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        基于RPA技術(shù)對(duì)轉(zhuǎn)CP4-EPSPS基因產(chǎn)品的快速檢測(cè)

        2023-05-17 06:47:32胡秀文鄧波王金斌劉華唐雪明王宇曾海娟蔣瑋李紅
        關(guān)鍵詞:條帶轉(zhuǎn)基因特異性

        胡秀文, 鄧波, 王金斌, 劉華*, 唐雪明, 王宇,曾海娟, 蔣瑋, 李紅

        (1.上海海洋大學(xué)食品學(xué)院,上海 201306; 2.上海市農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全中心,上海 201708; 3.上海農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所,上海 201106; 4.上海交通大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院,上海 200240; 5.蘭州理工大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院,蘭州 730050; 6.上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所,上海 201106)

        2019 年,全世界轉(zhuǎn)基因作物(genetically modified crops,GMC)的種植面積約27 億 hm2,比1996 年增加了約112 倍[1-2]。據(jù)統(tǒng)計(jì),全球五大種植國(guó)的轉(zhuǎn)基因作物應(yīng)用率已經(jīng)接近飽和,如美國(guó)(大豆、玉米和油菜的平均應(yīng)用率95%)、巴西(94%)、阿根廷(約100%)、加拿大(90%)和印度(94%)。目前,抗蟲和抗除草劑作物是最重要的2 種轉(zhuǎn)基因作物[3]。其中,轉(zhuǎn)基因抗草甘膦除草劑作物是將CP4-5-烯醇丙酮酸酯-3-磷酸合酶基因(CP4-5-enol acetate-3-phosphate synthase gene,CP4-EPSPS)[4]轉(zhuǎn)入作物基因組中[5-6],該基因表達(dá)的CP4-EPSPS 蛋白表現(xiàn)出對(duì)草甘膦較強(qiáng)的耐受性[7]。抗除草劑轉(zhuǎn)基因作物的種植面積約占43%,而具有抗除草劑和其他性狀的復(fù)合性狀占比約為45%。轉(zhuǎn)基因作物廣泛種植對(duì)環(huán)境的風(fēng)險(xiǎn)引起了公眾的極大關(guān)注,因此,研究轉(zhuǎn)入CP4-EPSPS基因的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品及其制品對(duì)于食品安全和預(yù)防生態(tài)潛在風(fēng)險(xiǎn)具有重要意義。全球用于食品、飼料、加工和種植用途的轉(zhuǎn)基因作物轉(zhuǎn)化體的批準(zhǔn)數(shù)目越來越多,其中占比最高的是大豆、玉米、棉花和油菜。由于轉(zhuǎn)基因作物的迅速推廣,一些非法轉(zhuǎn)基因作物逐漸顯現(xiàn)。2020年12月歐盟食品和飼料類快速預(yù)警系統(tǒng)(Rapid Alert System for Food and Feed,RASFF)對(duì)華食品通報(bào)中指出,非法轉(zhuǎn)基因問題是我國(guó)食品出口貿(mào)易的主要問題[8]。盡管許多國(guó)家已經(jīng)實(shí)施了嚴(yán)格的轉(zhuǎn)基因標(biāo)簽規(guī)定,但未經(jīng)授權(quán)和不受控制的轉(zhuǎn)基因作物種植依然被發(fā)現(xiàn)。因此,對(duì)轉(zhuǎn)基因作物的檢測(cè)在農(nóng)產(chǎn)品安全監(jiān)管中至關(guān)重要,迫切需要一種快速、靈敏、便攜、低成本和易操作的檢測(cè)技術(shù)對(duì)轉(zhuǎn)基因作物進(jìn)行檢測(cè)。

        目前,聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction,PCR)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)和蛋白質(zhì)測(cè)試條是檢測(cè)轉(zhuǎn)基因作物最常用的方法[9]?;诘鞍踪|(zhì)水平的檢測(cè)方法,如ELISA或膠體金試紙條,獲得轉(zhuǎn)基因抗原的抗體較難,且制備過程耗時(shí)又昂貴,故基于蛋白質(zhì)水平的檢測(cè)方法適用的轉(zhuǎn)基因作物靶標(biāo)蛋白有限。PCR技術(shù)是核酸檢測(cè)水平上最常用的方法,然而,由于檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)和需要熱循環(huán)儀等限制因素,無法做到現(xiàn)場(chǎng)速測(cè)。近年來出現(xiàn)的等溫?cái)U(kuò)增方法[10-11],如 環(huán) 介 導(dǎo) 等 溫 擴(kuò) 增[12](loop-mediated isothermal amplification,LAMP)、交叉引物擴(kuò)增[13](cross-priming amplification,CPA)和 滾 環(huán) 擴(kuò) 增[14](rolling circle amplification,RCA),雖已克服熱循環(huán)儀的限制,但多數(shù)仍需要長(zhǎng)達(dá)1 h才能完成DNA擴(kuò)增。

        自2006 年以來,省時(shí)和方便的重組酶聚合酶擴(kuò) 增(recombinase polymerase amplification,RPA)[15-16]技術(shù)成為廣泛應(yīng)用于病毒檢測(cè)的等溫核酸檢測(cè)技術(shù)之一,該系統(tǒng)識(shí)別度高且速度快,能夠?qū)袠?biāo)片段快速擴(kuò)增至可檢測(cè)水平[17-18],主要由3種核心酶組成,包括重組酶、單鏈DNA結(jié)合蛋白(single-stranded DNA-binding protein,SSB)和鏈狀聚合酶。在反應(yīng)開始時(shí),引物定位于同源序列,進(jìn)行鏈交換反應(yīng)以形成和啟動(dòng)DNA 合成,并以指數(shù)擴(kuò)增模板上的靶標(biāo)區(qū)域,其擴(kuò)增產(chǎn)物在10 min 內(nèi)便可達(dá)到檢測(cè)水平;反應(yīng)結(jié)束后,采用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物。與傳統(tǒng)PCR 相比,RPA 因其所需時(shí)間短、且實(shí)現(xiàn)等溫(37~42 ℃)擴(kuò)增而廣受歡迎[19],已廣泛應(yīng)用于病毒或細(xì)菌的檢測(cè)[20-22]。食品安全問題與民生息息相關(guān),為有效防控食品安全風(fēng)險(xiǎn),開展特異、靈敏、快速的食源性致病菌及轉(zhuǎn)基因作物核酸檢測(cè)是關(guān)鍵。為實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)CP4-EPSPS基因作物的快速檢測(cè),本研究采用RPA 技術(shù)建立了一種快速、靈敏度高、特異強(qiáng)的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品及其制品的檢測(cè)方法,該方法利用一對(duì)特異性引物,在恒溫條件下,可快速擴(kuò)增出特異性DNA片段,并對(duì)該反應(yīng)體系進(jìn)行優(yōu)化,選取最佳反應(yīng)溫度。該方法符合轉(zhuǎn)基因作物的快速檢測(cè)要求,縮短了擴(kuò)增時(shí)間,為大規(guī)模篩查CP4-EPSPS基因提供了一種新的途徑。

        1 材料與方法

        1.1 試驗(yàn)材料

        以轉(zhuǎn)基因玉米(NK603)、轉(zhuǎn)基因苜蓿(J101)、轉(zhuǎn)基因油菜(GT73)、轉(zhuǎn)基因甜菜(H7-1)、轉(zhuǎn)基因大 豆(MON89788)、轉(zhuǎn) 基 因 棉 花(Mon1445 和Mon88913)和非轉(zhuǎn)基因玉米為試驗(yàn)材料。其中,轉(zhuǎn)基因玉米、轉(zhuǎn)基因苜蓿、轉(zhuǎn)基因油菜和轉(zhuǎn)基因甜菜購(gòu)買于美國(guó)石油化學(xué)學(xué)會(huì)(American Oil Chemists' Society,AOCS)及標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)與測(cè)量研究所(Institute of Reference Materialsand Metrology,IRMM);轉(zhuǎn)基因棉花、大豆和非轉(zhuǎn)基因玉米由農(nóng)業(yè)部作物生態(tài)與環(huán)境安全監(jiān)測(cè)中心提供;轉(zhuǎn)基因大豆MON89788 由本實(shí)驗(yàn)室提供。材料列表如表1所示。選取轉(zhuǎn)基因棉花MON88913 作為CP4-EPSPS特異性、靈敏度及條件優(yōu)化的研究對(duì)象。

        表1 試驗(yàn)材料Table 1 Experimental materials

        1.2 試驗(yàn)試劑

        RPA 引物、ssDNA 和CrRNA 由生物工程有限公司(中國(guó)上海)合成;RNase抑制劑購(gòu)自生物工程有限公司;RPA檢測(cè)試劑盒購(gòu)自TwistDx有限公司;植物基因組提取試劑盒購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司。

        1.3 DNA提取

        將轉(zhuǎn)基因材料種子用研磨機(jī)粉碎,稱取0.1 g,利用基因組提取試劑盒提取并純化植物基因組DNA,使用NanoDrop 1000 UV/Vis 分光光度計(jì)(Thermo Scientific)和1%瓊脂糖凝膠電泳測(cè)定DNA樣品的質(zhì)量和濃度,備用。

        1.4 RPA引物設(shè)計(jì)

        依據(jù)RPA引物設(shè)計(jì)原則,包括長(zhǎng)度30~35個(gè)堿基,最好不要超過45 個(gè)堿基,以形成最佳的重組酶-引物聚合體;適宜的GC 含量(30%~70%),避免過低或過高;擴(kuò)增產(chǎn)物大小為80~400 bp(最佳為150~350 bp)。因此,根據(jù)設(shè)計(jì)原則采用Primer Premier 5.0 軟件對(duì)抗草甘膦基因CP4-EPSPS設(shè)計(jì)引物,序列詳見表2。

        表2 RPA引物Table 2 RPA primers

        1.5 RPA擴(kuò)增及條件優(yōu)化

        為了選擇最佳的反應(yīng)溫度,根據(jù)試劑盒的建議,RPA 反應(yīng)溫度分別設(shè)置為35、36、37、38、39、40、41 和42 ℃。除反應(yīng)溫度外,還對(duì)RPA 體系進(jìn)行優(yōu)化,總反應(yīng)體系分別設(shè)置為50、25、20 和15 μL,具體各成分加入量如表3所示。

        表3 RPA體系優(yōu)化Table 3 RPA system optimization

        RPA 擴(kuò)增使用TwistAmp basic 試劑盒(TwistDX,Cambridge,UK)進(jìn)行。選取轉(zhuǎn)基因棉花MON88913 基因組進(jìn)行擴(kuò)增,首先,反應(yīng)物平均分配到每個(gè)含有凍干顆粒的反應(yīng)管中,并充分混合;其次,將相應(yīng)的MgOAc 放在試管的蓋子上,將反應(yīng)混合物管倒置10 次以確?;旌狭己煤?,短暫離心后在恒溫?cái)U(kuò)增儀上進(jìn)行反應(yīng);15 min后取出,短暫離心,然后加入50 μL 苯酚-氯仿,充分混勻后以12 000 r·min-1離心10 min,留上清(有RPA 擴(kuò)增產(chǎn)物);最后用3%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。

        1.6 RPA反應(yīng)的特異性與靈敏性

        將擴(kuò)增產(chǎn)物片段進(jìn)行克隆,獲得質(zhì)粒,測(cè)定質(zhì)粒濃度并計(jì)算拷貝數(shù)。將獲得的MON88913棉花質(zhì)粒進(jìn)行連續(xù)稀釋,稀釋濃度至每微升為10~100個(gè)拷貝(108~100),以10倍稀釋梯度進(jìn)行靈敏度檢測(cè)試驗(yàn)。

        2 結(jié)果分析

        2.1 RPA引物篩選

        由圖1 可知,RPA 獲得了長(zhǎng)度為140~204 bp的特異性條帶,5 對(duì)引物均能成功擴(kuò)增得到目標(biāo)條帶,而陰性對(duì)照無可見條帶。引物RPA-CP4-3、RPA-CP4-4和RPA-CP4-5出現(xiàn)擴(kuò)增條帶,其中引物RPA-CP4-4的擴(kuò)增效果最優(yōu)。因此引物RPACP4-4的特異性強(qiáng),擴(kuò)增產(chǎn)物片段為167 bp,適合于RPA擴(kuò)增。

        圖1 RPA-CP4-1~RPA-CP4-5的擴(kuò)增產(chǎn)物Fig. 1 Amplification products of RPA-CP4-1~RPA-CP4-5

        2.2 RPA體系優(yōu)化

        為降低試驗(yàn)成本,對(duì)RPA 反應(yīng)體系進(jìn)行優(yōu)化,結(jié)果(圖2)表明,隨著整個(gè)反應(yīng)體系不斷縮小,反應(yīng)穩(wěn)定性逐漸降低。當(dāng)反應(yīng)體系為50、25和20 μL,瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果間無顯著差異;當(dāng)反應(yīng)體系為15 μL時(shí),條帶模糊。因此,20 μL的RPA 反應(yīng)體系為最佳反應(yīng)體系,在保證體系擴(kuò)增穩(wěn)定性的基礎(chǔ)上,降低了每份樣品的檢測(cè)成本,可用于后續(xù)試驗(yàn)。

        圖2 不同體積反應(yīng)體系的擴(kuò)增產(chǎn)物Fig. 2 Amplification products of different reaction system

        溫度對(duì)RPA 起著關(guān)鍵的作用。由圖3 可知,隨著溫度的增加(36~39 ℃),條帶逐漸變亮且更加清晰;當(dāng)溫度達(dá)到40 ℃后,隨著溫度的增加條帶又開始變淡,且出現(xiàn)雜帶。由此表明,RPA 對(duì)溫度要求較低,35~41 ℃范圍內(nèi)均有擴(kuò)增條帶,且特異性較強(qiáng);當(dāng)溫度為37 ℃時(shí),條帶較清晰且無雜帶,為最佳反應(yīng)溫度,可用于后續(xù)試驗(yàn)。

        圖3 不同反應(yīng)溫度的擴(kuò)增產(chǎn)物Fig. 3 Amplification products of different reaction temperatures

        2.3 RPA特異性檢測(cè)

        為評(píng)估引物的特異性,將引物RPA-CP4-4用于檢測(cè)多種轉(zhuǎn)基因作物,包括含有Cry基因的轉(zhuǎn)基因玉米BT-11、轉(zhuǎn)基因水稻克螟稻(KMD),含有PAT基因的轉(zhuǎn)基因玉米59112、MON863、轉(zhuǎn)基因油菜RF1 及非轉(zhuǎn)基因大豆、玉米等。在37 ℃反應(yīng)15 min,結(jié)果(圖4)表明,僅含有CP4-EPSPS基因的轉(zhuǎn)基因棉花MON88913 為陽(yáng)性,其余不含CP4-EPSPS基因的材料均為陰性。此外,將上述轉(zhuǎn)基因作物進(jìn)行混樣(同等質(zhì)量1∶1∶1進(jìn)行混合)后提取DNA 進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果為陽(yáng)性。由此可見,引物RPA-CP4-4具有較好的特異性,且條帶單一,適宜用于轉(zhuǎn)CP4-EPSPS基因作物的檢測(cè)。

        圖4 RPA特異性檢測(cè)Fig. 4 RPA specificity detection

        2.4 RPA靈敏度檢測(cè)

        靈敏度檢測(cè)結(jié)果如圖5 所示,從4.5×107~4.5×105,其擴(kuò)增條帶均清晰、單一,且亮度基本一致;從104開始逐級(jí)遞減,條帶逐漸變暗;100時(shí)未觀察到條帶。由此可見,RPA 表現(xiàn)出較高的靈敏性,最低檢出限為45 拷貝,和熒光定量PCR 的檢出限一致。

        圖5 RPA靈敏度檢測(cè)Fig. 5 RPA sensitivity detection

        2.5 轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品及其制品檢測(cè)

        為了驗(yàn)證RPA 擴(kuò)增體系在實(shí)際樣品檢測(cè)中的穩(wěn)定性,對(duì)含有CP4-EPSPS的轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物進(jìn)行檢測(cè),選取10份含有CP4-EPSPS的不同種類的轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物,包括苜蓿、大豆、玉米、棉花、甜菜等,用優(yōu)化后的重組酶聚合酶擴(kuò)增技術(shù)法進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果(圖6)表明,所有樣品均能擴(kuò)增出目的片段,且條帶清晰,說明該反應(yīng)具有良好的穩(wěn)定性。

        圖6 轉(zhuǎn)基因制品檢測(cè)Fig. 6 Detection of genetically modified products

        3 討論

        近年來,越來越多的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品應(yīng)用于生產(chǎn)實(shí)踐,因此,各種檢測(cè)方法也應(yīng)運(yùn)而生(表4)。多數(shù)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的檢測(cè)方法基于PCR 等試驗(yàn)技術(shù),如PCR、實(shí)時(shí)PCR 或數(shù)字PCR 等,這些技術(shù)需要特殊的試驗(yàn)條件;而基于蛋白質(zhì)分析的酶聯(lián)免疫反應(yīng)、免疫傳感器等需要較長(zhǎng)的時(shí)間。與上述方法相比,RPA 具有步驟簡(jiǎn)單、操作方便、結(jié)果直觀等優(yōu)點(diǎn),且不需要昂貴的儀器和復(fù)雜的預(yù)處理程序。此外,該方法特異性和靈敏度高、穩(wěn)定性好,有利于轉(zhuǎn)基因作物的檢測(cè)。RPA 的低溫操作(近體溫)及其較小的樣品制備要求,使得該體系可檢測(cè)各種生物樣品,例如血清、糞便、尿液、牛奶、鼻腔、陰道、血漿、食品、植物和動(dòng)物組織等。

        表4 核酸檢測(cè)方法比較Table 4 Comparison of nucleic acid detection methods

        本研究將RPA 應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因生物的快速檢測(cè),該方法不僅提高了檢測(cè)效率(15 min內(nèi)完成),對(duì)CP4-EPSPS的檢出限為45個(gè)拷貝,具有較高的特異性、準(zhǔn)確性和靈敏度。采用LAMP 進(jìn)行核酸檢測(cè)時(shí),擴(kuò)增溫度需65 ℃[28],而RPA 只需室溫左右即可進(jìn)行反應(yīng),因此更適合用來快速篩選。此外在RPA 檢測(cè)過程中,其引物對(duì)于該反應(yīng)系統(tǒng)至關(guān)重要,本研究發(fā)現(xiàn)擴(kuò)增片段越大,越不易出現(xiàn)DNA 污染現(xiàn)象;且引物設(shè)計(jì)時(shí),應(yīng)盡量避免產(chǎn)生二聚體。近年來,CRISPR-Cas(clustered regularly interspaced short palindromic repeats)系統(tǒng)展示了其強(qiáng)大的分子檢測(cè)潛在能力,未來將RPA 技術(shù)與其結(jié)合可能會(huì)成為新的檢測(cè)平臺(tái),為轉(zhuǎn)基因產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展保駕護(hù)航。

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