李棟梁,王景飛,周穎怡,陳業(yè)光,張?chǎng)╂?戚華沙,陳 宣*

(1.海南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 熱帶園藝研究所,海南省熱帶特種經(jīng)濟(jì)植物種質(zhì)資源創(chuàng)新利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,海南 海口 571100;2.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 藥用植物研究所海南分所,海南省南藥資源保護(hù)與開(kāi)發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,海南 海口 570311)

0 引言

【研究意義】檳榔(ArecacatechuL.)是棕櫚科檳榔屬熱帶亞熱帶經(jīng)濟(jì)作物,為我國(guó)四大南藥之一,具有較高的經(jīng)濟(jì)效益。海南省檳榔種植面積約20萬(wàn)hm2,收獲面積10萬(wàn)hm2,總產(chǎn)量55萬(wàn)～60萬(wàn)t,產(chǎn)值260億元以上,檳榔是海南省東部、中部和南部農(nóng)民增加收入的重要途徑[1]。然而,檳榔病蟲(chóng)害的發(fā)生制約了檳榔產(chǎn)業(yè)的發(fā)展,尤以黃化病的發(fā)生影響最重[2-4]。因此,建立檳榔離體保存技術(shù),可從源頭上降低病菌、防止優(yōu)良種質(zhì)退化,有利于保護(hù)檳榔優(yōu)良種質(zhì)資源,也有利于種質(zhì)資源惠益分享和創(chuàng)新利用?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】檳榔種質(zhì)資源豐富多樣,一般按果形分為長(zhǎng)橢圓形、橢圓形、球形、卵形、倒卵形和心臟形等6類,不同檳榔品種果實(shí)口感及化學(xué)成分存在差異[3]。檳榔為單株單桿植物,主要靠種子育苗繁殖,但存在種子發(fā)芽慢、發(fā)芽不整齊且易感病菌等問(wèn)題。棕櫚科植物組培快繁技術(shù)屬于世界難題,目前僅油棕、海棗獲得突破[5-6],椰子的組培技術(shù)有初步研究[7-8]。我國(guó)針對(duì)檳榔離體培養(yǎng)研究方面的報(bào)道較少。黃麗云等[9]將檳榔幼胚離體培養(yǎng)分為4個(gè)階段,篩選出不同階段培養(yǎng)基,其中,MS培養(yǎng)基對(duì)檳榔種子芽組培生長(zhǎng)促進(jìn)作用效果較好,對(duì)根的誘導(dǎo)和生長(zhǎng)也有效果。黃麗云等[10]研究表明,以檳榔幼胚為外植體,最佳培養(yǎng)基配方組合為MS培養(yǎng)基+4 g/L活性炭+40 g/L蔗糖?！狙芯壳腥朦c(diǎn)】檳榔作為我國(guó)熱帶地區(qū)重要的經(jīng)濟(jì)作物之一,其組培技術(shù)瓶頸尚待破解,目前尚未建立成熟的組培體系[11-12]?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】以檳榔種子作為試驗(yàn)材料,研究檳榔外植體消毒、芽誘導(dǎo)培養(yǎng)、芽增殖培養(yǎng)及生根壯苗培養(yǎng),建立檳榔的離體繁殖技術(shù)體系,為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用檳榔資源及其保護(hù)提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

成熟健康的檳榔果實(shí)采自海南省熱帶作物標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)示范園(海南農(nóng)墾榮光農(nóng)場(chǎng)有限公司樂(lè)東千家檳榔生產(chǎn)基地),檳榔樹(shù)齡20年。將成熟健康的檳榔果實(shí)在流水下沖洗干凈并晾干,置于100 mg/L IAA中浸泡24 h備用。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 外植體消毒 將預(yù)處理完的檳榔果在流水下沖洗,然后放置于稀釋的洗潔精液浸泡搖蕩6 min,自來(lái)水沖洗干凈,裝入無(wú)菌水瓶中振蕩15 min,轉(zhuǎn)速為120 r/min。在超凈工作臺(tái)上用無(wú)菌濾紙吸干表面水分,用75%酒精消毒10 s,再用酒精燈燒10 s去皮取種子。種子消毒設(shè)置5個(gè)處理,即于0.1% HgCl2溶液中分別浸泡2 min、5 min、8 min、10 min和15 min,浸泡完畢后無(wú)菌水沖洗5次,并用無(wú)菌紙吸干表面水分,備用。

1.2.2 芽的誘導(dǎo) 以MS為基礎(chǔ)培養(yǎng)基,以細(xì)胞分裂素6-BA和生長(zhǎng)素NAA為試驗(yàn)因子,6-BA設(shè)置5個(gè)濃度梯度(1.0 mg/L、2.0 mg/L、3.0 mg/L、4.0 mg/L、5.0 mg/L),NAA設(shè)置4個(gè)濃度梯度(0.2 mg/L、0.35 mg/L、0.5 mg/L、0.70 mg/L),進(jìn)行不同濃度配比的芽誘導(dǎo)正交試驗(yàn),將消毒后的外植體分別接種至不同濃度配比的6-BA和NAA培養(yǎng)基中,每個(gè)處理50個(gè)外植體,重復(fù)3次,每10 d觀察統(tǒng)計(jì)芽誘導(dǎo)情況,30 d后統(tǒng)計(jì)萌芽率和污染率。

萌芽率=未污染的萌芽種子數(shù)/(接種的種子數(shù)-污染的種子數(shù))×100%

污染率=(污染的種子數(shù)/接種的種子數(shù))×100%

1.2.3 芽的增殖 選取長(zhǎng)約1.5 cm的萌芽作為試材,在MS培養(yǎng)基中添加濃度分別為1.0 mg/L、2.0 mg/L、3.0 mg/L的6-BA與濃度分別為0.2 mg/L、0.6 mg/L的NAA溶液,每處理50個(gè)萌芽,定期觀察,培養(yǎng)30 d后統(tǒng)計(jì)增殖系數(shù),篩選增殖培養(yǎng)最佳的6-BA與NAA配比。

增殖系數(shù)=總數(shù)/接種數(shù)

1.2.4 生根培養(yǎng) 在MS培養(yǎng)基中分別添加濃度為0.00 mg/L、1.00 mg/L、1.50 mg/L、2.00 mg/L、3.00 mg/L NAA,待種芽萌發(fā)約5 cm后直接轉(zhuǎn)接到生根培養(yǎng)基中。每處理50株,定期觀察,培養(yǎng)30 d后統(tǒng)計(jì)生根數(shù)和生根率,篩選生根最佳的NAA濃度。

生根率=生根苗數(shù)/接種苗數(shù)×100%

平均根數(shù)=根總數(shù)/生根苗數(shù)

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 25.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同消毒時(shí)間檳榔種子的消毒效果

從表1看出,HgCl2消毒2～5 min的檳榔種子污染率為38%～46%,萌芽率達(dá)100%;當(dāng)消毒時(shí)間延長(zhǎng)至8 min時(shí),污染率降至36%,萌芽率略降,為94.82%;消毒10 min和15 min時(shí),檳榔種子污染率降至10.00%和10.67%,萌芽率降低至94.75%和85.08%。經(jīng)觀測(cè),消毒時(shí)間在2～8 min時(shí)檳榔種子接種至培養(yǎng)基上5～10 d內(nèi)露白,而消毒10 min和15 min的種子接種10 d后才陸續(xù)露白。表明,適當(dāng)?shù)南緯r(shí)間可以良好控制檳榔種子離體培養(yǎng)的污染率和萌芽率,但消毒時(shí)間過(guò)長(zhǎng)對(duì)檳榔種子會(huì)產(chǎn)生一定的毒害抑制作用。綜合比較,采用0.1% HgCl2消毒檳榔種子時(shí)間以10 min最佳。

2.2 6-BA和NAA不同濃度配比檳榔芽的誘導(dǎo)效果

從表2可知,在不同濃度配比的6-BA和NAA培養(yǎng)基中,檳榔種子均可以萌芽,但萌芽率和芽長(zhǎng)勢(shì)差異較大。在沒(méi)有添加6-BA和NAA的MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基(CK)中,檳榔種子萌芽率最低,僅28.33%,且芽長(zhǎng)勢(shì)差。在沒(méi)有添加6-BA的處理中(處理2～處理5),隨著NAA濃度的增加,萌芽率在34.00%～50.33%,呈先升后降趨勢(shì),芽長(zhǎng)勢(shì)均不理想。在沒(méi)有添加NAA的處理中(處理6、處理11、處理16、處理21、處理26),隨著6-BA濃度的增加,萌芽率在50.67%～89.00%,呈先增后降趨勢(shì),高于僅添加NAA的處理,芽長(zhǎng)勢(shì)除處理16(6-BA濃度為3.00 mg/L)生長(zhǎng)良好外,其他濃度均較差。在同時(shí)添加6-BA和NAA的處理中,6-BA濃度不變的情況下,萌芽率隨著NAA濃度增加呈先增后降趨勢(shì);NAA濃度不變的情況下,萌芽率隨著6-BA濃度升高呈先增后降趨勢(shì)。各處理組合中,6-BA濃度為3.00 mg/L與NAA不同濃度配比(處理16～處理20)的萌芽率較高,在82%～95.67%,長(zhǎng)勢(shì)均良好,以處理19的萌芽率最高。綜合比較,篩選出檳榔種子萌發(fā)最佳培養(yǎng)基為MS+3.00 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA。

表2 6-BA和NAA不同濃度配比檳榔芽的萌芽率及芽長(zhǎng)勢(shì)Table 2 Germination rate and growth vigor of areca-nut explants cultured with different concentration ratio of 6-BA and NAA

2.3 6-BA和NAA不同濃度配比檳榔芽的增殖效果

檳榔芽增殖試驗(yàn)結(jié)果表明,不同濃度6-BA與NAA組合對(duì)檳榔芽增殖無(wú)影響,增殖系數(shù)均為1,符合其植物生物學(xué)特性。

2.4 不同濃度NAA下檳榔根系的分化情況

將誘導(dǎo)出芽的檳榔種苗接種到添加有不同濃度NAA的培養(yǎng)基中進(jìn)行生根培養(yǎng),8 d后在芽的基部陸續(xù)形成不定根。從表3可知,培養(yǎng)基不添加NAA處理的檳榔種苗可以生根,生根率僅70.67%,生根數(shù)為4.33條,且12個(gè)月離體保存的苗長(zhǎng)勢(shì)一般;隨著NAA濃度逐漸升高,檳榔種苗生根率呈先升后降趨勢(shì),以添加1.00 mg/L NAA的生根率和生根條數(shù)最高,分別達(dá)95.33%和7.33條,12個(gè)月離體保存苗長(zhǎng)勢(shì)健壯。NAA其他濃度下,檳榔種苗生根率在86.67%～92.00%,生根數(shù)在4.67～6.67條,檳榔種苗12個(gè)月離體保存的長(zhǎng)勢(shì)一般或偏弱,部分在離體保存11個(gè)月出現(xiàn)葉片微黃癥狀。

表3 不同濃度NAA下檳榔根系分化及苗離體保存生長(zhǎng)狀況Table 3 Root differentiation and growth status of areca-nut seedlings under different NAA concentration

3 討論

棕櫚科植物組培快繁技術(shù)屬于世界難題,目前僅油棕、海棗獲得突破[5-6],椰子的組培技術(shù)有初步研究[7-8]。吳翼等[13]在研究椰子胚的離體培養(yǎng)過(guò)程中發(fā)現(xiàn),不同滅菌方式對(duì)離體胚的滅菌效果不同,隨著HgCl2滅菌時(shí)間延長(zhǎng),離體胚污染率降低,但褐化率升高,表現(xiàn)出消毒劑對(duì)離體胚損傷愈嚴(yán)重;當(dāng)用75%酒精表面滅菌1 min,0.15% HgCl2對(duì)胚乳滅菌20 min,0.03% HgCl2對(duì)胚滅菌10 min時(shí),消毒效果最佳,污染率僅8.0%,褐化率5.3%,成活率86.7%。檳榔種質(zhì)資源離體保存技術(shù),無(wú)菌種子的獲得比無(wú)菌胚的相對(duì)簡(jiǎn)單,而且種仁不僅可以保護(hù)幼胚不受機(jī)械或環(huán)境損傷,還可以為幼胚提供母體營(yíng)養(yǎng)。檳榔種子表面光滑,質(zhì)地堅(jiān)硬,消毒容易,但必須經(jīng)過(guò)處理才能獲得無(wú)菌種子。研究結(jié)果表明,采用0.1% HgCl2消毒檳榔種子2～15 min,隨著消毒時(shí)間延長(zhǎng),污染率和萌芽率均逐步降低,消毒時(shí)間以10 min最佳,污染率僅10%,萌芽率達(dá)94.75%。消毒時(shí)間過(guò)長(zhǎng)對(duì)檳榔種子會(huì)產(chǎn)生一定的毒害作用,這與對(duì)椰子胚的研究結(jié)果[13]基本一致。在生根培養(yǎng)研究方面,多數(shù)植物采用單一生長(zhǎng)素即可實(shí)現(xiàn),但多種生長(zhǎng)素配合使用的效果較佳,吳翼等[13]采用IBA 2.0 mg/L、NAA 2.0 mg/L與6-BA 1.0 mg/L配合使用,椰子生根效果最好,初生根2～4條,次生根和三級(jí)根較多,為煉苗移栽提供了良好的物質(zhì)基礎(chǔ)。研究表明,當(dāng)NAA濃度為1.00 mg/L時(shí),生根率和生根條數(shù)最高,分別達(dá)95.33%和7.33條,離體保存苗長(zhǎng)勢(shì)健壯。比較發(fā)現(xiàn),椰子和檳榔雖然都為棕櫚科植物,但在生根發(fā)育階段,不同種作物對(duì)激素需求種類并不一致,檳榔可以通過(guò)單一激素實(shí)現(xiàn)良好的根系分化,椰子需要通過(guò)多種激素組合才能達(dá)到最佳生根效果。

在檳榔胚離體培養(yǎng)發(fā)育過(guò)程中,胚吸器先膨大,隨后分化出芽和根。研究發(fā)現(xiàn),不同種類、不同配比的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)對(duì)植物組培快繁各個(gè)環(huán)節(jié)均有明顯影響,在不定芽誘導(dǎo)、增殖及生根培養(yǎng)中,外源激素的合理配比尤為關(guān)鍵。過(guò)低和過(guò)高的質(zhì)量濃度都會(huì)導(dǎo)致萌芽率和芽長(zhǎng)勢(shì)較差,適宜的6-BA與NAA組合才有助于萌芽、愈傷組織誘導(dǎo)與增殖。黃麗云等[14]研究表明,不同濃度6-BA與NAA配比對(duì)檳榔胚離體培養(yǎng)影響不一樣,6-BA濃度為2 mg/L對(duì)胚芽、胚根生長(zhǎng)具有明顯的促進(jìn)作用,NAA濃度為0.5 mg/L時(shí)胚根生長(zhǎng)良好,幼苗長(zhǎng)勢(shì)整齊。研究結(jié)果表明,檳榔種子芽誘導(dǎo)最優(yōu)激素組合為3.00 mg/L 6-BA+ 0.5 mg/L NAA,萌芽率高達(dá)95.67%,這與椰子繼代培養(yǎng)研究中6-BA和NAA濃度均為1.0 mg/L略有差異,說(shuō)明不同植物對(duì)激素濃度的響應(yīng)不同[13]。

4 結(jié)論

經(jīng)過(guò)HgCl2預(yù)處理后的成熟健康檳榔果實(shí),去皮取種子,采用0.1% HgCl2消毒處理10 min的效果最佳,種子污染率僅10%,萌發(fā)率達(dá)94.75%;將檳榔種子接種至MS+ 3.00 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA培養(yǎng)基中,萌芽率達(dá)95.67%,芽長(zhǎng)勢(shì)良好;將出芽的檳榔種子轉(zhuǎn)接于1.0 mg/L NAA的MS培養(yǎng)基中進(jìn)行生根培養(yǎng),生根率和生根數(shù)分別達(dá)95.33%和7.33條。建立的檳榔種質(zhì)資源離體繁殖技術(shù)操作性強(qiáng)、可行性高,可在生產(chǎn)上大力推廣應(yīng)用。