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        腎陽(yáng)虛帶狀皰疹后遺神經(jīng)痛大鼠模型的建立與評(píng)價(jià)

        2023-05-16 01:15:58丘雅丹黃佳敏付夢(mèng)思
        當(dāng)代醫(yī)藥論叢 2023年9期
        關(guān)鍵詞:肛溫腎陽(yáng)虛造模

        丘雅丹,謝 芳,黃佳敏,付夢(mèng)思,唐 挺,2★

        (1.貴州中醫(yī)藥大學(xué),貴州 貴陽(yáng) 550002;2.貴州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院皮膚科,貴州 貴陽(yáng) 550001)

        帶狀皰疹后遺神經(jīng)痛(postherpetic neuralgia,PHN)是一種復(fù)雜且特殊的慢性神經(jīng)病理性疼痛,其發(fā)病機(jī)制非常復(fù)雜,目前仍未完全闡明。諸多研究表明,中醫(yī)藥單獨(dú)使用或與其他療法聯(lián)合使用,在臨床痛癥相關(guān)疾病的治療中發(fā)揮著重要作用。建立合理、科學(xué)、可行的中醫(yī)證候疾病模型,有助于基于中醫(yī)基礎(chǔ)理論深入探究疾病的發(fā)病機(jī)制。本研究為更好地模擬臨床患者體質(zhì),擬構(gòu)建腎陽(yáng)虛P(yáng)HN 大鼠模型,并對(duì)其進(jìn)行評(píng)價(jià)。

        1 材料與方法

        1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

        SD 健康雄性大鼠30 只,SPF 級(jí),體重300 ~350 g/只,購(gòu)自長(zhǎng)沙市天勤生物技術(shù)有限公司,動(dòng)物許可證號(hào):SCXK(湘)2019-0014。將大鼠分籠飼養(yǎng),自由飲食,室內(nèi)濕度、溫度恒定,12 h/12 h 明暗周期。適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周后進(jìn)行耳釘標(biāo)記編號(hào),稱(chēng)取并記錄大鼠的體重。隨機(jī)將大鼠分為空白對(duì)照組和模型組,每組各15 只。

        1.2 實(shí)驗(yàn)主要藥品及試劑

        甲巰咪唑片〔默克制藥(江蘇)有限公司,進(jìn)口藥品注冊(cè)證號(hào)J20171078〕;Vero 細(xì)胞(非洲綠猴腎細(xì)胞)(武漢普諾賽生命科技有限公司,CL-0242);蘇木素- 伊紅(HE)染液;cAMP ELISA Kit(武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司);cGMP ELISA Kit(武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司)。

        1.3 實(shí)驗(yàn)主要儀器

        10 μL 微量注射器(Hamilton);Von Frey 電子測(cè)痛儀(上海玉研科學(xué)儀器有限公司);YLS-21A 型智能冷熱板測(cè)痛儀(天津諾雷信達(dá)科技有限公司);RM2235 石蠟切片機(jī)(德國(guó)徠卡公司);CO2培養(yǎng)箱(美國(guó)Thermal Fisher Scientific 公司)。

        2 實(shí)驗(yàn)方法

        2.1 無(wú)細(xì)胞水痘-帶狀皰疹病毒(VZV)懸液的制備

        當(dāng)鏡下觀察到Vero 細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)且形態(tài)正常,細(xì)胞密度達(dá)80% 時(shí),加入VZV 標(biāo)本液,吸附2 h 后,加入含有2% FBS 的MEM 完全培養(yǎng)基,每日觀察Vero 的形態(tài)變化。當(dāng)80% 細(xì)胞出現(xiàn)致細(xì)胞病變效應(yīng)(Cytopathic effect,CPE)時(shí),用細(xì)胞刮將細(xì)胞刮下,并用移液器進(jìn)行吹打,隨后分裝收集至凍存管中,置于-80 ℃冰箱中反復(fù)凍融3 次后收集培養(yǎng)液,在4 ℃下離心30 min(轉(zhuǎn)速3500 r/min),收集上清液即得無(wú)細(xì)胞病毒懸液。采用蝕斑法檢測(cè)VZV 滴度后,置于-80 ℃冰箱中貯藏、備用。

        2.2 腎陽(yáng)虛P(yáng)HN 大鼠模型的構(gòu)建

        首先參照文獻(xiàn)[1-2]中的方法,給予模型組大鼠甲巰咪唑混懸液10 mg/kg(溶液現(xiàn)用現(xiàn)配)灌胃,給藥體積為10 mL/kg;給予空白對(duì)照組大鼠同體積生理鹽水灌胃。連續(xù)灌胃15 d 后,評(píng)估并篩選出建立成功的腎陽(yáng)虛大鼠模型,同時(shí)參照文獻(xiàn)[3]中的方法構(gòu)建腎陽(yáng)虛P(yáng)HN 大鼠模型:運(yùn)用自制大鼠固定器固定好大鼠后,暴露大鼠右后足,用微量注射器于大鼠右足蹼底部皮下注射50 μL 病毒接種液,空白對(duì)照組大鼠右足蹼底部皮下注射50 μL 生理鹽水。

        2.3 腎陽(yáng)虛P(yáng)HN 大鼠模型的評(píng)估

        2.3.1 一般情況觀察及腎陽(yáng)虛動(dòng)物模型癥狀體征的評(píng)價(jià) 參照腎陽(yáng)虛動(dòng)物模型癥狀體征評(píng)估[4]標(biāo)準(zhǔn),密切觀察兩組大鼠的一般情況,包括精神狀態(tài)、活動(dòng)情況、皮毛狀態(tài)、飲食飲水、二便等情況,并記錄。

        2.3.2 大鼠體質(zhì)量及肛溫的測(cè)量 分別于腎陽(yáng)虛大鼠模型建立前及造模完成后,稱(chēng)量并記錄兩組大鼠的體質(zhì)量,并采用電子肛溫儀對(duì)其肛溫進(jìn)行測(cè)量。

        2.3.3 腎陽(yáng)虛動(dòng)物模型客觀指標(biāo)的檢測(cè) 末次灌胃結(jié)束且禁食12 h 后,經(jīng)腹腔注射10%水合氯醛(0.3 mL/100 g)麻醉,用一次性無(wú)菌采血針采集股靜脈血,靜置20 min 后于4 ℃下離心15 min(轉(zhuǎn)速3000 r/min),收集上清血漿,采用酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法及配套的試劑盒檢測(cè)血漿中的cAMP、cGMP 水平,并計(jì)算cAMP/cGMP。

        2.3.4 大鼠疼痛行為學(xué)檢測(cè) 分別于建模前及注射VZV 懸液后的第3、7、14、21、28 d,在觀察完各組大鼠的一般情況后,運(yùn)用Von Frey 電子測(cè)痛儀測(cè)量各組大鼠的機(jī)械縮爪閾值(PawWithdrawalThreshold,PWT)和熱撤回潛伏期(ThermalWithdrawalLatency,TWL;也叫熱痛縮足閾值)。

        2.3.4.1 PWT 檢測(cè)(Von Frey 試驗(yàn))參照Vivancos 等[5]的方法,將各組大鼠分批放入帶絲網(wǎng)層的塑料籠中,等待30 min 讓其安靜,然后使用Von Frey 電子測(cè)痛儀以“上、下”的方法,刺激大鼠的后爪內(nèi)側(cè)皮膚,力度為使大鼠腳爪輕度彎曲,持續(xù)1.5 s,當(dāng)大鼠出現(xiàn)嘶吼、舔足、甩尾及彈腿任一行為時(shí)即為陽(yáng)性疼痛反應(yīng),記錄此時(shí)電子Von Frey 測(cè)痛儀的數(shù)值,該數(shù)值即為PWT。每只大鼠均重復(fù)測(cè)量3 次,中間間隔5 min,將3 次測(cè)量的平均值作為PWT。

        2.3.4.2 TWL 檢測(cè)(熱痛敏試驗(yàn))參照Hargreaves 等[6]的方法,測(cè)量各組大鼠的TWL。每次PWT 測(cè)量結(jié)束30 min 后,將各組大鼠分批置于智能冷熱板測(cè)痛儀上,溫度保持為(50±2)℃。當(dāng)大鼠出現(xiàn)后爪抬起、舔足及甩尾任一行為時(shí),記錄此時(shí)大鼠在熱板上所用的時(shí)間,該時(shí)間即為T(mén)WL。每只大鼠均重復(fù)測(cè)試3 次,中間間隔10 min,取其平均值。

        2.3.5 大鼠脊髓組織病理形態(tài)的觀察 在注射VZV 懸液3 d 后,每組隨機(jī)抽取5 只大鼠進(jìn)行脊髓組織的采集,并進(jìn)行HE 染色。

        3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

        使用SPSS 26.0 軟件及GraphpadPrism9 程序進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,計(jì)量資料用均值± 標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,P<0.05 認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

        4 結(jié)果

        4.1 一般情況觀察

        4.1.1 腎陽(yáng)虛動(dòng)物模型癥狀體征的評(píng)價(jià)結(jié)果 在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中,空白對(duì)照組大鼠精神狀態(tài)良好,活動(dòng)機(jī)警靈敏,皮毛光亮柔順,飲食、飲水及二便均無(wú)異常表現(xiàn)。造模完成后,模型組大鼠與空白對(duì)照組大鼠比較,出現(xiàn)精神萎靡、毛色枯燥、喜扎堆蜷縮等表現(xiàn)。

        4.1.2 兩組大鼠造模前后體質(zhì)量的比較 空白對(duì)照組、模型組大鼠造模前的體質(zhì)量比較(P>0.05)。造模后,模型組大鼠的體質(zhì)量較空白對(duì)照組低,其體質(zhì)量總增長(zhǎng)量顯著小于空白對(duì)照組大鼠(P<0.05)。詳見(jiàn)表1。

        表1 兩組大鼠造模前后體質(zhì)量的比較(g,± s)

        表1 兩組大鼠造模前后體質(zhì)量的比較(g,± s)

        注:*與空白對(duì)照組比較,P <0.05。

        組別 造模前體質(zhì)量 造模15 d 后體質(zhì)量 體質(zhì)量總增長(zhǎng)量空白對(duì)照組(n=15)332.60±9.95 486.20±29.46 153.60±20.47模型組(n=15)335.30±8.45 422.70±30.28* 95.00±13.57*

        4.1.3 兩組大鼠造模前后肛溫的比較 造模前,兩組大鼠的肛溫比較(P>0.05)。造模后,與空白對(duì)照組大鼠比較,模型組大鼠的肛溫顯著降低(P<0.05)。詳見(jiàn)表2。

        表2 兩組大鼠造模前后肛溫的比較(℃,± s)

        表2 兩組大鼠造模前后肛溫的比較(℃,± s)

        注:*與空白對(duì)照組比較,P <0.05。

        組別 造模前肛溫 造模后肛溫空白對(duì)照組(n=15)37.40±0.10 37.41±0.11模型組(n=15)37.37±0.11 36.29±0.12*

        4.2 兩組大鼠血漿中cAMP、cGMP 含量的比較

        采用ELISA 法檢測(cè)兩組大鼠血漿中cAMP 和cGMP 的含量,結(jié)果顯示,與空白對(duì)照組大鼠比較,模型組大鼠的血漿cAMP 含量、cAMP/cGMP 顯著降低,血漿cGMP 含量顯著升高(P<0.05)。詳見(jiàn)表3。

        表3 兩組大鼠血漿中cAMP、cGMP 含量的比較(± s)

        表3 兩組大鼠血漿中cAMP、cGMP 含量的比較(± s)

        注:*與空白對(duì)照組比較,P <0.05。

        組別 cAMP(pmol/mL)cGMP(pmol/mL)cAMP/cGMP空白對(duì)照組(n=15)15.79±1.22 2.77±0.26 5.75±0.71模型組(n=15)9.48±2.42* 6.24±0.42* 1.52±0.36*

        4.3 兩組大鼠PWT 的比較

        注射VZV 之前(D0),兩組大鼠的PWT 比較(P>0.05)。VZV 注射3 d 后,與空白對(duì)照組大鼠相比,模型組大鼠的 PWT 明顯降低(P<0.05)。第7 ~14 d,模型組大鼠的PWT 下降最快(P<0.05),至第21 d 時(shí),模型組大鼠的PWT 降至最低(P<0.05)??瞻讓?duì)照組大鼠的PWT 在觀察期內(nèi)無(wú)明顯變化(P>0.05)。詳見(jiàn)圖1。

        圖1 兩組大鼠PWT 的比較

        4.4 兩組大鼠TWL 的比較

        注射VZV 之前(D0),兩組大鼠的TWL 比較(P>0.05)。VZV 注射3 d 后,與空白對(duì)照組大鼠相比,模型組大鼠的TWL 明顯降低(P<0.05)。第7 ~14 d,模型組大鼠的TWL 下降最快(P<0.05),至第21 d 時(shí),模型組大鼠的TWL 降至最低(P<0.05)??瞻讓?duì)照組大鼠的TWL 在觀察期內(nèi)無(wú)明顯變化(P>0.05)。詳見(jiàn)圖2。

        圖2 兩組大鼠TWL 的比較

        4.5 大鼠脊髓組織病理形態(tài)學(xué)的觀察

        模型組:可見(jiàn)髓鞘變性腫脹,脂質(zhì)空泡形成,并可觀察到病毒感染神經(jīng)元的包涵體,呈嗜酸性、散在的、局部的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn),小灶性出血;空白對(duì)照組:可見(jiàn)脊髓正常神經(jīng)細(xì)胞及膠質(zhì)細(xì)胞,血管出血并見(jiàn)少量散在的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。如圖3 所示。

        圖3 大鼠的脊髓組織病理切片

        5 討論

        目前,構(gòu)建腎陽(yáng)虛大鼠模型的方法主要有中醫(yī)傳統(tǒng)病因法、藥物造模法、手術(shù)造模法和多因素聯(lián)合造模法[7-8]。其中,藥物造模和手術(shù)造模主要是通過(guò)藥物或手術(shù)手段使大鼠對(duì)應(yīng)的靶腺體功能紊亂[9],從而達(dá)到造模的目的。與手術(shù)造模相比,藥物造模操作相對(duì)簡(jiǎn)單,且大鼠的傷亡率低,故應(yīng)用較為廣泛。在藥物造模方法中,常用的藥物包括糖皮質(zhì)激素、抗甲狀腺藥、性激素、羥基脲和腺嘌呤等[1]。本研究結(jié)合研究目的及藥物對(duì)PHN 的影響,選擇甲巰咪唑灌胃的方式建立腎陽(yáng)虛大鼠模型,并在此基礎(chǔ)上進(jìn)行PHN 大鼠模型的構(gòu)建。PHN 大鼠模型目前主要有VZV 模型、樹(shù)脂毒素(Reziniferatoxin,RTX)模型、Ⅰ型單純皰疹病毒(HSV-1)模型、氯仿皮膚痛敏模型及猴水痘病毒(Simian Varicella virus,SVV)模型,其中應(yīng)用較多的是VZV 模型、RTX 模型[10]。Fleetwood-Walker 等[11]在前人研究的基礎(chǔ)上,單次將高滴度VZV 接種到大鼠足墊中,發(fā)現(xiàn)大鼠出現(xiàn)了可測(cè)量和長(zhǎng)期存在的疼痛行為指標(biāo),其中大鼠出現(xiàn)的長(zhǎng)期行為變化模擬了PHN 發(fā)生后機(jī)械性異常疼痛及熱痛覺(jué)過(guò)敏的特征,而這種造模方式現(xiàn)已被許多的研究小組成功復(fù)制。另外,在大鼠的胡須墊中接種VZV 也會(huì)出現(xiàn)可測(cè)量的疼痛指標(biāo),但考慮到疼痛發(fā)生的部分及檢測(cè)方式受限,故本研究中不采用此種造模方式。將RTX 注入大鼠單側(cè)腹膜內(nèi)建立的神經(jīng)病理性疼痛動(dòng)物模型也可以緩慢形成機(jī)械痛覺(jué)過(guò)敏及異常疼痛,也具有熱痛覺(jué)閾值升高且不能用抗病毒藥物進(jìn)行拮抗的特點(diǎn)。似乎該模型更適合作為PHN 的理想動(dòng)物模型,但是其發(fā)病因素很難解釋PHN 的病因和誘發(fā)因素。因此,本實(shí)驗(yàn)選擇參照Dalziel 等[3]的方法,在腎陽(yáng)虛大鼠模型的基礎(chǔ)上,于大鼠足蹼部位接種VZV,并觀到類(lèi)似的結(jié)果,大鼠出現(xiàn)了持續(xù)性的痛覺(jué)過(guò)敏,且異常痛敏持續(xù)至第28 d 左右。

        綜上所述,通過(guò)甲巰咪唑灌胃15 d 聯(lián)合大鼠足蹼部注射VZV 構(gòu)建腎陽(yáng)虛P(yáng)HN 大鼠模型是可行的。

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