靳建剛， 田再芳， 鄭敏娜， 康佳惠

（1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)生態(tài)農(nóng)牧研究所，山西 朔州 037200； 2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)高寒區(qū)作物研究所，山西 大同 037008）

21 世紀(jì)以來，牧區(qū)家畜飼養(yǎng)量逐步減少，牛羊肉和奶類生產(chǎn)的重心逐漸向農(nóng)區(qū)和農(nóng)牧交錯(cuò)區(qū)轉(zhuǎn)移，畜牧業(yè)的這一發(fā)展趨勢(shì)極大地促進(jìn)了農(nóng)區(qū)-農(nóng)牧交錯(cuò)區(qū)人工草地的快速發(fā)展，人工草地的建設(shè)已成為草業(yè)發(fā)展中特別重要的組成部分[1]。近年來，隨著國家草產(chǎn)業(yè)政策的積極推進(jìn)，飼用燕麥（Avena sativaL.）作為一種優(yōu)質(zhì)禾本科牧草，其建立的人工草地在黃土高原農(nóng)牧交錯(cuò)區(qū)得到了較快發(fā)展，種植范圍逐步擴(kuò)大，產(chǎn)業(yè)效應(yīng)已初步顯現(xiàn)。飼用燕麥起源于地中海紅燕麥及其祖先野紅燕麥[2]，是牧區(qū)和農(nóng)牧交錯(cuò)區(qū)廣泛種植的一年生草料兼用作物，具有適應(yīng)性強(qiáng)、營養(yǎng)價(jià)值高、耐鹽堿等優(yōu)良特性[3]，主要以燕麥青（干）草、青貯燕麥和燕麥籽實(shí)等方式被家畜利用[4]，在農(nóng)牧交錯(cuò)區(qū)的畜牧業(yè)生產(chǎn)和生態(tài)經(jīng)濟(jì)建設(shè)中發(fā)揮著重要作用。相對(duì)于其他禾本科牧草，飼用燕麥具有更高的產(chǎn)量和應(yīng)用前景，相應(yīng)地也需要更加合理的營養(yǎng)水平來保障其營養(yǎng)品質(zhì)和產(chǎn)量。

在現(xiàn)階段飼用燕麥人工草地的生產(chǎn)中，施肥是草地建植和田間管理中重要的管理措施之一。當(dāng)肥料（包括無機(jī)肥和有機(jī)肥）等外源物質(zhì)輸入到土壤后，會(huì)對(duì)土壤的營養(yǎng)狀態(tài)和微生物群落產(chǎn)生顯著的影響。合理施肥不僅可以改善土壤結(jié)構(gòu)[5-7]，還可以豐富微生物群落和微生物活性[8]，提高肥料利用率[9]。然而，在生產(chǎn)中為了追求高產(chǎn)，農(nóng)戶經(jīng)常過量施用化肥，不僅嚴(yán)重污染土壤資源，影響土壤養(yǎng)分庫和微生物多樣性的可持續(xù)發(fā)展，還會(huì)威脅食品安全、影響全民健康[8]。因此，在飼草燕麥草地生產(chǎn)中，對(duì)無機(jī)肥、有機(jī)肥的施用必須找到一個(gè)平衡點(diǎn)，以實(shí)現(xiàn)干旱半干旱區(qū)飼用燕麥人工草地土壤生態(tài)系統(tǒng)的可持續(xù)發(fā)展。

目前，國內(nèi)燕麥主產(chǎn)區(qū)關(guān)于無機(jī)-有機(jī)肥配施對(duì)土壤理化性狀影響的研究較多，但對(duì)燕麥根際土壤微生物群落的研究較少。因此，為研究晉北生態(tài)區(qū)不同施肥措施對(duì)燕麥根際微生物多樣性的影響，以不同施肥處理下飼用燕麥的根際土壤微生物為研究對(duì)象，采用高通量測(cè)序技術(shù)，探討不同施肥處理下燕麥根際土壤細(xì)菌群落的多樣性及其結(jié)構(gòu)組成，并結(jié)合土壤養(yǎng)分狀況和飼用燕麥植株的生物產(chǎn)量，擬優(yōu)選出最佳施肥模式，為晉北地區(qū)燕麥飼草的種植和提質(zhì)增效提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)概況

試驗(yàn)于2021年在山西農(nóng)業(yè)大學(xué)生態(tài)農(nóng)牧研究所的野外試驗(yàn)基地（39°33′—41°14′N、113°14′—114°44′E）進(jìn)行。試驗(yàn)地是典型的北方農(nóng)牧交錯(cuò)區(qū)，海拔1 350 m，屬大陸性季風(fēng)氣候，農(nóng)業(yè)區(qū)劃為中溫帶干旱區(qū)。試驗(yàn)地耕層土壤（0—20 cm）容重1.48~1.53 g·cm-3，pH 8.46，土壤有機(jī)質(zhì)含量14.61 g·kg-1。

1.2 試驗(yàn)材料

選用飼用燕麥品種‘甜燕麥’為試驗(yàn)材料，由國家燕麥產(chǎn)業(yè)體系大同試驗(yàn)站提供。試驗(yàn)所用肥料包括常規(guī)商用化肥和自制有機(jī)肥，其中，商用化肥分別為尿素（CO（NH2）2， 含N≥46%）、過磷酸鈣（含P2O512.0%）和氯化鉀（含K2O 60.0%）；自制有機(jī)肥以牛糞為主要原料（有機(jī)質(zhì)含量16.5%），添加1%的腐熟劑處理后制成，其N、P2O5、K2O含量分別為0.046 3、 0.021 0、 0.060 1 g·kg-1。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)以不施肥處理為對(duì)照（CK），分別設(shè)置僅施用商用化肥（T2）及商用化肥與有機(jī)肥分別按照 9∶1（T3）、8∶2（T4）、7∶3（T5）、6∶4（T6）和 5∶5（T7）的比例配施，共計(jì)7個(gè)處理，每處理3次重復(fù)，總計(jì)21個(gè)小區(qū)。其中，T2處理氮、磷、鉀的施用量分別為180、90和90 kg·hm-2；T3、T4、T5、T6、T7處理氮的總用量與T2處理一致，其有機(jī)肥施用量按照配施比例計(jì)算，磷和鉀的不足部分用相應(yīng)化肥補(bǔ)足，具體施用量見表1。試驗(yàn)處理按照完全隨機(jī)的方式排列，小區(qū)面積4 m×5 m，小區(qū)間間隔1 m。

表1 試驗(yàn)各處理的肥料施用量Table 1 Specific information processed by the experiment

飼用燕麥于2021年5月25日條播，播種量150 kg·hm-2，行距25 cm，播種深度4~5 cm。各肥料均采用撒施的方式施入，其中氮肥分別于播種前和拔節(jié)期按6∶4的比例分2次施入；磷肥、鉀肥和有機(jī)肥均于播種前一次性施入。試驗(yàn)期間各小區(qū)其他管理措施基本一致，播前灌水1次，生育期內(nèi)人工除草，于乳熟期采集土壤樣品和植株樣品。

1.4 樣品采集與測(cè)定

1.4.1 株高和干草產(chǎn)量測(cè)定 于2021年8月20日（乳熟期）進(jìn)行取樣、測(cè)產(chǎn)。每個(gè)小區(qū)去除小區(qū)兩側(cè)邊行，隨機(jī)選擇10株植株，從植株主莖的地表至穗頂部（不含芒）測(cè)量株高（plant height，HP）；并隨機(jī)選擇3個(gè)2 m樣段齊地面刈割，稱其鮮重，然后于105 ℃烘箱中殺青30 min，65 ℃下烘干至恒重，測(cè)定干草產(chǎn)量（yield，Y），以kg·m-2為單位計(jì)算。

1.4.2 土壤樣品采集和測(cè)定 于2021年8月18日采集土壤樣品。各小區(qū)按對(duì)角線采樣法，每個(gè)小區(qū)選取6點(diǎn)用土鉆取0—20 cm土層樣品及植物根際0~10 mm的土樣，各樣品混勻后采用四分法取0.5 kg土樣，3次重復(fù)。取樣后，將其分為2份，1份裝入離心管液氮封存用于土壤微生物分析；另1份風(fēng)干后用于土壤pH、有機(jī)質(zhì)（soil organic matter，SOM）、全氮（total nitrogen，TN）、全磷（total phosphorus，TP）、全鉀（total potassium，TK）速效氮（available nitrogen，AN）、速 效 磷（available phosphorus，AP）、速 效 鉀（available potassium，AK）、有機(jī)碳（soil organic carbon，SOC）和可溶解性鹽（soluble salt，SS）含量等土壤理化性質(zhì)的測(cè)定，各指標(biāo)參照鮑士旦[10]的方法進(jìn)行測(cè)定。

1.4.3 土壤總DNA提取及基因擴(kuò)增 使用MN NucleoSpin 96 Soil（MN，germany）試劑盒進(jìn)行土壤細(xì)菌DNA的提取，每個(gè)樣品重復(fù)3次，采用PacBio測(cè)序平臺(tái)的通用引物（正向27F和反向1492R）以細(xì)菌16S rRNA基因全長序列（V3~V4）為目的片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增體系參照鄭敏娜等[8]的方法。擴(kuò)增合格樣品送北京百邁克生物有限公司進(jìn)行PacBio平臺(tái)測(cè)序分析。

1.5 生物信息學(xué)分析

對(duì)原始下機(jī)subreads進(jìn)行校正得到CCS（circular consensus sequencing）序列（SMRT link，version8.0），使用lima(v1.7.0)軟件得到符合要求的高質(zhì)量CCS序列，并進(jìn)行生物信息學(xué)分析。利用QIIME軟件對(duì)優(yōu)質(zhì)序列在相似性≥97%的水平上進(jìn)行 OUT（operation taxonomic unit）聚類，基于OTU分析結(jié)果，對(duì)樣品在各個(gè)分類水平上進(jìn)行分類學(xué)分析；利用Mothur v.1.30軟件和R語言工具進(jìn)行α多樣性分析[9]；利用軟件QIIME進(jìn)行β多樣性分析[9]等；通過R語言分析作圖。使用SPSS 22.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同施肥處理對(duì)土壤養(yǎng)分及飼用燕麥地上生物量的影響

不同施肥處理下飼用燕麥根際土壤理化特性和生物產(chǎn)量測(cè)定結(jié)果如表2所示。不同施肥處理對(duì)土壤全氮、速效氮和有機(jī)碳含量無顯著影響，各處理間差異不顯著；對(duì)土壤速效鉀和速效磷含量有顯著影響。各處理的速效鉀含量在189.36~298.99 mg·kg-1，其中T7處理最高，顯著高于其他處理；T4處理次之。各處理的速效磷含量在8.49~11.09 mg·kg-1，其中T4 處理最高，顯著高于其他處理；T5處理次之，但與其他處理間差異不顯著。不同施肥處理對(duì)土壤可溶解性鹽含量影響顯著，隨著有機(jī)肥施入量的增加，土壤中可溶解性鹽含量逐漸降低，其中CK顯著高于施肥處理；T4、T5、T6、T7處理間差異不顯著，但顯著低于其他處理。此外，T4處理飼用燕麥的株高為107.32 cm，顯著高于除T5處理外的其他處理；干草產(chǎn)量為9 245.52 kg·hm-2，顯著高于除T5和T6處理外的其他處理。

表2 不同處理下土壤理化性質(zhì)和干草生物量Table 2 Physical and chemical properties of soil and biomass of oats under different treatments

2.2 土壤細(xì)菌序列及其多樣性指數(shù)

利用PacBio平臺(tái)測(cè)序結(jié)果顯示，所有土壤樣品共獲得1 605 355個(gè)序列讀數(shù)，基于97%的相似性共獲得5 902個(gè)OTU，樣本文庫的覆蓋度達(dá)99.0%以上。分類學(xué)分析將細(xì)菌群落劃分為28個(gè)門，73個(gè)綱，187個(gè)目，347個(gè)科，533個(gè)屬。

從表3可知，T2和T4處理樣品中檢測(cè)到的OTU數(shù)量較CK顯著增加14.02%和9.59%。不同施肥處理下飼草燕麥根際土壤細(xì)菌群落的Ace指數(shù)和Chao 1指數(shù)分別表現(xiàn)為：T4＞T6＞T5＞T2、T3、CK和T6、T4＞T5＞T2、T3、CK；T6處理細(xì)菌群落的Shannon指數(shù)顯著高于除T7處理外的其他處理。

表3 不同改良措施處理下土壤細(xì)菌測(cè)序及群落α 多樣性指數(shù)Table 3 Bacterial sequencing and community α diversity index of soil treated with different improvement measures

2.3 不同施肥處理土壤細(xì)菌的群落組成

在門水平上，7個(gè)處理的土壤細(xì)菌群落共檢測(cè)到28個(gè)類群，其中變形菌門（Proteobacteria）、厚壁菌門（Firmicutes）、擬桿菌門（Bacteroidota）、放線菌門（Actinobacteriota）、綠彎菌門（Chloroflexi）、酸桿菌門（Acidobacteriota）、藍(lán)藻細(xì)菌門（Cyanobacteria）的相對(duì)豐度較高，累計(jì)相對(duì)豐度在84.81%以上，為優(yōu)勢(shì)菌門（圖1A）。對(duì)不同施肥處理進(jìn)行比較，變形菌門在T2處理中的相對(duì)豐度最高，為40.10%，在T7處理中最低，為20.08%；厚壁菌門在T7處理中的相對(duì)豐度最高，為26.08%，顯著高于除T6處理外的其他處理；擬桿菌門在 T7、T6和T5處理的相對(duì)豐度較CK處理分別提高10.32%、9.78%和9.73%；放線菌門在T4處理中的相對(duì)豐度最高，為17.68%，顯著高于其他處理；綠彎菌門在T5、T6、T7處理中的相對(duì)豐度顯著低于CK處理；酸桿菌門在T2處理中的相對(duì)豐度最高，為11.14%；藍(lán)藻細(xì)菌門在T4處理中的相對(duì)豐度最高，為12.06%。

在屬水平上，7個(gè)處理的飼草燕麥根際土壤細(xì)菌群被劃分為533個(gè)類群，其中相對(duì)豐度大于1%的細(xì)菌類群包括鞘脂單胞菌屬（Sphingomonas）、uncultured_bacterium_c_Subgroup_6、uncultured_bacterium、乳 酸 桿 菌（Lactobacillus）、uncultured_bacterium_f_A4b（圖1B）。鞘脂單胞菌屬為第1優(yōu)勢(shì)菌屬，在CK處理中的相對(duì)豐度最高，為 5.39%；uncultured_bacterium_c_Subgroup_6在CK、T2、T3處理中的相對(duì)豐度較高，均超過5.50%；uncultured_bacterium、乳酸桿菌、uncultured_bacterium_f_A4b在T7和T6處理中的相對(duì)豐度較高，顯著高于其他處理。

圖1 不同施肥處理下細(xì)菌的結(jié)構(gòu)組成Fig. 1 Composition and structure of bacterial under different fertilization treatments

2.4 不同處理間細(xì)菌的群落差異

主 坐 標(biāo) 分 析（principal coordinat analysis，PCA）結(jié)果（圖2）顯示，不同施肥處理形成了不同的細(xì)菌群落。第1坐標(biāo)（PC1）物種累積百分比方差占33.36%，第2坐標(biāo)（PC2）物種累積百分比方差占18.97%，累計(jì)52.33%，物種差異可用這2個(gè)軸來解釋。由圖2可知，T4、T5、T6、T7處理與CK、T2、T3處理間差異較大。

為了進(jìn)一步確定與不同施肥處理相關(guān)的特定細(xì)菌類群，根據(jù)分類學(xué)組成，使用線性判別分析效應(yīng)大?。╨inear discriminant analysis effect size，LEfSe）比較了7個(gè)處理的細(xì)菌群落組成。結(jié)果（圖3）顯示，根據(jù)設(shè)定的篩選標(biāo)準(zhǔn)（LDA＞4）共發(fā)現(xiàn)58個(gè)類群在統(tǒng)計(jì)學(xué)上有顯著差異（P＜0.05），其中，T4處理中檢測(cè)到24個(gè)，主要包括放線菌門（微球菌科Microscillaceae）、綠藻門（束鞘藻目、Coleofasciculaceae和念珠藻目Nostocales）和芽單胞菌門（芽孢菌目Bacillales）；T5處理檢測(cè)到21個(gè)，包括微菌桿科（Microbacteriaceae）、類芽孢菌科（Paenibacillaceae）等； CK則富集了較多擬桿菌目（Bacteroidales）的細(xì)菌菌群。

圖3 不同改良措施下土壤細(xì)菌群落系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 3 Cladogram of soil bacterial community under different treatments

2.5 不同處理的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)與其環(huán)境因子的關(guān)系

在屬水平，采用冗余分析（redundancy analysis，RDA）進(jìn)一步分析了差異物種與主要環(huán)境因子之間的關(guān)系，結(jié)果（圖4）表明，第1個(gè)成分（RDA 1）解釋了細(xì)菌菌群總變異的21.63%，第2個(gè)成分（RDA 2）解釋了細(xì)菌菌群總變異的12.71%，累積解釋率34.34%。此外，RDA 表明不同環(huán)境因子對(duì)細(xì)菌群落的影響不同。相關(guān)分析結(jié)果（表4）表明，TN、AN、SOC和AP含量與戴沃斯氏菌屬（Devosia）、交替赤菌屬（Alterythrobacter）、芽單胞菌屬（Gemmatimonas）、鞘氨醇單胞菌屬（Bacilllus Sphingomonas）的相對(duì)豐富度呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01），與紅球菌屬（Rhodococcus）、藤黃單胞菌屬（Luteimonas）、短波單胞菌屬（Brevundimonas）呈顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05）；AK含量與短波單胞菌屬（Brevundimonas）、芽單胞菌屬（Gemmatimonas）的相對(duì)豐度呈顯著正相關(guān)（P＜0.05），與紅球菌屬（Rhodococcus）、藤黃單胞菌屬（Luteimonas）呈顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05）。

表4 基于屬水平的細(xì)菌群落和環(huán)境因子之間相關(guān)分析Table 4 Correlation analysis between bacterial communities and environmental factors at the genus level

圖4 屬水平上不同施肥處理下土壤細(xì)菌的相對(duì)豐度和土壤環(huán)境因子間的RDA分析Fig. 4 RDA analysis of soil bacteria relative abundance and among soil environmental factors under different fertilization

3 討論

人工草地是我國重要的畜牧業(yè)生產(chǎn)基地。目前，在人工草地的建植與管理中，化肥施用量偏高，有機(jī)肥投入不足，從而造成耕地土壤退化，耕性變差，草產(chǎn)品品質(zhì)下降等問題。因此，在飼用燕麥的生產(chǎn)過程中探索合理高效的有機(jī)-無機(jī)配施比例有助于土壤和草地的可持續(xù)發(fā)展。研究發(fā)現(xiàn)，在草地農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中增施有機(jī)肥可提高土壤中有效鉀和有效磷含量[9,11-12]；但對(duì)土壤全氮、有效氮和有機(jī)碳含量影響較小[13-14]，這與本研究結(jié)果一致。本研究表明，隨著有機(jī)肥施用量的增加、無機(jī)肥施用量的減少，土壤中可溶解性鹽含量逐漸降低，表明增施有機(jī)肥可有效改善土壤結(jié)構(gòu)，降低土壤中鹽分含量；而研究中土壤有機(jī)質(zhì)含量未發(fā)生顯著變化，可能是有機(jī)肥施用時(shí)間較短，商麗榮等[9]也得出類似的結(jié)論。此外，本研究T4處理下的飼用燕麥株高和生物產(chǎn)量最高，一方面可能是由于施用有機(jī)肥改善了土壤生態(tài)；另一面該處理下施用的有機(jī)、無機(jī)肥用量保障了飼用燕麥的正常生長發(fā)育，且氮素利用率達(dá)到最大化。

農(nóng)業(yè)管理措施（例如施肥）作為對(duì)土壤擾動(dòng)的一種重要方式，也會(huì)給微生物群落的生物多樣性和豐富度帶來顯著影響[15-18]。本研究表明，不同比例的無機(jī)-有機(jī)肥配施對(duì)細(xì)菌群落的多樣性指數(shù)和豐富度指數(shù)均有明顯影響，這可能是因?yàn)殡S著有機(jī)肥施用量的增加，改善了土壤結(jié)構(gòu)，促進(jìn)了有機(jī)物的分解，從而影響了微生物種群結(jié)構(gòu)。對(duì)微生物群落結(jié)構(gòu)和組成的分析結(jié)果表明，變形菌門（Proteobacteria）、厚壁菌門（Firmicutes）、擬桿菌門（Bacteroidota）、放線菌門（Actinobacteriota）、綠彎菌門（Chloroflexi）、酸桿菌門（Acidobacteriota）、藍(lán)藻細(xì)菌門（Cyanobacteria）為優(yōu)勢(shì)菌門，但其在不同處理中的相對(duì)豐度又存在差異，與前人研究結(jié)果一致[8,19-24]。綠彎菌門（Chloroflexi）含有綠色色素，能夠通過光合作用產(chǎn)生能量[9]，Lino等[25]研究表明，其菌群數(shù)量與植物地上生物量呈顯著正相關(guān)。酸桿菌門 (Acidobacteriota) 是近年來新分離的細(xì)菌類群[8]，其作用還有待進(jìn)一步研究。

土壤微生物群落會(huì)在不同程度的擾動(dòng)下表現(xiàn)出不同的響應(yīng)策略[8]。本研究也表明，不同處理下土壤細(xì)菌的群落組成存在差異，其中Microscillaceae、節(jié)桿菌屬（Arthrobacter）、芽單胞菌屬（Gemmatimonas）、第 三 節(jié) 類 芽 胞 桿 菌（Paenibacillaceae）在T4和T5處理中的相對(duì)豐度較高，較CK處理的增幅均在5.42%以上；乳酸桿菌（Lactobacillales）是有機(jī)物降解的重要參與者，其在T2處理中的相對(duì)豐度較高；而Chitinophagales可代謝碳水化合物，是碳代謝的重要參與者[26]，其在CK處理中的相對(duì)豐度較高。此外，不同無機(jī)-有機(jī)肥配施處理引起的環(huán)境因素變化對(duì)不同微生物群的影響不同，土壤TN、AP、SOC和AK含量對(duì)細(xì)菌群落有著更為顯著的影響。

綜上所述，無機(jī)肥與有機(jī)肥按照8∶2的比例配施不僅能夠有效降低土壤中可溶解性鹽含量，還能提高土壤中有效鉀和有效磷含量，且增加土壤細(xì)菌群落的多樣性指數(shù)，使其優(yōu)勢(shì)菌群更有利于土壤正向演替，增加植物地上部生物產(chǎn)量。未來，對(duì)于不同比例無機(jī)-有機(jī)肥配施對(duì)土壤菌群及微環(huán)境的影響機(jī)理還有待進(jìn)一步深入研究。