付春山, 馮笑梅, 遲秀梅, 訾 君, 牛俊奇, 張專(zhuān)才

1內(nèi)蒙古自治區(qū)國(guó)際蒙醫(yī)醫(yī)院 a.消化一科,b.檢驗(yàn)科, 呼和浩特 010013; 2 吉林大學(xué)第一醫(yī)院感染性疾病及病原生物學(xué)中心基因治療實(shí)驗(yàn)室, 長(zhǎng)春 130061; 3 吉林大學(xué)第一醫(yī)院感染性疾病及病原生物學(xué)中心肝病科, 長(zhǎng)春 130012

1977年意大利學(xué)者Rizzetto等[1]首次用免疫熒光法在慢性乙型肝炎患者的肝細(xì)胞核內(nèi)發(fā)現(xiàn)一種新的病毒抗原,并稱(chēng)為δ因子。1984年將該種因子正式命名δ抗原(hepatitis D antigen, HDAg),其病毒分子被命名為丁型肝炎病毒(HDV),所致疾病則被稱(chēng)為丁型肝炎。同時(shí)感染會(huì)引起大范圍的肝壞死,以及嚴(yán)重的、暴發(fā)性的肝炎,病死率較高。大部分同時(shí)感染的患者能夠清除兩種病毒,只有少于5%的患者會(huì)發(fā)展成慢性丁型肝炎(CHD);雙重感染較HBV單感染以及HBV、HDV同時(shí)感染,引起更快的硬化過(guò)程,肝癌發(fā)生率也更高。大多數(shù)雙重感染的患者通常無(wú)法清除HDV,90%的患者會(huì)發(fā)展成CHD[2-5]。 隨著對(duì)HDV研究的越來(lái)越深入,丁型肝炎與乙型肝炎的關(guān)系被闡明的較為清楚,近年來(lái)也出現(xiàn)了一些丁型肝炎的治療藥物[6-8]。各大公司競(jìng)相在中國(guó)進(jìn)行丁型肝炎的藥物臨床試驗(yàn)。內(nèi)蒙古自治區(qū)毗鄰蒙古國(guó),而蒙古國(guó)又是世界上丁型肝炎發(fā)病率極高的國(guó)家。因此,有必要對(duì)內(nèi)蒙古自治區(qū)蒙古族聚集區(qū)人群的HDV感染情況進(jìn)行研究。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象 收集2019年4月—2020年10月在內(nèi)蒙古自治區(qū)國(guó)際蒙醫(yī)醫(yī)院就診的乙型肝炎表面抗原(HBsAg)陽(yáng)性患者的血清標(biāo)本,記錄性別、年齡、民族、HBsAg定量等信息。根據(jù)患者基本信息將患者分為乙型肝炎合并肝硬化組和乙型肝炎組;根據(jù)HBsAg水平將患者分為HBsAg<250 IU/mL組和HBsAg≥250 IU/mL組。收集檢驗(yàn)剩余血清約1 mL凍存于-80 ℃冰箱備用。

1.2 患者入選標(biāo)準(zhǔn) 根據(jù)研究方案(JDYY-HDV V3)的規(guī)定,從醫(yī)院收集相應(yīng)的標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)需要滿足以下條件:(1)年齡≥ 18歲,男女不限;(2)既往診斷為慢性HBV感染(即HBsAg陽(yáng)性≥ 3個(gè)月);(3)肝硬化(包括代償期和失代償期肝硬化)。肝硬化的評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)如下:(1)基于活檢的肝硬化證據(jù),要求Metavir評(píng)分為4,或Ishak評(píng)分為5～6。(2)若無(wú)活檢結(jié)果,患者應(yīng)滿足以下標(biāo)準(zhǔn)之一,①腹水;②肝性腦病;③靜脈曲張破裂出血。以上標(biāo)準(zhǔn)需排除因非肝硬化性門(mén)靜脈高壓導(dǎo)致的腹水、肝性腦病或上消化道出血。(3)如果上述標(biāo)準(zhǔn)均未滿足,患者應(yīng)滿足以下4個(gè)標(biāo)準(zhǔn)中的任意兩項(xiàng),①顯示肝硬化特征的成像圖為肝臟表面不規(guī)則,肝實(shí)質(zhì)顆?；蚪Y(jié)節(jié)狀,腹腔內(nèi)側(cè)支循環(huán)或靜脈曲張,伴或不伴脾大(脾厚超過(guò)4.0 cm或大于5個(gè)肋單元);②PLT <100×109/L;③ALT<5倍正常值上限時(shí),測(cè)得肝硬度>12 kPa;④內(nèi)鏡顯示胃食管靜脈曲張。

1.3 設(shè)備與材料 HBsAg檢測(cè)采用i2000全自動(dòng)免疫發(fā)光儀(美國(guó)雅培公司)。HDV抗體(HDV-IgM、HDV-IgG)采用ELISA法檢測(cè)(北京萬(wàn)泰生物藥業(yè)股份有限公司)。全自動(dòng)核酸提取儀磁珠法進(jìn)行病毒核酸提取;HDV核酸(HDV RNA)采用實(shí)時(shí)定量PCR方法,購(gòu)買(mǎi)RoboGene 2.0 HDV RNA檢測(cè)試劑盒(德國(guó)RoboScreen診斷試劑公司)。

酶標(biāo)儀/洗板機(jī)(美國(guó)ThermoFisher公司),全自動(dòng)免疫發(fā)光儀(美國(guó)Abbott公司),核酸提取儀(山東見(jiàn)微),PCR儀(美國(guó)BioRad公司),實(shí)時(shí)定量PCR儀(美國(guó)ABI7500)。

1.4 HDV抗體檢測(cè) 采用北京萬(wàn)泰生物HDV-IgM和HDV-IgG試劑盒進(jìn)行血清樣本中HDV抗體檢測(cè)。按照說(shuō)明書(shū)加樣孵育30 min后洗板,加酶標(biāo)試劑30 min后洗板,顯色15 min后用雙波長(zhǎng)450/600 nm檢測(cè)吸光度值。

1.5 核酸提取 利用全自動(dòng)核酸提取儀按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行HDV病毒核酸提取。購(gòu)買(mǎi)山東見(jiàn)微預(yù)分裝核酸提取試劑Ⅰ套盒,將血清標(biāo)本200 μL加入試劑盒A2～H2 列或者A8～H8列中,設(shè)置好固定運(yùn)行程序進(jìn)行核酸提取。核酸提取物體積80 μL備用。

1.6 病毒核酸定量檢測(cè) 所有抗體陽(yáng)性的標(biāo)本進(jìn)行HDV RNA檢測(cè)。按照RoboGene 2.0 HDV RNA試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品濃度計(jì)算核酸濃度,檢測(cè)下限為6 IU/mL。

1.7 基因分型和系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建 將核酸檢測(cè)陽(yáng)性的標(biāo)本進(jìn)行分型檢測(cè),分型采用PCR方法,采用引物序列為F:5′-CATGCCGACCCGAAGAGGAAAG-3′;R:5′-GAAGGAAGGCCCTCGAGAACAAGA-3′,擴(kuò)增后進(jìn)行測(cè)序分析。利用BioEdit軟件進(jìn)行運(yùn)算和分析,用MEGA 6.0軟件neighbor-joining方法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)進(jìn)行基因分型。參照序列均從GeneBank下載。

2 結(jié)果

2.1 一般資料 共納入230例HBsAg陽(yáng)性患者,其中乙型肝炎合并肝硬化患者18例,乙型肝炎患者212例;平均年齡(46.5±14.2)歲。

2.2 丁型肝炎抗體檢測(cè) 將230份標(biāo)本進(jìn)行丁型肝炎抗體檢測(cè),HDV-IgM陽(yáng)性32例,HDV-IgG陽(yáng)性37例(16.09%),并且所有IgM陽(yáng)性的標(biāo)本都包含在IgG陽(yáng)性標(biāo)本中。18份肝硬化的標(biāo)本中HDV-IgG陽(yáng)性8份,占肝硬化標(biāo)本的44.44%。同時(shí)又將HBsAg結(jié)果進(jìn)行了分層分析,HBsAg<250 IU/mL組共104份標(biāo)本,其中僅3份標(biāo)本HDV-IgG為陽(yáng)性,陽(yáng)性率為2.88%(3/104),這3份標(biāo)本表面抗原定量分別為246、104、23IU/mL。HBsAg≥250IU/mL組共126份標(biāo)本,其中有34份檢測(cè)出HDV-IgG陽(yáng)性,陽(yáng)性率為26.98%(34/126)(表1)。 肝硬化組與乙型肝炎組HDV-IgG陽(yáng)性率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=16.157,P<0.05);HBsAg<250 IU/mL和HBsAg≥250 IU/mL兩組HDV-IgG陽(yáng)性率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=55.082,P<0.05)。

2.3 HDV定量檢測(cè) 將HDV-IgG陽(yáng)性的37份標(biāo)本提取核酸,并進(jìn)行HDV RNA定量檢測(cè)。其中34份檢測(cè)出HDV RNA陽(yáng)性,總標(biāo)本HDV RNA陽(yáng)性率為91.89%(34/37),肝硬化組HDV RNA陽(yáng)性率為100%(8/8),HBsAg<250 IU/mL組HDV RNA陽(yáng)性率為33.33%(1/3),而HBsAg≥250 IU/mL組HDV RNA陽(yáng)性率為97.06%(33/34)(表1)。 HBsAg<250 IU/mL和HBsAg≥250 IU/mL兩組HDV RNA陽(yáng)性率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=37.132,P<0.05)。

表1 患者基本信息

2.4 HDV分型檢測(cè)及系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù) 將HDV RNA陽(yáng)性的34份標(biāo)本進(jìn)行HDV分型測(cè)定。其中7例因病毒定量很低而無(wú)法獲得分型數(shù)據(jù),其余27例均測(cè)得分型為1型(圖1)。

圖1 HDV分型系統(tǒng)樹(shù)

3 討論

目前常用于HDV檢測(cè)的標(biāo)志物包括:HDAg、HDV-IgM/IgG、HDV RNA?？乖瓩z測(cè)在實(shí)際應(yīng)用中意義較小[9-10],抗體檢測(cè)應(yīng)用比較廣泛。HDV感染可以刺激具有免疫能力的患者的固有免疫和適應(yīng)性免疫,從而產(chǎn)生抗體HDV-IgM和HDV-IgG[6]。HDV-IgM一般在出現(xiàn)HDV感染癥狀后的2～3周后出現(xiàn)。對(duì)于同時(shí)感染的患者來(lái)說(shuō),HDV-IgM一般會(huì)在急性感染2個(gè)月后消失;對(duì)于雙重感染的患者來(lái)說(shuō),HDV-IgM可能會(huì)持續(xù)存在9個(gè)月左右[3]。HDV-IgG存在于已從 HDV急性感染中康復(fù),或發(fā)展成HDV慢性感染的患者血漿中[3],故HDV-IgG陽(yáng)性常代表患者處于康復(fù)或慢性感染階段[6]。本試驗(yàn)中所有HDV-IgM陽(yáng)性標(biāo)本均包含在HDV-IgG陽(yáng)性標(biāo)本中,而人群的自然感染史并不十分清楚,所以猜測(cè)在慢性持續(xù)狀態(tài)下可能兩種抗體是持續(xù)存在的。HDV抗體陽(yáng)性還需要采用金標(biāo)準(zhǔn)——HDV RNA檢測(cè)來(lái)進(jìn)一步確認(rèn)HDV感染。常用的檢測(cè)方法為定量或半定量實(shí)時(shí)PCR法。RoboGene HDV RNA檢測(cè)試劑盒是目前國(guó)際公認(rèn)的檢測(cè)效能最高的試劑盒。

丁型肝炎流行的地區(qū)性差異比較大,高流行率的地區(qū)包括蒙古、亞馬遜流域、中非、中歐和東歐等[11]。很多國(guó)家沒(méi)有完善的丁型肝炎流行病學(xué)的調(diào)查,理論上,HBsAg陽(yáng)性的人群都應(yīng)檢測(cè)HDV抗體,但實(shí)際全世界HDV檢測(cè)率總體水平不高。英國(guó)的檢測(cè)率為40%～90%,希臘約為35%,美國(guó)約為5%。

Roggenbach等[12]對(duì)內(nèi)蒙古就診的HBsAg陽(yáng)性患者進(jìn)行HDV初步篩查,HDV IgG陽(yáng)性率為13.94%(35/251)。對(duì)其中抗體陽(yáng)性患者進(jìn)行HDV核酸復(fù)測(cè),檢出率為97.14%(34/35), HDV RNA陽(yáng)性率為13.55%(34/251)。前期在內(nèi)蒙古收集的標(biāo)本中有來(lái)源于其他漢族人口集中居住區(qū)的標(biāo)本,篩查結(jié)果均為陰性。本文描述的都是國(guó)際蒙醫(yī)醫(yī)院就診的蒙古族或蒙古國(guó)的患者,其陽(yáng)性率較其他地區(qū)高,提示內(nèi)蒙古自治區(qū)的HDV流行呈現(xiàn)區(qū)域化分布。內(nèi)蒙古自治區(qū)接壤的蒙古共和國(guó),是目前已知的HDV流行率最高的地區(qū),HDV RNA在HBsAg陽(yáng)性患者中的陽(yáng)性率高達(dá)56.91%(70/123)[13-15],內(nèi)蒙古自治區(qū)毗鄰蒙古國(guó),地理位置接近,生活習(xí)慣相似,這可能是造成內(nèi)蒙古自治區(qū)流行率較高的原因。因此有必要對(duì)內(nèi)蒙古自治區(qū)人群進(jìn)一步行丁型肝炎發(fā)病情況的分析。

本研究發(fā)現(xiàn),總體丁型肝炎抗體陽(yáng)性率達(dá)到16.09%。進(jìn)一步分層分析顯示,肝硬化患者標(biāo)本HDV-IgG陽(yáng)性率高達(dá)44.44%,驗(yàn)證了重疊感染能夠加速病情的發(fā)展。電話隨訪1年的結(jié)果顯示,有十余人已因肝硬化或肝癌去世,這就更進(jìn)一步驗(yàn)證了此結(jié)論。而對(duì)HBsAg水平進(jìn)行分層分析發(fā)現(xiàn),HBsAg<250 IU/mL組中僅有3例抗體檢測(cè)陽(yáng)性,其中2例HBsAg定量很接近250 IU/mL。這說(shuō)明HBsAg定量與丁型肝炎的感染具有相關(guān)性。

在對(duì)HDV RNA的進(jìn)一步檢測(cè)中發(fā)現(xiàn),整體HDV RNA陽(yáng)性率較高(91.89%)。肝硬化組HDV RNA陽(yáng)性率為100%,HBsAg≥250 IU/mL組HDV RNA陽(yáng)性率為97.06%。說(shuō)明內(nèi)蒙古自治區(qū)HDV感染情況較為嚴(yán)重,HDV RNA檢測(cè)率極高。此外,HDV分型檢測(cè)結(jié)果顯示,內(nèi)蒙古自治區(qū)HDV分型主要為1型。

綜上,內(nèi)蒙古自治區(qū)HDV感染率較高,尤其在肝硬化人群及HBsAg≥250 IU/mL的人群中感染率更高。針對(duì)該部分人群應(yīng)該加大力度進(jìn)行丁型肝炎的篩查,盡早發(fā)現(xiàn)隱藏的丁型肝炎患者,做到早診斷早治療,為早日清除肝病的目標(biāo)貢獻(xiàn)力量。

倫理學(xué)聲明：本研究經(jīng)由吉林大學(xué)第一醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn),批號(hào):19K056-001。所有患者均簽署知情同意書(shū)。

利益沖突聲明：本文不存在任何利益沖突。

作者貢獻(xiàn)聲明：付春山負(fù)責(zé)患者資料收集,撰寫(xiě)論文;馮笑梅負(fù)責(zé)標(biāo)本收集及論文審閱;遲秀梅、訾君負(fù)責(zé)標(biāo)本檢測(cè),資料分析,撰寫(xiě)論文;張專(zhuān)才、?？∑尕?fù)責(zé)課題設(shè)計(jì),論文審閱并最后定稿。