壞死的肝臟疾病都可能發(fā)生肝再生,包括藥物性肝損傷。N-乙酰半胱氨酸(NAC)是最常用于治療藥物性肝損傷的藥物,特別是對(duì)于APAP肝損傷,治療效果較好。但是NAC的治療時(shí)間窗較短,對(duì)晚期發(fā)現(xiàn)的肝損傷治療效果較差,甚至長(zhǎng)時(shí)間高劑量使用NAC會(huì)不利于APAP肝損傷恢復(fù)[17]。在毒性化學(xué)物引起的肝損傷中,肝損傷和再生是此消彼長(zhǎng)的關(guān)系。一項(xiàng)急性肝損傷的動(dòng)態(tài)研究[18]發(fā)現(xiàn),在輕度急性肝損傷小鼠體內(nèi),肝損傷進(jìn)展時(shí),肝再生也在增強(qiáng),當(dāng)肝再生強(qiáng)于肝損傷,即開始進(jìn)入恢復(fù)階段;而在重度肝損傷小鼠模型中,肝再生一開始即受到抑制,因肝再生速度不及損傷的速度,損傷加速進(jìn)展,造成小鼠死亡。據(jù)報(bào)道[19-20],在APAP肝損傷中,明顯的肝再生發(fā)現(xiàn)在24 h以后,因此本研究選擇分別于24 h、48 h和72 h處死小鼠。

TLR4是一種跨膜多功能分子,可以與來自細(xì)胞內(nèi)外的配體結(jié)合,在肝、腎、心、肺、皮膚等多個(gè)器官和組織中表達(dá),參與炎癥反應(yīng)、免疫調(diào)控和組織修復(fù)等過程[21]。有研究[22]報(bào)道,早期阻斷TLR4可以預(yù)防腎小管壞死和急性腎損傷,但是在愈合期阻斷TLR4會(huì)導(dǎo)致IL-22生成減少,從而損害腎再生。與野生型小鼠相比,TLR4敲除的小鼠對(duì)博來霉素引起的肺損傷更敏感,肺泡上皮損傷也更嚴(yán)重,Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞增殖數(shù)較少[23]。最近一項(xiàng)研究[24]發(fā)現(xiàn),在行部分肝切除術(shù)小鼠體內(nèi),TLR4與脂多糖結(jié)合可以激活肝細(xì)胞轉(zhuǎn)化,促進(jìn)肝再生。TLR4敲除小鼠行部分肝切除術(shù)后,細(xì)胞增殖指標(biāo)Ki-67和PCNA的表達(dá)明顯受到抑制。本文利用TLR4特異性抑制劑TAK-242進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn),與24 h和48 h的APAP組相比,使用抑制劑組處理的小鼠ALT水平和肝臟壞死面積恢復(fù)均較慢,這表明抑制TLR4可能會(huì)阻礙APAP肝損傷過程肝臟的修復(fù)。進(jìn)一步檢測(cè)再生相關(guān)指標(biāo)發(fā)現(xiàn),在APAP誘導(dǎo)小鼠肝損傷中,抑制TLR4后小鼠肝臟的Cyclin D1、PCNA和Ki-67 mRNA及蛋白水平均下降,提示TLR4可能參與APAP肝損傷過程中肝再生,并對(duì)肝再生起到一定的促進(jìn)作用。

STAT3是細(xì)胞增殖和組織再生過程的重要分子,在肝臟再生過程中發(fā)揮重要作用。在行部分肝切除術(shù)的小鼠體內(nèi),STAT3信號(hào)通路激活增加,肝細(xì)胞STAT3特異性敲除的小鼠肝臟再生會(huì)受到抑制[25-26]。此外,在四氯化碳誘導(dǎo)的肝損傷小鼠模型中發(fā)現(xiàn),STAT3表達(dá)顯著增加,抑制STAT3后,肝臟增殖指標(biāo)表達(dá)明顯降低[27]。在本研究過程中,筆者發(fā)現(xiàn)與正常對(duì)照組相比,APAP 24 h組和APAP 48 h組STAT3磷酸化水平明顯升高,但同時(shí)間點(diǎn)TAK-242+APAP組STAT3磷酸化水平降低,這提示p-STAT3可能參與了TLR4在APAP肝損傷中促進(jìn)肝臟再生的過程。

肝臟再生的機(jī)制比較復(fù)雜,涉及的分子及通路眾多。本研究?jī)H對(duì)TLR4在APAP肝損傷過程肝再生中的作用進(jìn)行了初步探討,更深層的機(jī)制有待課題組后期進(jìn)一步研究。

綜上所述,TLR4可能通過STAT3信號(hào)通路對(duì)APAP誘導(dǎo)的小鼠肝損傷過程中的肝臟再生起到一定的促進(jìn)作用。

倫理學(xué)聲明：本研究方案于2018年3月經(jīng)由安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審批,批號(hào):LLSC20180080,符合實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物管理與使用準(zhǔn)則。

利益沖突聲明：本文不存在任何利益沖突。

作者貢獻(xiàn)聲明：陳明月負(fù)責(zé)分析數(shù)據(jù),撰寫論文和參與課題設(shè)計(jì);鄭秀良、喬亞琴、沈海濤參與實(shí)驗(yàn)操作和修改論文;路燕負(fù)責(zé)課題設(shè)計(jì)和修改論文。