張曼， 王志城， 劉正文， 王國寧， 王省芬， 張艷

（河北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，華北作物改良與調(diào)控國家重點實驗室，河北省作物種質(zhì)資源重點實驗室，河北 保定 071000）

棉花是重要的經(jīng)濟(jì)作物，對中國經(jīng)濟(jì)發(fā)展有著重要的作用。繼二倍體雷蒙德氏棉（Gossypium raimondii）[1]和亞洲棉(Gossypium arboreum)[2]測序完成，生產(chǎn)上應(yīng)用最廣泛的陸地棉（Gossypium hirsutum）和海島棉（Gossypium barabdense）基因組序列也已繪制完成[3-4]，標(biāo)志著棉花研究進(jìn)入了后基因組時代，為開展基因家族的全基因組鑒定與生物信息學(xué)分析提供了基礎(chǔ)信息。

β-葡萄糖苷酶（β-glucosidase）EC3.2.1.21，又稱β-D-葡萄糖糖苷水解酶，屬于纖維素酶類，是纖維素分解酶系中的重要組成成分。β-葡萄糖苷酶能夠從含糖化合物中催化水解末端的非還原性β-D-葡萄糖苷鍵，同時釋放β-D-葡萄糖和相應(yīng)的配基[5]。在高等植物中，β-葡萄糖苷酶主要包括糖基水解酶家族1 (glycoside hydrolase family 1,GH1)[6]，其廣泛參與防御反應(yīng)[7]、細(xì)胞壁木質(zhì)化[8]、植物激素信號激活[9-10]和次生代謝[11]等重要生理過程。通過對β-葡萄糖苷酶家族的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)擬南芥AtBGLU45、AtBGLU46和AtBGLU47與松柏（Pinus contorta conifin）β-葡萄糖苷酶基因聚為一類，它們可能通過水解單酚苷參與木質(zhì)化過程[12]。抑制水稻Os3BGLU6的表達(dá)導(dǎo)致植株矮化、葉片中ABA 含量降低、干旱敏感性增加、光合速率降低、細(xì)胞間CO2濃度升高，影響植株的耐旱性[13]。比較分析5 種薔薇科植物的β-葡萄糖苷酶家族全基因組發(fā)現(xiàn)，梨(Pyrus bretschneideri)果實中BGLU基因與木質(zhì)化和石細(xì)胞發(fā)育有關(guān)[14]。水稻（Orazy sativa）中的OsGH3基因可以調(diào)控生長激素、茉莉酸和水楊酸信號通路之間的串聯(lián)，從而影響水稻對生物和非生物脅迫的耐受性[15]。β-葡萄糖苷酶家族除了參與植物的細(xì)胞壁代謝及激素的激活外，還在植物逆境脅迫的防御反應(yīng)中起重要作用。

生物信息學(xué)在全基因組分析中發(fā)揮著越來越重要的作用，棉花的多個重要基因家族已經(jīng)通過全基因組分析取得了重要成果[16-17]。目前，從基因組水平解析棉花β-葡萄糖苷酶基因（BGLU）家族的相關(guān)研究還未見報道。本研究從全基因組水平鑒定了陸地棉中的BGLU基因家族成員，對各成員的基因結(jié)構(gòu)、染色體定位、系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系、啟動子調(diào)控元件等進(jìn)行了系統(tǒng)分析，并結(jié)合黃萎病菌處理后的抗病‘農(nóng)大601'的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)對參與黃萎病抗性反應(yīng)的GhBGLU基因進(jìn)行了篩選和相關(guān)qPCR 驗證，為后續(xù)深入研究BGLU基因在陸地棉中的功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 GhBGLU基因家族的鑒定

根據(jù)GhBGLU基因序列對最新版本的高質(zhì)量陸地棉基因組（https://cottonfgd.org/）進(jìn)行BLAST搜索，確定候選基因，進(jìn)一步利用GhBGLU家族特有保守結(jié)構(gòu)域（PF00232）通過Pfam 數(shù)據(jù)庫[18]（http://pfam.xfam.org/）和NCBI CD-Search 數(shù)據(jù)庫（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd/）進(jìn)行驗證，剔除冗余序列后，最終得到陸地棉BGLU家族成員的序列。

1.2 GhBGLU家族多重序列比對及進(jìn)化樹構(gòu)建

通過Clustal W 程序?qū)﹃懙孛轇GLU 氨基酸序列進(jìn)行多序列比對[19]，利用MEGA 7.0 軟件的鄰接法（Neighbor-Joining, NJ）構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，Bootstrap重復(fù)測試（replications）設(shè)置為1 000。

1.3 GhBGLU家族基因生物信息學(xué)分析

利用在線軟件MEME （http://meme.sdsc.edu/meme/）分析保守結(jié)構(gòu)域，結(jié)合GhBGLU家族基因外顯子-內(nèi)含子結(jié)構(gòu)，利用TBtools 進(jìn)行可視化。根據(jù)基因組結(jié)構(gòu)注釋文件的基因信息可知各BGLU家族成員在染色體上的位置，利用MapChart 軟件進(jìn)行基因染色體定位。使用MCScanX 軟件對陸地棉GhBGLU家族成員的共線性進(jìn)行分析[20]，最后使用Circos 軟件對結(jié)果進(jìn)行可視化展示[21]。利用TBtools 軟件對共線性基因進(jìn)行Ka/Ks計算，并評估其進(jìn)化選擇方向[22]。從陸地棉基因組數(shù)據(jù)庫中選取BGLU家族中起始密碼子ATG 上游2 000 bp 的序列，利用PlantCARE 數(shù)據(jù)庫（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）分析其可能存在的順式作用元件，篩選后利用TBtools軟件作圖。

1.4 GhBGLU 基因家族在黃萎病脅迫下的表達(dá)量熱圖繪制

利用本實驗室大麗輪枝菌脅迫的棉花轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫[23]進(jìn)行BGLU家族基因表達(dá)模式分析，使用TBtools 軟件繪制BGLU基因家族各成員表達(dá)量熱圖。

1.5 GhBGLU基因的qRT-PCR

以本實驗室保存的陸地棉抗病品種‘農(nóng)大601'（ND601）為材料，在黃萎病菌脅迫6、12、24、36、48 h后取根部樣品，提取RNA并進(jìn)行Real-time PCR。以UBQ作為內(nèi)參，采用 2-△△CT法[24]計算基因的相對表達(dá)量，每個基因的表達(dá)反應(yīng)有3個生物重復(fù)和3個技術(shù)重復(fù)。本文所用引物詳見表1。

表1 本研究中所用qRT-PCR引物序列Table 1 Primer sequences for qRT-PCR in this study

2 結(jié)果與分析

2.1 GhBGLU基因家族鑒定與理化性質(zhì)分析

在陸地棉‘TM-1'基因組中共鑒定到53 個編碼GhBGLU基因的家族成員，根據(jù)它們在染色體上的位置分別命名為GhBGLU01～GhBGLU53（表2）。GhBGLU基因編碼的氨基酸范圍在121～546 aa 之間，蛋白質(zhì)分子量分布在13.9～66.3 kD 之間；等電點變化范圍則從4.694～9.728。利用不同的軟件對GhBGLU基因家族成員進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測，分析結(jié)果顯示，GhBGLU家族不同成員定位于細(xì)胞質(zhì)膜、液泡、胞質(zhì)、胞外和溶酶體中。信號肽預(yù)測發(fā)現(xiàn)，53 個基因家族成員在N 末端均存在信號肽，且有16 個成員含有跨膜域，推測它們可能為分泌蛋白。

2.2 GhBGLU家族基因的系統(tǒng)發(fā)育分析

基于陸地棉和擬南芥蛋白序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，GhBGLU基因被分為6 個亞家族（A～F）（圖1），每個亞族均同時包含GhBGLU和AtBGLU基因，表明這些成員功能保守。AT1G52400、AT2G44490、AT5G57220、AT1G51490、AT3G09260等基因參與了擬南芥對病菌及蟲害的防御反應(yīng)[25]。另外，擬南芥AT2G44450可催化黃酮類物質(zhì)的合成反應(yīng)[26]；AT3G09260、AT3G15950參與了茉莉酸調(diào)控通路[27]；AT5G52310、AT5G60360通過調(diào)節(jié)脫落酸水解活性在擬南芥滲透脅迫響應(yīng)中起重要作用[28]。根據(jù)同源進(jìn)化關(guān)系，推測棉花中與擬南芥同源的這些基因可能參與了棉花對生物、非生物的脅迫響應(yīng)。

圖1 陸地棉和擬南芥BGLU基因家族進(jìn)化分析Fig. 1 Phylogenetic analysis of BGLU proteins in G. hirsutum and Arabidopsis

2.3 GhBGLU 家族基因的染色體定位、基因結(jié)構(gòu)和保守域分析

根據(jù)基因位置信息，發(fā)現(xiàn)陸地棉中53 個GhBGLU基因不均勻地分布在除A 亞組第3、4 號染色體和D亞組第2、4號染色之外的22條染色體上，且主要分布在染色體兩端（圖2）。此外，GhBGLU在A、D亞基因組間無明顯偏好性。

圖2 陸地棉BGLU基因家族成員的染色體分布Fig. 2 Chromosomal location of the GhBGLU genes in G. hirsutum

陸地棉GhBGLU基因編碼的蛋白含有8 種motif，分別命名為motif 1～motif 8（圖3）。這些motif 在GhBGLU家族大部分成員中均有出現(xiàn)，為該家族的保守基序，推測其在該家族中行使基本功能。GhBGLU家族外顯子個數(shù)變異較大，GhBGLU17、GhBGLU38、GhBGLU44僅含有1 個外顯子，而GhBGLU4基因含有的外顯子高達(dá)14 個。大豆[29]和水稻[30]中外顯子數(shù)目基本在11～13 左右，個別基因出現(xiàn)了8～9個。

圖3 陸地棉GhBGLU基因家族保守基序Fig. 3 Conserved motifs of GhBGLU gene family in G. hirsutum

2.4 GhBGLU 家族基因共線性及順式作用元件分析

為研究GhBGLU家族基因進(jìn)化的關(guān)系，使用MCScanX 軟件進(jìn)行共線性分析，共發(fā)現(xiàn)21對共線性基因?qū)?。A、D 亞組中均發(fā)現(xiàn)2 對片段復(fù)制基因，A 亞組和D 亞組之間有17 對同源基因呈絕對共線性（圖4）。通過計算上述基因?qū)Φ姆峭x突變率與同義突變率的比值（Ka/Ks）發(fā)現(xiàn)，同源基因?qū)Φ腒a/Ks均小于1，表明這些基因在進(jìn)化過程中受到了純化選擇。

圖4 陸地棉GhBGLU共線性分析Fig.4 Collinearity analysis of GhBGLU in G. hirsutum

通過對GhBGLU基因上游2 000 bp 序列的啟動子區(qū)順式作用元件進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，存在與激素信號相關(guān)的脫落酸（abscisic acid, ABA）響應(yīng)元件、赤霉素（gibberellic acid, GA）響應(yīng)元件、auxin響應(yīng)元件、水楊酸（salicyclic acid, SA）應(yīng)答元件、茉莉酸甲酶（methyl jasmonate, MeJA)應(yīng)答元件以及與環(huán)境脅迫相關(guān)的低溫應(yīng)答元件、干旱應(yīng)答元件和防御脅迫應(yīng)答元件（圖5），其中，MeJA 反應(yīng)元件最豐富（121 個）。上述應(yīng)答元件的富集表明，棉花BGLU基因可能參與了植物對各種病原菌及環(huán)境脅迫的響應(yīng)。

圖5 陸地棉GhBGLU啟動子順式作用元件分析Fig.5 Analysis of cis-acting elements of GhBGLU promoter in G. hirsutum

2.5 黃萎病菌脅迫下GhBGLU基因表達(dá)分析

利用黃萎病菌脅迫下抗病陸地棉農(nóng)大601 的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫[23]，依據(jù)GhBGLU基因家族成員接菌后不同時間點的RPKM 值構(gòu)建基因表達(dá)熱圖，共篩選出33個GhBGLU基因在大麗輪枝菌脅迫下差異表達(dá)（圖6），表現(xiàn)為2 種模式：一種是基因在病菌脅迫處理后表達(dá)量出現(xiàn)上升趨勢，包括GhBGLU5、GhBGLU34等，表明這些基因在棉花抗黃萎病反應(yīng)中起正調(diào)控作用；另一種是在黃萎病菌處理后基因表達(dá)量呈現(xiàn)出下降趨勢，包括GhBGLU22、GhBGLU52等，表明這些基因在棉花抗黃萎病反應(yīng)中起負(fù)調(diào)控作用。

圖6 陸地棉大麗輪枝菌脅迫下GhBGLU基因表達(dá)分析Fig. 6 GhBGLU genes expression under Verticillium dahliae stress

2.6 不同抗性棉花品種中GhBGLU基因的表達(dá)分析

為明確上述響應(yīng)大麗輪枝菌脅迫的GhBGLU基因是否參與棉花抗病反應(yīng)，從表達(dá)差異明顯的基因中挑選了9 個成員，進(jìn)一步在不同抗感棉花品種中檢測這9 個基因的表達(dá)水平（圖7）。熒光定 量PCR 結(jié) 果 顯 示，GhBGLU5、GhBGLU14、GhBGLU18、GhBGLU26、GhBGLU34、GhBGLU33在受到黃萎病菌脅迫后，表達(dá)量顯著提高，且在抗病品種‘ND601'中的表達(dá)量顯著高于感病品種‘CCRI8'，推測上述基因正向調(diào)控棉花黃萎病的抗性。GhBGLU22、GhBGLU40、GhBGLU52表達(dá)量在‘ND601'中顯著下調(diào)，但在‘CCRI8'中的表達(dá)沒有明顯規(guī)律，需要進(jìn)一步研究其參與黃萎病菌抗性的作用方式。此外，在接菌后12 h 的抗病品種‘澳SiV2'和感病品種‘湘棉18'的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中也發(fā)現(xiàn)，上述9個基因中的7個基因在‘澳SiV2'的轉(zhuǎn)錄水平高于‘湘棉18'中，與熒光定量結(jié)果較吻合。結(jié)合抗感品熒光定量和轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果，推測GhBGLU5、GhBGLU14、GhBGLU18、GhBGLU26、GhBGLU34在抗黃萎病反應(yīng)中起正調(diào)控作用。

圖7 黃萎病菌脅迫下9個GhBGLU基因的表達(dá)分析Fig. 7 Analysis of the expression of 9 GhBGLU genes under the stress of V. dahliae

3 討論

β-葡萄糖糖苷酶參與植物體內(nèi)的各類生理過程，主要在植物次生代謝及逆境脅迫中發(fā)揮重要作用[5]。本研究利用生物信息學(xué)手段從陸地棉中共鑒定出53 個BGLU家族基因，它們不均勻地分布在22 條染色體上，且主要分布在染色體兩端，包含8 個典型保守基序。大多數(shù)BGLU家族基因都是成對出現(xiàn)的，同源性高，推測這些基因在功能上有一定的相似性。通過系統(tǒng)發(fā)育分析，53 個BGLU家族基因被分為6 個亞組，且每個亞組均有擬南芥出現(xiàn)，表明棉花BGLU基因與擬南芥BGLU基因具有同源性，但是擬南芥成員分布不均，導(dǎo)致棉花在某些蛋白序列表現(xiàn)出進(jìn)化過程中的差異，可能和物種的自然選擇有關(guān)系。共線性分析發(fā)現(xiàn)了21 對基因?qū)?，同源基因?qū)Φ腒a/Ks均小于1，表明這些基因在進(jìn)化過程中受到了純化選擇。亞細(xì)胞定位結(jié)果顯示這些成員均定位在胞外，N 端均存在信號肽，表明該家族基因功能保守。

通過對幾種已測序的模式植物進(jìn)行研究，如擬南芥[31]、苜蓿[32]、玉米[33]、水稻[34]，發(fā)現(xiàn)BGLU基因均響應(yīng)生物和非生物脅迫，與激活植物激素和防御化合物相關(guān)。植物BGLU基因家族對病菌脅迫有著不同程度的響應(yīng)，其應(yīng)答機(jī)制也不盡相同，擬南芥BGLU基因家族與抗病相關(guān)的通路均有關(guān)聯(lián)，如木質(zhì)素[35]、水楊酸[36]、黃酮醇[37]、乙烯[38]。AtBGLU6(AT1g60270)過表達(dá)可以調(diào)控異黃酮的積累，提高植物對病菌脅迫防御。OsbspP(BGLU_RS28885)的缺失減弱了水稻稻瘟病對寄主的侵染力。研究表明，GhBGLU與β-1，3-葡聚糖酶同屬于GH 超家族，定位于液泡和胞外的β-1，3-葡聚糖酶可以通過降解真菌細(xì)胞壁相關(guān)成分對病原菌進(jìn)行防御[39-40]，亞細(xì)胞定位預(yù)測將GhBGLU家族中的多個成員定位在液泡或胞外，推測其可能與β-1，3-葡聚糖酶發(fā)揮類似的功能。

本研究分析了陸地棉BGLU基因家族對黃萎病脅迫的響應(yīng)，發(fā)現(xiàn)大多數(shù)GhBGLU基因受黃萎病菌脅迫后顯著表達(dá)，表明棉花可通過調(diào)控部分BGLU基因來提高植物對病原菌抗性。對GhBGLU基因家族進(jìn)行順式作用元件分析，發(fā)現(xiàn)多個與抗病相關(guān)的應(yīng)答元件，如多種激素應(yīng)答元件、防御相關(guān)應(yīng)答元件和非生物脅迫應(yīng)答元件等。植物激素水楊酸、茉莉酸被認(rèn)為是植物抗病防衛(wèi)反應(yīng)的內(nèi)源及中間信號分子，而MeJA 作為數(shù)目最多的應(yīng)答元件可以直接對病原菌起到抑制作用，并作為抗病防衛(wèi)反應(yīng)的內(nèi)源及中間信號分子發(fā)揮作用[41]。因此，推測GhBGLU基因啟動子序列中植物激素響應(yīng)元件可能調(diào)控棉花抗病過程。根據(jù)qRT-PCR 結(jié)果，棉花中有6 個GhBGLU基因受黃萎病菌誘導(dǎo)后表達(dá)量顯著上調(diào)，3 個GhBGLU基因受黃萎病菌誘導(dǎo)后表達(dá)量顯著下調(diào)，這些BGLU基因可能作為介導(dǎo)棉花對黃萎病抗性的調(diào)控因子，在響應(yīng)黃萎病脅迫中具有重要作用，具體的抗病機(jī)制還需要進(jìn)一步研究。