王 揚(yáng), 廖 昊 , 鄧中平, 趙 景, 卞丹丹, 任 艷, 蔣瑩瑩, 劉 霜, 陳 煜,魯鳳民, 段鐘平, 鄭素軍

1 首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京佑安醫(yī)院肝病中心, 北京 100069; 2 國(guó)家感染性疾病臨床研究中心,南方科技大學(xué)第二附屬醫(yī)院(深圳市第三人民醫(yī)院) 檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)部, 廣州 深圳 518112; 3 北京大學(xué)前沿交叉學(xué)科研究院, 北京 100871; 4 基因診斷技術(shù)湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 長(zhǎng)沙 410205; 5 首都醫(yī)科大學(xué)電力教學(xué)醫(yī)院感染性疾病科, 北京 100073; 6 北京大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)系暨感染病中心, 北京 100191

HBV感染是慢性乙型肝炎(CHB)、肝硬化、肝衰竭和肝細(xì)胞癌的主要致病因素[1],全世界約2.92億人感染HBV[2]。近年來(lái)雖然新藥不斷研發(fā),抗病毒藥物作用不斷完善,但CHB的徹底治愈依然是臨床難題之一[3]。對(duì)于HBeAg陽(yáng)性的CHB患者,現(xiàn)實(shí)的治療目標(biāo)是達(dá)到HBeAg陰轉(zhuǎn)并進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)血清學(xué)轉(zhuǎn)換,這不僅反映了機(jī)體部分免疫學(xué)控制,并且是CHB患者獲得臨床治愈的先決條件[4-5]。不同的研究[6-9]表明,在接受核苷(酸)類似物或干擾素治療的CHB患者中,基線HBV DNA、HBV RNA、HBcrAg和HBsAg水平可能與HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換相關(guān)。然而,使用單一某種病毒學(xué)標(biāo)志物預(yù)測(cè)HBeAg血清轉(zhuǎn)換可能存在局限性[8,10]。因此,本研究對(duì)基線HBV DNA、HBV RNA、HBcrAg和HBsAg聯(lián)合預(yù)測(cè)CHB患者核苷(酸)類似物治療過(guò)程中HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換的能力進(jìn)行了評(píng)估。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象 回顧性分析2007年6月—2008年7月首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京佑安醫(yī)院疑難肝病及人工肝中心組建的CHB患者隊(duì)列的臨床數(shù)據(jù)。符合入組條件的病例連續(xù)入組,納入標(biāo)準(zhǔn):(1)年齡≥16歲;(2)CHB診斷及治療標(biāo)準(zhǔn)符合《慢性乙型肝炎防治指南》[11];(3)同意接受核苷(酸)類似物長(zhǎng)期治療;(4)HBeAg陽(yáng)性。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)其他原因造成的活動(dòng)性肝病或合并其他病毒感染,包括:HCV、HDV、HIV,或存在自身免疫性肝病;(2)除乙型肝炎外有其他重大身心疾病,如嚴(yán)重心臟病、腎臟疾病等;(3)腎功能下降(肌酐清除率<50 mL/min)需要減少藥物使用劑量者;(4)依從性差者;(5)既往惡性腫瘤病史,包括肝細(xì)胞癌、原位癌和肝臟不典型增生結(jié)節(jié),不行肝移植術(shù)預(yù)期壽命少于1年者;(6)精神疾病患者;(7)入組前6個(gè)月接受皮質(zhì)類固醇藥物、免疫抑制劑和化療藥物者;(8)女性妊娠、哺乳者。

1.2 血液生化、病毒學(xué)指標(biāo)檢測(cè) 肝功能、生化等檢測(cè)由首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京佑安醫(yī)院檢驗(yàn)中心完成,使用自動(dòng)生化檢測(cè)器(AU640生化分析儀,OLYMPUS,日本)進(jìn)行ALT和AST等生化指標(biāo)的測(cè)定。應(yīng)用電化學(xué)發(fā)光免疫測(cè)定法(Abbott Laboratories,Chicago,IL,USA),在Roche Cobas e601分析儀上測(cè)定血清HBsAg、抗-HBs、HBeAg、抗-HBe和抗-HBc。使用Elecsys(Roche Diagnostics)對(duì)HBsAg進(jìn)行定量,最低檢測(cè)下限為0.05 IU/mL。使用Cobas HBV Amplicor Monitor測(cè)定法(Roche Diagnostics, Pleasanton, CA, USA)測(cè)定血清HBV DNA水平,最低檢測(cè)下限為50 IU/mL。

1.3 HBV RNA、HBcrAg定量檢測(cè) 采用湖南圣湘HBV RNA定量檢測(cè)試劑盒(PCR-熒光探針?lè)?,具體操作參照文獻(xiàn)[8,12-14]。操作過(guò)程簡(jiǎn)述如下:HBV RNA用核酸提取純化試劑盒(湖南圣湘,長(zhǎng)沙,中國(guó))分離,用200 μL血清通過(guò)磁珠法提取核酸。然后通過(guò)DNase Ⅰ處理去除HBV DNA模板,反應(yīng)體系包含2 μL DNase Ⅰ反應(yīng)緩沖液(10×),2 μL DNAse Ⅰ(不含RNase)和16 μL核酸。在37 ℃下反應(yīng)30 min,之后將每種混合物在75 ℃孵育10 min以滅活DNase I。最后,使用HBV pgRNA高靈敏定量技術(shù)對(duì)HBV RNA進(jìn)行一步逆轉(zhuǎn)錄和實(shí)時(shí)熒光定量PCR,測(cè)定的最低下限為200拷貝/mL。在自動(dòng)分析系統(tǒng)中使用化學(xué)發(fā)光酶免疫測(cè)定法檢測(cè)HBcrAg水平(Lumipulse System,Fujirebio Inc.,Tokyo,Japan),測(cè)定的最低下限為1000 U/mL,線性范圍為3～7 log10U/mL。

2 結(jié)果

2.1 一般資料 研究共納入83例HBeAg陽(yáng)性CHB患者,平均年齡(36.42±9.78)歲,其中男性68例(81.93%);39例患者取得基因型數(shù)據(jù),其中基因B型5例,基因C型29例,其他基因型5例。中位隨訪時(shí)間108個(gè)月(范圍18～138個(gè)月),44.58%(37/83)的患者發(fā)生HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換,HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換中位時(shí)間為126個(gè)月(95%CI:92.16～159.84)?；颊咭话阗Y料詳見(jiàn)表1。

2.2 基線病毒學(xué)標(biāo)志物聯(lián)合評(píng)分及血清標(biāo)志物之間的相關(guān)性分析 使用基線血清病毒學(xué)標(biāo)志物HBsAg、HBV DNA、HBV RNA和HBcrAg構(gòu)建Cox回歸方程預(yù)測(cè)HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換,聯(lián)合預(yù)測(cè)評(píng)分=exp(-0.187 5×HBsAg-0.010 8×HBV DNA-0.275 8×HBV RNA-0.053 4×HBcrAg),中位數(shù)為0.95(范圍0.37～3.45)。在所納入患者中,聯(lián)合評(píng)分與HBsAg、HBV DNA、HBV RNA和HBcrAg呈負(fù)相關(guān),相關(guān)系數(shù)分別為-0.697、-0.787、-0.990和-0.819(P值均<0.001)。

2.3 基線病毒學(xué)標(biāo)志物聯(lián)合預(yù)測(cè)HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換的時(shí)間依賴性AUC分析 血清標(biāo)志物聯(lián)合評(píng)分預(yù)測(cè)36個(gè)月、60個(gè)月及84個(gè)月時(shí)HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換的AUC分別為0.86(95%CI:0.74～0.99)、0.79(95%CI:0.64～0.94)和0.84(95%CI:0.70～0.98)(表2)。

基于基線病毒學(xué)標(biāo)志物聯(lián)合預(yù)測(cè)評(píng)分中位值,將高于中位值評(píng)分患者納入高HBeAg轉(zhuǎn)換組,低于中位值評(píng)分患者納入低HBeAg轉(zhuǎn)換組,兩組平均轉(zhuǎn)換時(shí)間分別為68.46個(gè)月(95%CI:53.66～83.26)和113.60個(gè)月(95%CI:101.27～125.92)。預(yù)測(cè)36個(gè)月、60個(gè)月及84個(gè)月時(shí)高轉(zhuǎn)換組HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換率分別為43.90%、51.20%和63.10%,低轉(zhuǎn)換組分別為9.60%、17.00%和19.80%,兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=11.6,P<0.001)。

3 討論

既往研究表明,血清病毒學(xué)標(biāo)志物HBV DNA、HBV RNA、HBcrAg和HBsAg定量不僅可以反映cccDNA復(fù)制活躍程度,并且與組織學(xué)變化相關(guān)[15],在預(yù)測(cè)核苷(酸)類似物治療過(guò)程中早期病毒耐藥[16]、抗病毒治療應(yīng)答[6-7]及評(píng)估核苷(酸)類似物停藥后復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)方面[13,17]具有潛在的臨床應(yīng)用價(jià)值。本研究結(jié)果表明,基線血清病毒學(xué)標(biāo)志物HBsAg、HBV DNA、HBV RNA和HBcrAg聯(lián)合預(yù)測(cè)評(píng)分可以預(yù)測(cè)CHB患者核苷(酸)類似物治療過(guò)程中HBeAg的血清學(xué)轉(zhuǎn)換,并對(duì)患者血清學(xué)轉(zhuǎn)換的可能性進(jìn)行高低分層。

本研究結(jié)果中有3個(gè)方面值得注意。第一,與HBeAg未轉(zhuǎn)換患者相比較,發(fā)生HBeAg轉(zhuǎn)換者基線血清病毒學(xué)標(biāo)志物HBV DNA和HBV RNA水平顯著更低。這與其他真實(shí)世界HBeAg陽(yáng)性CHB患者核苷(酸)類似物抗病毒治療長(zhǎng)期隨訪隊(duì)列研究結(jié)果類似[10,18]。第二,聯(lián)合評(píng)分與各病毒學(xué)標(biāo)志物之間呈現(xiàn)較強(qiáng)的負(fù)相關(guān)性,可能與各病毒學(xué)標(biāo)志物均轉(zhuǎn)錄于cccDNA有關(guān)[14,19-20]。同時(shí)提示聯(lián)合預(yù)測(cè)評(píng)分對(duì)于各標(biāo)志物的替代性良好,且評(píng)分越高,發(fā)生血清學(xué)轉(zhuǎn)換的可能性越高。第三,在長(zhǎng)期核苷(酸)類似物抗病毒治療CHB患者中,聯(lián)合使用血清病毒學(xué)標(biāo)志物對(duì)患者進(jìn)行HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換分層預(yù)測(cè),對(duì)患者進(jìn)行個(gè)體化的管理策略具有潛在的臨床應(yīng)用價(jià)值。本研究中Kaplan-Meier分析結(jié)果顯示,低HBeAg轉(zhuǎn)換組患者累積轉(zhuǎn)換率較低,其治療持續(xù)時(shí)間預(yù)期較長(zhǎng)。相反,高HBeAg轉(zhuǎn)換組患者持續(xù)治療時(shí)間可能較短,對(duì)于HBeAg轉(zhuǎn)換可能性高的患者,若有停藥需求,可以考慮在有限療程后停藥。同時(shí),有隨機(jī)對(duì)照研究[21-22]表明,核苷(酸)類似物治療基礎(chǔ)上聯(lián)合干擾素治療可能增加HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換概率。對(duì)于本研究中高轉(zhuǎn)換組患者增加干擾素治療是否為較優(yōu)的治療策略尚待研究。

表1 患者基線臨床特征

表2 基線病毒學(xué)標(biāo)志物聯(lián)合預(yù)測(cè)36、60和84個(gè)月HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換的時(shí)間依賴性AUC分析

綜上所述,基線血清HBV標(biāo)志物HBsAg、HBV DNA、HBV RNA和HBcrAg聯(lián)合可以預(yù)測(cè)CHB患者核苷(酸)類似物治療中HBeAg的血清學(xué)轉(zhuǎn)換,并可以實(shí)現(xiàn)對(duì)患者進(jìn)行血清學(xué)轉(zhuǎn)換分層。未來(lái)仍需要不同中心進(jìn)一步研究驗(yàn)證及改進(jìn)。

倫理學(xué)聲明：本研究方案于2019年5月20日經(jīng)由首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京佑安醫(yī)院倫理委員會(huì)審批,批號(hào):LL2018-003K。

利益沖突聲明：本文不存在任何利益沖突。

作者貢獻(xiàn)聲明：王揚(yáng)負(fù)責(zé)整理、統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)并撰寫稿件;廖昊、鄧中平給予試驗(yàn)平臺(tái)及負(fù)責(zé)試驗(yàn)操作;趙景、卞丹丹、任艷、蔣瑩瑩負(fù)責(zé)臨床數(shù)據(jù)及血清樣本的收集和整理;劉霜、陳煜負(fù)責(zé)管理項(xiàng)目實(shí)施;魯鳳民、段鐘平、鄭素軍負(fù)責(zé)課題設(shè)計(jì),嚴(yán)格審閱及修訂稿件并最后定稿。