趙曾強， 張國麗， 馬盼盼， 李有忠， 王志軍， 謝宗銘*， 孫國清，2*

（1.新疆農(nóng)墾科學(xué)院生物技術(shù)研究所，作物種質(zhì)創(chuàng)新與基因資源利用兵團重點實驗室，新疆 石河子 832000；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所，北京 100081）

類受體胞質(zhì)激酶（receptor-like cytoplasmic kinase，RLCK）是只含胞內(nèi)激酶域的蛋白激酶，在擬南芥中有147個成員[1]，水稻中有379個成員[2]。研究表明，一些RLCK作為模式識別受體（pattern recognition receptors，PRRs）復(fù)合體的核心組分[3-4]，可以激活PRR，并與各種早期信號事件關(guān)聯(lián)[5-6]，參與植物免疫響應(yīng)、信號傳導(dǎo)及防御過程[7]。

在擬南芥中，AtRLCK-VII亞家族有47個成員，利用基因敲除技術(shù)敲除在模式觸發(fā)免疫中扮演關(guān)鍵角色的基因并構(gòu)建突變體，分別命名為RLCK VII-1～RLCK VII-9，結(jié)果表明，突變體RLCK VII-5、RLCK VII-7和RLCK VII-8在不同的PRR模式測定中均能影響活性氧 （reactive oxygen species，ROS）的產(chǎn)生，表明其成員廣泛地參與多個PRR信號傳遞，而RLCK VII-4在幾丁質(zhì)誘導(dǎo)的ROS產(chǎn)生過程中存在特異性缺陷，表明RCLK VII-4特異性介導(dǎo)PRR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，且RLCK VII-4參與幾丁質(zhì)誘導(dǎo)絲裂原活化蛋白激酶 （mitogenactivated protein kinase，MAPK）的激活[8]。以上結(jié)果表明，RLCK-VII家族成員參與PRR與MAPK激活的免疫響應(yīng)，在植物抗病過程中起重要作用[9-10]。 RLCK-VII成 員 BIK1（botrytis-induced kinase 1，BIK1）是研究最深入的成員，在靜息狀態(tài)下，BIK1與FLS2（flagellin sensing 2）蛋白結(jié)合，也可能與BAK1結(jié)合，在flg22被激發(fā)后，BAK1（brassinosteroid insensitive 1-associated kinase 1）與FLS2結(jié)合并磷酸化BIK1；反過來，BIK1從PRR復(fù)合體解離之前磷酸化BAK1和FLS2，從而激活下游信號分子，BIK1和PBS1激酶(PBL)蛋白參與了由elf18、AtPep1和幾丁質(zhì)觸發(fā)的免疫反應(yīng)，這是早期不同PRR介導(dǎo)通路的聚合點[11-14]。水稻中，BSR1（RLCK VII）基因參與幾丁質(zhì)誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答，過表達BSR1基因增強了過氧化氫(H2O2)的產(chǎn)生，活性氧的積累增強了寄主植物對親和病原菌的抗性，參與肽聚糖和脂多糖引起的免疫反應(yīng)，提高了植物對真菌和細(xì)菌病原菌的抵抗力[15]。木薯中，MeRLCK-VII 家族MeBIK基因通常情況下表達量較低，受鞭毛蛋白flg22刺激后表達量顯著提高，構(gòu)建MeBIK1基因雙元熒光素酶報告系統(tǒng)，利用擬南芥atbik1突變體開展遺傳互補試驗表明，MeBIKl基因能恢復(fù)擬南芥AtBIK1基因突變減弱的PTI反應(yīng)，且轉(zhuǎn)基因植株對黃單胞桿菌（XamHN04）抗性提高，對PstDC3000敏感性增強[16]。小麥中，TaRLCK-VII家族成員TaRLCK1B基因與水稻抗病相關(guān)基因OsRLCK176（RLCKs-VII）的同源性為84.03%，該基因在小麥抗病品種中的表達量顯著高于感病品種；利用VIGS （virus induced gene silencing）技術(shù)沉默TaRLCK1B后接種麥瘟病菌（R. cerealis），沉默植株對麥瘟病菌的抗性降低，但其H2O2含量顯著提高，由此可見，TaRLCK1B基因通過調(diào)控小麥體內(nèi)ROS信號應(yīng)對R. cerealis早期免疫應(yīng)答[17]。

綜上所述，RLCK-VII家族基因參與植物免疫響應(yīng)，在調(diào)控植物逆境脅迫應(yīng)答過程中起重要作用，但該類基因在棉花中的報道甚少。因此，本研究利用前期從海島棉中獲得的響應(yīng)黃萎病菌和激素（水楊酸salicylic acid，SA；乙烯ethylene，ET；茉莉酸methyl jasmonic acid，MeJA）脅迫的RLCK基因GbRLCK10[18]，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將該基因?qū)霟煵荩芯科湓跓煵葜械墓δ?，為深入研究GbRLCK10基因在海島棉中的時空表達及作用機制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗煙草材料為野生型煙草SR1（Nicotiana tabacumpv SR1），根癌農(nóng)桿菌為GV3101，植物基礎(chǔ)表達載體為pCAMBIA2300-35s-OCS，黃萎病菌菌株為v592，以上材料均由本實驗室提供。

1.2 試驗方法

1.2.1 重組質(zhì)粒構(gòu)建及轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌 根據(jù)GbRLCK10基因的開放閱讀框序列設(shè)計引物；通過酶切、連接構(gòu)建植物表達載體重組質(zhì)粒（pCAMBIA2300-35s-OCS:GbRLCK10）；采用電擊法將重組質(zhì)粒導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌GV3101，利用菌液PCR法篩選鑒定陽性菌株。

1.2.2 煙草遺傳轉(zhuǎn)化 利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法進行煙草遺傳轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化過程中所需要的培養(yǎng)基配方及轉(zhuǎn)化方法參考文獻[19]。

1.2.3 轉(zhuǎn)基因煙草檢測 T0代轉(zhuǎn)基因陽性株篩選：依據(jù)CaMV35S啟動子序列設(shè)計上游引物35SF1，依據(jù)目的基因序列設(shè)計下游引物GeneR1，以轉(zhuǎn)基因煙草與野生型煙草的基因組DNA為模板進行PCR擴增，轉(zhuǎn)基因植株的擴增片段預(yù)計600 bp左右，PCR程序：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，30 個循環(huán)；72 ℃ 7 min。擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

T1/2代轉(zhuǎn)基因陽性株篩選：將煙草種子表面消毒后平鋪于含有50 mg·L-1卡那霉素的固體1/2 MS培養(yǎng)基上進行篩選，植株正常生長、葉片為綠色的為轉(zhuǎn)基因植株；植株發(fā)芽后停止生長、葉片變白的為非轉(zhuǎn)基因植株。選取轉(zhuǎn)基因植株的cDNA為模板進行RT-PCR，擴增片段預(yù)計約1 200 bp，引物為目的基因引物（GbRLCK-F和GbRLCK-R），PCR程序：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃60 s，30個循環(huán)；72 ℃ 10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.4 煙草DNA和RNA提取 試驗所需DNA和RNA均使用試劑盒提取，分別為 DNAsecure Plant Kit 新型植物基因組DNA提取試劑盒（天根生化科技北京有限公司）和EASYspin Plus植物RNA快速提取試劑盒（北京艾德萊生物科技有限公司），提取過程嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作。

1.2.5 煙草抗病性鑒定 將黃萎病菌菌株V592接種至PDA培養(yǎng)基活化，將已活化菌株接種至查氏液體培養(yǎng)基，28 ℃振蕩培養(yǎng)4 d后，配制為1×107·mL-1孢子懸浮液待用；于煙草幼苗長至5~6片真葉時，選取生長一致的煙草采用灌根法接種黃萎病菌，接種后每天觀察煙草病害的發(fā)生情況[20]，待發(fā)病高峰期統(tǒng)計病情指數(shù)。按以下標(biāo)準(zhǔn)統(tǒng)計病級。0級：植株無發(fā)病葉片；1級：植株有發(fā)病葉片，且發(fā)病葉片少于25%；2級：植株25%~50%葉片發(fā)病；3級：植株50%～75%葉片發(fā)??；4級：植株75%以上葉片發(fā)病。病情指數(shù)計算公式如下。

1.2.6 抗病相關(guān)基因表達特性分析 將已活化菌株V592接種至查氏液體培養(yǎng)基，28 ℃振蕩培養(yǎng)4 d后，配制濃度為1×107·mL-1孢子懸浮液待用；于煙草幼苗長至5～6片真葉時，選取生長一致的煙草采用灌根法接種黃萎病菌，分別在侵染0、24、72、120和168 h采集野生型和轉(zhuǎn)基因植株從上至下的第3片真葉，液氮速凍后保存于-80 ℃冰箱。

利用qRT-PCR技術(shù)，以NtActin為內(nèi)參基因，分析NtPR1、NtNPR1、NtEIN4、NtJAZ1、NtNTHK、NtAOS在轉(zhuǎn)基因植株和野生型植株感病前和感病后的表達模式?；虮磉_量檢測所需的試劑盒購于中國北京全式金生物技術(shù)有限公司。qRT-PCR反應(yīng)體系及程序嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作，試驗設(shè)3個重復(fù)，采用2-ΔΔCT法計算基因的相對表達量。

表1 引物序列Table 1 Sequence of pimers

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2010進行數(shù)據(jù)整理，采用GraphPad Prism 8軟件作圖，采用SPSS 19.0進行顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的煙草遺傳轉(zhuǎn)化

2.1.1 重 組 質(zhì) 粒 （pCAMBIA2300-35s-OCS：GbRLCK10）轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌 將構(gòu)建好的植物表達載體（pCAMBIA2300-35s-OCS:GbRLCK10）導(dǎo)入農(nóng)桿菌，利用菌液PCR鑒定陽性菌株，目的基因為1 179 bp（圖1）。

圖1 GbRLCK10基因PCR擴增Fig. 1 PCR amplification results of GbRLCK10 gene

2.1.2 煙草的遺傳轉(zhuǎn)化及陽性植株篩選 采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化煙草(圖2A～D)，并獲得T0轉(zhuǎn)基因植株（圖2E和F），分別提取野生型和T0轉(zhuǎn)基因植株DNA，以野生型煙草為陰性對照進行PCR鑒定，結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因煙草中有11株擴增出預(yù)期大小（約600 bp）的目的條帶，初步證明GbRLCK10基因已整合到煙草基因組中（圖2G）。對T1/2轉(zhuǎn)基因植株提取RNA，反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA后，利用RT-PCR進一步檢測，11株轉(zhuǎn)基因的煙草均擴增出預(yù)期大?。s1 200 bp）的目的條帶（圖2H和I）。由此說明，GbRLCK10基因已整合到煙草基因組中，且能夠正常轉(zhuǎn)錄。選取OE2、OE3和OE5共3株轉(zhuǎn)基因株系進行后續(xù)試驗。

圖2 GbRLCK10基因轉(zhuǎn)化煙草化及陽性植株篩選Fig. 2 Transformation of GbRLCK10 gene into Nicotiana tabacum and screening of positive plants

2.2 抗病性鑒定

采用灌根法對轉(zhuǎn)基因煙草和野生型煙草接種棉花黃萎病菌菌株V592，結(jié)果（圖3）顯示，接種病原菌約7～10 d，轉(zhuǎn)基因植株和野生型植株的葉子出現(xiàn)不同程度褶皺，葉脈附近慢慢變黃；轉(zhuǎn)基因煙草在接種20～22 d開始發(fā)病，33 d時達到發(fā)病高峰期；野生型煙草在接種28～31 d開始發(fā)病，42 d時達到發(fā)病高峰期。由此表明，與野生型相比轉(zhuǎn)基因煙草更易感病。

圖3 煙草抗病性鑒定Fig. 3 Tobacco disease resistance identification

2.3 抗病相關(guān)基因表達量分析

接種病原菌前，抗病相關(guān)基因在野生型和轉(zhuǎn)基因植株中的表達如圖4所示。野生型煙草中NtNPR1、NtPR1、NtJAZ1基因的表達量均顯著或極顯著低于轉(zhuǎn)基因植株，而NtEIN4、NtNTHK2、NtJAZ1基因的表達量均顯著或極顯著高于轉(zhuǎn)基因植株。

圖4 黃萎病菌處理前抗病相關(guān)基因在野生型和轉(zhuǎn)基因植株中的表達Fig. 4 Expression of disease resistance-related genes in WT and transgenic plant before treatment with Verticillium dahliae

接種黃萎病菌后，抗病相關(guān)基因在野生型和轉(zhuǎn)基因植株中的表達如圖5所示。NtNPR1基因在野生型中的表達量隨著接種時間的推進先升高再降低，在接種后72 h表達量最高，為接種前的2.1倍；而轉(zhuǎn)基因植株中NtNPR1基因的表達量均高于野生型。NtPR1基因在野生型煙草中表達量在處理時間段內(nèi)持續(xù)升高，在接種后168 h表達量最高，約為對照的380倍；轉(zhuǎn)基因植株在處理時間點內(nèi)該基因的表達量均低于野生型。NtEIN4基因在野生型植株中的表達量隨接種時間的延長，表達量均低于對照；而轉(zhuǎn)基因植株中該基因的表達量均高于野生型，且隨接種時間的延長表達量呈上升趨勢。NtNTHK2和NtJAZ1基因無論是在野生型還是在轉(zhuǎn)基因植株中，隨著接種時間的延長，該基因的表達量均低于對照；但轉(zhuǎn)基因植株中的表達量均高于野生型。NtAOS基因無論是在野生型還是在轉(zhuǎn)基因植株中，隨著接種時間的延長，該基因整體表達量均高于對照；且野生型中的表達量高于轉(zhuǎn)基因植株。

圖5 黃萎病菌處理后抗病相關(guān)基因在野生型株系與轉(zhuǎn)基因株系中表達Fig. 5 Expression of disease resistance related genes in wild type and transgenic strains after treatment with Verticillium dahliae

3 討論

RLCK家族基因位于植物細(xì)胞表面，被稱為模式識別受體（PRRs），通過感知PAMPs（pathogen-associated molecular patterns）激活下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[21-22]。研究表明，該類基因在PTI中起著重要作用，廣泛地參與植物免疫響應(yīng)、信號傳導(dǎo)及防御過程，在擬南芥中，RLCK VII亞家族成員BIK1 和PBS1是多個PRR復(fù)合物的直接底物[22]；在水稻中，賴氨酸基序（LysM）受體樣激酶CERK1是植物對微生物相關(guān)分子模式（MAMPs）免疫應(yīng)答所必需的輔助受體，屬于水稻RLCK家族VII亞家族，與CERK1相互作用，并正向調(diào)節(jié)對肽聚糖和幾丁質(zhì)反應(yīng)[23]。由此可見，RLCK家族基因以正調(diào)控或負(fù)調(diào)控的作用方式參與復(fù)雜的抗病信號途徑[24]。

本研究前期從海島棉中獲得響應(yīng)黃萎病菌和激素（水楊酸、茉莉酸、乙烯）脅迫的基因GbRLCK10，并通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將其轉(zhuǎn)入煙草，對其在煙草中的功能進行初步研究，結(jié)果表明，在煙草中過表達GbRLCK10基因，轉(zhuǎn)基因植株對黃萎病菌的抗性較野生型有所降低。研究表明，類受體胞質(zhì)激酶基因CPK28在擬南芥中過表達后，轉(zhuǎn)基因植株中BIK1蛋白積累較少，致使免疫受損，對病原菌的抵抗力下降，而該基因的突變體中BIK1蛋白積累較多，對病原菌的抗性增強[25]，與本研究結(jié)果一致，但GbRLCK10基因是否如CPK28基因通過影響某些蛋白的積累從而影響植物對病原菌的抗性有待進一步研究。

研究表明，水楊酸、茉莉酸和乙烯是植物抗病信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中重要的信號分子[18]。水稻中，RLCK VII家族成員的OsPBL1基因能被水稻條紋葉枯病誘導(dǎo)表達，將其轉(zhuǎn)入擬南芥后，轉(zhuǎn)基因植株對丁香假單胞菌的抵抗性較野生型增強，葉片中過氧化氫與胼胝體的積累量均高于野生型，水楊酸途徑中關(guān)鍵基因PR1、PR2和PR5的表達量均高于野生型[26]。編碼類受體胞質(zhì)激酶蛋白基因NRRB能被水楊酸、氨基環(huán)丙烷羧酸（l-aminocyclopropane-lcarboxylic acid，ACC）抑制表達，而MeJA對NRRB具有雙向調(diào)控，既可以誘導(dǎo)NRRB表達，也可以抑制NRRB表達，表明類受體胞質(zhì)激酶家族基因參與了水楊酸與茉莉酸信號通路[27]。以上研究表明，類受體胞質(zhì)激酶家族基因參與調(diào)控激素信號通路基因影響植物抵御外界逆境脅迫。

NPR1基因?qū)λ畻钏嵝盘柾緩街蠷基因的激活具有重要調(diào)控作用。本研究表明，健康狀態(tài)下，NtNPR1、NtPR1基因在轉(zhuǎn)基因植株中的表達量高于野生型；接種黃萎病菌后，野生型煙草中NtNPR1基因上調(diào)表達，NtPR1基因表達量隨接種時間持續(xù)升高，轉(zhuǎn)基因植株中，NtNPR1基因表達量高于野生型，但NtPR1基因表達量低于野生型。Yan等[28]研究發(fā)現(xiàn)，水楊酸通路為SA→NPR1→TGA→PR-1→抗病。將GbRLCK10基因?qū)霟煵莺?，無論是病原菌接種前還是接種后轉(zhuǎn)基因植株中NtNPR1基因的表達量均高于野生型，但NtPR1基因表達量低于野生型，推測GbRLCK10基因可能通過調(diào)控TGA轉(zhuǎn)錄因子影響NtPR1基因表達，從而影響煙草對黃萎病的抗性。

研究表明，乙烯可以調(diào)控植物對腐生型病原菌的抗性[29-30]。棉花與黃萎病菌相互作用的機理非常復(fù)雜，Shaban等[31]認(rèn)為乙烯和茉莉酸信號通路協(xié)同作用對抗腐生病原體，在適當(dāng)?shù)臅r候乙烯下游信號分子通過與JA信號相互作用，參與黃萎病的抗性。本研究結(jié)果顯示，接種黃萎病菌前，轉(zhuǎn)基因植株中NtEIN4和NtNTHK2基因的表達量均低于野生型；接種黃萎病菌后，NtEIN4基因在野生型和轉(zhuǎn)基因植株中的表達模式相反，野生型中，該基因表現(xiàn)為隨著接種時間下調(diào)表達，但在轉(zhuǎn)基因植株中表現(xiàn)為上調(diào)表達，NtNTHK2基因在野生型和轉(zhuǎn)基因植株中均為下調(diào)表達，但該基因在轉(zhuǎn)基因植株中的表達量高于野生型。研究發(fā)現(xiàn)，擬南芥中的乙烯受體主要包括ETR1、ERS1、ETR2、ERS2、EIN4，這些受體間具有一定功能冗余性，是乙烯信號的負(fù)調(diào)控因子[32]。而煙草中乙烯受體基因的研究較少，除上述蛋白受體外，NtNTHK1、NtNTHK2為煙草中的乙烯受體蛋白[33]，研究表明， NtNTHK2蛋白是煙草中乙烯受體第二亞族的成員，NtNTHK2基因與擬南芥乙烯受體基因EIN4、ETR2和ETR1的同源性分別為56.3%、46.4%和32.8%[34]，由此推測，煙草中NTHK2蛋白功能與擬南芥EIN4功能相似，結(jié)合本研究結(jié)果，推測GbRLCK10基因?qū)霟煵莺笸ㄟ^調(diào)控乙烯受體基因NtEIN4和NtNTHK2的表達來調(diào)節(jié)煙草對黃萎病的抗性。

茉莉酸在植物抵抗生物脅迫和非生物脅迫過程中發(fā)揮重要作用[35]。擬南芥中茉莉酸信號通路的核心元件有COIl、JAZ蛋白和轉(zhuǎn)錄因子MYC2，其中JAZ蛋白作為茉莉酸信號通路的負(fù)向調(diào)控因子在介導(dǎo)植物抗病反應(yīng)中起重要作用[36-38]。當(dāng)JAZ基因缺失或表達量下降后，擬南芥對P.syringae的抗性明顯減弱[38]。丙二烯氧化物合成酶（allene oxide synthase, AOS）普遍存在于植物組織中，是茉莉酸合成通路的關(guān)鍵酶[39]。當(dāng)植物受到生物脅迫時該基因表達，通過控制茉莉酸的生物合成而參與調(diào)節(jié)植物生理過程，本研究表明，接種黃萎病菌前，轉(zhuǎn)基因植株中NtAOS基因的表達量低于野生型，NtJAZ1基因表達量高于野生型；接種黃萎病菌后，NtAOS基因在野生型和轉(zhuǎn)基因植株中均能被誘導(dǎo)表達，但在野生型中表達量更高。Yan等[28]通過分析黃萎病菌侵染海島棉的轉(zhuǎn)錄組發(fā)現(xiàn)，AOS基因在抗性品種中表達量更高，與本研究結(jié)果一致。在接種黃萎病菌前，NtJAZ1基因在轉(zhuǎn)基因植株中的表達量高于野生型；而接種黃萎病菌后，該基因在轉(zhuǎn)基因植株中的表達量也高于野生型，由此推斷，茉莉酸途徑參與了煙草對黃萎病菌的響應(yīng)，而GbRLCK10基因通過調(diào)節(jié)茉莉酸途徑NtJAZ1和NtAOS基因表達來調(diào)控轉(zhuǎn)基因植株對黃萎病菌的抵抗力。