柳春雨， 門麗娜， 連雅琴， 張宇宏， 張志偉*， 張偉

（1.山西農(nóng)業(yè)大學林學院，山西 晉中 030801； 2.中國農(nóng)業(yè)科學院生物技術研究所，北京 100081）

聚乙烯（polyethylene，PE）是C、H元素組成，由乙烯為單體進行聚合而成的聚合物，可表示為-[CH2-CH2]n-[1]。聚乙烯具有的飽和線性碳氫鏈、高拉伸強度、低氣體滲透性以及低成本等特性，使其成為應用最廣泛的塑料品種之一[2-4]。然而，塑料污染對環(huán)境和健康構成了嚴重威脅。微塑料目前已經(jīng)在全球各個水域都有發(fā)現(xiàn)，由于其體積小，鳥類和魚類很容易攝入并且在體內(nèi)逐漸累積，最終導致死亡[5-6]，且微塑料在食物鏈中的富集最終可能對人類健康產(chǎn)生不利影響[7-9]。

在過去的幾十年，填埋[10]和熱處理[11]是塑料廢物最常用的處理方法。但這些方法會對土壤和大氣造成污染，目前常用的塑料垃圾處理方法是機械回收[12]、能源回收[13]和生物降解[14]。相較于其他處理方法，生物降解是一種綠色經(jīng)濟的污染解決途徑，在塑料垃圾處理方面顯示出明顯的優(yōu)勢和前景[15]。生物降解是指在生物和酶的作用下將有機物質(zhì)轉(zhuǎn)化成簡單無機物的過程。聚乙烯的生物降解過程十分復雜，其研究方向主要有兩個：一是降解聚乙烯微生物的分離純化并進行解析[16]；二是研究復雜環(huán)境中存在的混合降解菌系，如海水、土壤、昆蟲腸道微生物等[17]。北京航空航天大學楊軍教授團隊發(fā)現(xiàn)大蠟螟（Galleria mellonellaL.）幼蟲可以取食聚乙烯，幼蟲腸道微生物作用于塑料，會發(fā)生解聚反應[18]。此外，楊軍教授團隊還順利從印度谷螟（Plodia interpunctella）幼蟲腸道中分離到2株聚乙烯降解細菌，分別是芽孢桿菌YP1和腸桿菌YT1[19]。

盡管聚乙烯降解菌被陸續(xù)發(fā)現(xiàn)，但其中參與聚乙烯降解的關鍵酶卻較少被報道。目前研究認為聚乙烯降解酶主要有錳過氧化物酶、漆酶、木質(zhì)素過氧化物酶和細胞色素P450酶等[15,20]。這些酶參與聚乙烯降解過程，如末端氧化、鏈斷裂和脂肪酸代謝等[21]，但詳細催化機制還需進行深入研究。最近結合量子力學的一項研究表明，利用氧化酶或加氧酶解聚聚乙烯的碳碳鍵是有可能實現(xiàn)的[22]。因此，本研究基于高通量宏基因組測序技術從大蠟螟的腸道微生物中挖掘到2個過氧化物酶基因，并將其在大腸桿菌中成功表達，對重組酶進行純化，研究其酶學性質(zhì)，使用接觸角測試法進一步確定其對聚乙烯的降解效率，為生物降解聚乙烯提供了新的依據(jù)與思路。

1 材料與方法

1.1 研究材料

1.1.1 菌株及質(zhì)粒 腸道中微生物菌群來源于山西農(nóng)業(yè)大學林學院森林保護實驗室飼養(yǎng)的大蠟螟幼蟲，該蟲種群繼代培養(yǎng)20代以上。

大腸桿菌（Escherichia coli）克隆菌株Top10和表達菌株BL21(DE3)購自北京康為世紀生物科技有限公司；pET30a(+)質(zhì)粒由中國農(nóng)業(yè)科學院生物技術研究所提供。

1.1.2 試劑和材料 試驗使用的聚乙烯塑料膜片為中國燕山石化生產(chǎn)的低密度聚乙烯（low density polyethylene，LDPE）膜。DNA聚合酶和同源重組酶購自南京諾唯贊（Vazyme）生物科技股份有限公司；質(zhì)粒小提試劑盒、細菌基因組DNA提取試劑盒和凝膠回收試劑盒購自北京天根生化科技有限公司；限制性內(nèi)切酶購自賽默飛世爾科技（中國）有限公司；過氧化氫購自上海阿拉?。ˋladdin）生化科技股份有限公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.3 培養(yǎng)基 基礎無碳源培養(yǎng)基：NaCl (0.005 g·L-1)、MgSO4·7H2O (0.7 g·L-1)、KH2PO4(0.7 g·L-1)、K2HPO4(0.7 g·L-1)、MnSO4·H2O (0.001 g·L-1)、ZnSO4·7H2O (0.002 g·L-1)、 NH4NO3(1.0 g·L-1)，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min，最后加入用0.22 μm濾膜過濾的FeSO4·7H2O (0.002 g·L-1)。

1.2 研究儀器

試驗儀器包括PCR儀（Bio-Rad 公司）、搖床（江蘇太倉市科教器材廠）、超聲波細胞破碎儀（寧波新芝生物科技有限公司）、?KTATM蛋白純化儀（美國GE Healthcare公司）、酶標儀（Thermo-354，美國熱電公司）。

1.3 研究方法

1.3.1 大蠟螟幼蟲排泄物的收集 將5齡期的大蠟螟幼蟲按照飼料組（D組）、塑料組（PE組）、饑餓組（C組）進行飼養(yǎng)，每組3個生物學重復。其中，D組一直飼喂飼料；PE組幼蟲只被提供PE塑料膜；C組一直饑餓至研究結束。飼養(yǎng)1周后將幼蟲取出空置24 h，然后收集其排泄物進行傅立葉變換紅外吸收光譜（fourier transform infrared spectroscopy, FTIR）分析。

1.3.2 大蠟螟幼蟲腸道內(nèi)容物分析 飼養(yǎng)1周后隨機挑選健康的大蠟螟幼蟲，解剖出的腸道內(nèi)容物用1 mL滅菌生理鹽水沖洗，-80 ℃冷凍備用。大蠟螟幼蟲腸道內(nèi)容物的宏基因組分析委托北京奧維森基因科技有限公司進行，宏蛋白質(zhì)組分析委托中國農(nóng)業(yè)科學院蜜蜂研究所進行。

1.3.3 聚乙烯降解關鍵酶目的片段的擴增 根據(jù)組學分析結果預測聚乙烯降解關鍵酶，并設計酶基因擴增引物(8747-F:inf-CACATGGACAGCC CAGATCTATGAGCACGTCAGACGAGACCAATA;8747-R: TGGTGGTGCTCGAGTGCGGCCGCCTTCA CGTCAAAACGGTCCAAA；5341-F: AAGAAGGA GATATACATATGATGTCCTTGATTAACACCAAA ATTA;5341-R: CAGTGGTGGTGGTGGTGGTGGA TTTTACCGACCAGATCCAAAGAT)和載體擴增引物(30a-cF:CACCACCACCACCACCACTGAGAT;30a-cR:CATATGTATATCTCCTTCTTAAAGTTAAACA AAATT)。使用細菌基因組DNA提取試劑盒提取的大蠟螟幼蟲腸道宏基因組DNA作為模板進行PCR擴增，得到2個聚乙烯降解酶POD8747 和AhpC5341的DNA片段，對擴增到的序列片段進行1%瓊脂糖凝膠電泳驗證。

1.3.4 重組質(zhì)粒的構建和誘導表達 通過BglⅡ和NotⅠ 酶切，或PCR方式獲得pET30a(+)載體質(zhì)粒片段，然后經(jīng)同源重組方式連接目的片段，將連接體系置于50 ℃金屬浴中，連接15 min。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E. coliTop10大腸桿菌感受態(tài)細胞，涂布于含有卡納霉素的LB培養(yǎng)基平板上，37 ℃恒溫箱中過夜培養(yǎng)。挑取單菌落進行PCR擴增驗證和DNA測序驗證，驗證正確的菌落即可擴大培養(yǎng)提取得到重組質(zhì)粒。

將重組質(zhì)粒pET30a(+)-POD8747、pET30a(+)-Ahpc5341轉(zhuǎn)化入BL21(DE3)表達菌株，涂布于含有卡納霉素的LB培養(yǎng)基平板上，37 ℃恒溫箱中過夜培養(yǎng)，挑取單克隆轉(zhuǎn)接至含有卡納霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃搖床振蕩培養(yǎng)，當OD600nm吸光值為0.6~0.8時，加入IPTG至終濃度為0.1 mmol·L-1，16 ℃誘導表達蛋白18~20 h。

1.3.5 重組蛋白純化 離心收集誘導表達后的菌體，用適量20 mmol·L-1Tris-HCl（pH 8.0）緩沖液重懸，超聲波破碎細胞壁，破壁菌液經(jīng)10 000 r·min-1離心10 min后，收集上清液（粗酶液），用裝有鎳（Ni2+）親和層析柱的?KTATM蛋白純化儀對粗酶液進行純化。

1.3.6 重組過氧化氫酶活力測定 將30% H2O2溶液用 0.2 mol·L-1pH 7.0的磷酸緩沖液稀釋49倍后得到H2O2工作液，將1 mL 0.2 mol·L-1pH 7.0磷酸緩沖液和0.9 mL H2O2工作液混合均勻，放入37 ℃水浴鍋中孵育3 min，然后加入0.1 mL酶液反應5 min，加入32.4 mmol·L-1鉬酸銨溶液以鈍化過氧化氫酶活性，靜置10 min后在405 nm波長下用酶標儀測定光吸收值。1個酶活單位（U）定義為在37 ℃、 pH 7.0條件下每分鐘消耗1 μmol H2O2所需要的酶量。

1.3.7 重組酶酶學性質(zhì)分析 最適溫度測定：在50 mmol·L-1pH 7.4 的 Na2HPO4-NaH2PO4底物緩沖液中，于20~90 ℃測試樣品過氧化氫酶活力。

最適 pH的測定：在50 ℃條件下，分別在pH 5.0~6.0 (50 mmol·L-1磷酸氫二鈉-檸檬酸)、pH 6.0~8.0 (50 mmol·L-1Na2HPO4-NaH2PO4）、pH 8.0~9.0 (50 mmol·L-1Tris-HCl)、pH 9.0~10.0 (50 mmol·L-1甘氨酸-NaOH)和pH 10.0~11.5 (BR緩沖液-NaOH)的底物緩沖液下測定樣品過氧化氫酶活力。

1.3.8 重組酶降解聚乙烯性能分析 將PE膜裁剪成4 cm×4 cm膜片，在75%乙醇溶液中浸泡3 h，取出晾干后在紫外燈下照射1 h，用滅菌超純水沖洗3次后作為標準PE膜備用。將標準PE膜放入已滅菌的磷酸鹽緩沖液中，加入酶液，在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中靜置7 d，膜取出后用10%的SDS溶液浸泡清洗，然后經(jīng)超純水浸泡清洗3次，干燥處理后進行疏水性測試。

1.3.9 蛋白序列分析 使用VectorNTI 11.5軟件預測蛋白理論分子量和等電點，使用SignalP-5.0平臺（https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?SignalP-5.0）分析信號肽，使用BLASTP工具（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）進行序列相似性分析。

2 結果與分析

2.1 大蠟螟幼蟲腸道排泄物分析

對大蠟螟幼蟲腸道排泄物進行FTIR分析，結果如圖1所示。PE組和D組在C-O (1 000 cm-1)和R-OH (3 000~3 500 cm-1)存在特征峰，說明這2組幼蟲排泄物存在氧的摻入，發(fā)生了生物氧化反應，而C組的幼蟲排泄物沒有氧的摻入。

圖1 大蠟螟幼蟲排泄物的傅里葉變換紅外光譜分析Fig. 1 Fourier transform infrared spectroscopy analysis of Galleria mellonella L. larvae frass

2.2 聚乙烯降解酶基因篩選

結合大蠟螟幼蟲腸道宏基因組和宏蛋白組數(shù)據(jù)，構建了聚乙烯降解酶候選基因庫（表1），并從中篩選過氧化物酶POD8747和烷基過氧化氫酶AhpC5341進行重組表達和降解性質(zhì)分析。

表1 聚乙烯降解酶候選基因庫Table 1 Candidate gene library of polyethylene degrading enzyme

2.3 目的基因的擴增、載體構建

POD8747蛋白含726個氨基酸，理論分子量為79.4 kD，預測等電點5.09， SignalP 5.0軟件預測無信號肽，與來自腸桿菌Enterobacter cancerogenus的過氧化氫酶（登錄號WP_006179188）序列相似性達到99%。AphC5341蛋白含187個氨基酸，理論分子量為20.6 kD，預測等電點5.02，SignalP 5.0軟件預測無信號肽，與來自腸桿菌屬Enterobacter的烷基過氧化氫酶（登錄號WP_006177103）序列相似性達到100%。

從大蠟螟幼蟲腸道宏基因組中擴增得到了POD8747和AhpC5341基因，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，觀察到有明亮單一的特異性條帶，POD8747和AhpC5341基因分別為2 181和564 bp（圖2）。利用同源重組技術將目的片段連入pET30a(+)載體，并進行測序驗證確認。

圖2 PCR擴增目的基因核酸電泳分析Fig. 2 DNA electrophoresis analysis of PCR amplified target gene

2.4 聚乙烯降解酶的表達和純化

將POD8747和Ahpc5341基因連接pET30a(+)載體，轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21（DE3）后進行誘導表達。2種酶蛋白的理論分子量分別為79.4和20.6 kDa，經(jīng)SDS-PAGE分析（圖3），POD8747和AhpC5341在超聲破碎上清液和沉淀中對應目的條帶均與理論分子量相符，說明重組蛋白成功在BL21（DE3）中正確表達，但有部分為不可溶性蛋白。經(jīng)鎳親和層析純化，在洗脫液中獲得純化后的POD8747和AhpC5341酶蛋白用于后期分析。

圖3 聚乙烯降解酶蛋白重組表達和純化Fig. 3 Recombinant expression and purification of polyethylene degrading enzyme protein

2.5 聚乙烯降解酶酶學性質(zhì)分析

酶學性質(zhì)分析結果（圖4）表明，POD8747在50 ℃時過氧化氫酶活性最高，溫度超過50 ℃后，其活性明顯下降；AhpC5341的最適溫度也是50 ℃，但其在30~40 ℃仍能維持80%以上的活力。在50 ℃條件下，POD8747和AhpC5341的最適pH均為8.0（圖4）。

圖4 POD8747和AhpC5341最適溫度和最適pHFig. 4 Optimal temperature and optimal pH of POD8747 and AhpC5341

2.6 聚乙烯降解酶處理PE效果分析

使用重組酶液對PE膜處理7 d，通過測試PE膜表面接觸角表征塑料。結果（圖5）表明，未經(jīng)處理的PE膜接觸角為100°，經(jīng)POD8747處理后的PE膜接觸角為(90.07±3.45)°，經(jīng)AhpC5341處理后的 PE 膜接觸角為(91.73±1.70)°，說明 POD8747和AhpC5341對PE塑料具有降解效果。

圖5 PE膜接觸角分析Fig. 5 Polyethylene contact angle test

3 討論

大蠟螟幼蟲可以咀嚼PE薄膜，F(xiàn)TIR檢測結果顯示，幼蟲取食塑料后排泄物中出現(xiàn)了含氧官能團的特征峰，表明塑料在幼蟲腸道中發(fā)生了有氧催化反應。羥基/羧酸基團的增加驗證了酶處理PE膜后從疏水到更親水的表面特性轉(zhuǎn)變，說明PE經(jīng)幼蟲腸道后發(fā)生氧的摻入，這與Liu等[23]和Gao等[24]的研究結果一致，再次證明大蠟螟幼蟲具有降解PE塑料的能力。

挖掘聚乙烯降解菌株和降解酶的常規(guī)方法是先從環(huán)境中篩選可培養(yǎng)的降解菌株，然后從中挖掘降解酶[15-16,19-20]。本研究不依賴可培養(yǎng)菌株的篩選，基于大蠟螟腸道宏基因組和宏蛋白組信息，挖掘得到對聚乙烯有降解作用的過氧化物酶POD8747和烷基過氧化氫酶AhpC5341，說明宏組學方法可用于篩選新的聚乙烯降解酶，且后期通過大量數(shù)據(jù)的篩選，仍有挖掘大量聚乙烯降解酶的潛力。為了確認酶蛋白降解聚乙烯的生物學活力，本研究采用接觸角進行活性表征。PE膜表面為疏水結構，降解酶與PE膜接觸較為困難，經(jīng)POD8747和AhpC5341處理后，PE膜接觸角變小，說明POD8747和AhpC5341可以催化PE膜表面氧化，進而表面親水性增加，可促進其他多種降解酶進一步降解PE。研究表明，大多數(shù)過氧化物酶的催化機制是相似的，包含3個步驟。首先，在催化循環(huán)中產(chǎn)生了具有高能量的Fe(IV)AO，并將其假定為氧化劑來氧化PE薄膜表面，酶對高密度聚乙烯（high density polyethylene, HDPE）表面氧化的機制為在反應開始時，苯酚優(yōu)先被氧化，隨后被分解成相應的苯氧基自由基；其次，苯氧基自由基從聚乙烯鏈中提取氫，并在高密度聚乙烯鏈上形成一個表面自由基；最后，形成的自由基（聚乙烯自由基）與空氣接觸后，迅速轉(zhuǎn)變成過氧化物，然后通過過氧化酶分解將極性基團引入HDPE薄膜[25]。

有研究者在大腸桿菌中克隆了3個烷烴羥化酶基因alkb、alkb1和alkb2，并發(fā)現(xiàn)由此產(chǎn)生的重組菌株能夠降解低分子量的PE塑料[26]。Sanlnisverdes等[27]使用電子顯微鏡來分析蠟螟的唾液，并將它們對塑料的降解追溯到2種酚氧化酶，這些酶共同作用在PE塑料表面，幾個小時內(nèi)PE膜產(chǎn)生凹坑并且被氧化，這2種酶被視為對抗塑料降解的新武器，但仍需要其他多種酶的協(xié)同作用。本研究篩選到的PE降解酶能夠增加PE膜的親水性，利于其他降解酶與PE膜的接觸，這種多酶協(xié)同酶系有利于PE的高效降解。

本研究從大蠟螟幼蟲腸道內(nèi)容物宏組學數(shù)據(jù)中篩選到2個PE降解候選酶，它們具有在PE膜表面定植和降解PE的潛力。通過氧化PE膜增加其親水性，這有利于其他降解微生物的定植，促進形成細菌、酶和PE膜催化體系。后期通過多種酶的組合作用，有望進一步提高PE膜親水性，促進多酶協(xié)同催化PE塑料的生物降解。