丘雅丹，謝 芳，黃佳敏，付夢(mèng)思，唐 挺,2★

（1.貴州中醫(yī)藥大學(xué)，貴州 貴陽(yáng) 550002；2.貴州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院皮膚科，貴州 貴陽(yáng) 550001）

帶狀皰疹后遺神經(jīng)痛（postherpetic neuralgia，PHN）是一種復(fù)雜且特殊的慢性神經(jīng)病理性疼痛，其發(fā)病機(jī)制非常復(fù)雜，目前仍未完全闡明。諸多研究表明，中醫(yī)藥單獨(dú)使用或與其他療法聯(lián)合使用，在臨床痛癥相關(guān)疾病的治療中發(fā)揮著重要作用。建立合理、科學(xué)、可行的中醫(yī)證候疾病模型，有助于基于中醫(yī)基礎(chǔ)理論深入探究疾病的發(fā)病機(jī)制。本研究為更好地模擬臨床患者體質(zhì)，擬構(gòu)建腎陽(yáng)虛P(yáng)HN 大鼠模型，并對(duì)其進(jìn)行評(píng)價(jià)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

SD 健康雄性大鼠30 只，SPF 級(jí)，體重300 ～350 g/只，購(gòu)自長(zhǎng)沙市天勤生物技術(shù)有限公司，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（湘）2019-0014。將大鼠分籠飼養(yǎng)，自由飲食，室內(nèi)濕度、溫度恒定，12 h/12 h 明暗周期。適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周后進(jìn)行耳釘標(biāo)記編號(hào)，稱取并記錄大鼠的體重。隨機(jī)將大鼠分為空白對(duì)照組和模型組，每組各15 只。

1.2 實(shí)驗(yàn)主要藥品及試劑

甲巰咪唑片〔默克制藥（江蘇）有限公司，進(jìn)口藥品注冊(cè)證號(hào)J20171078〕；Vero 細(xì)胞（非洲綠猴腎細(xì)胞）（武漢普諾賽生命科技有限公司，CL-0242）；蘇木素- 伊紅（HE）染液；cAMP ELISA Kit（武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司）；cGMP ELISA Kit（武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)主要儀器

10 μL 微量注射器（Hamilton）；Von Frey 電子測(cè)痛儀（上海玉研科學(xué)儀器有限公司）；YLS-21A 型智能冷熱板測(cè)痛儀（天津諾雷信達(dá)科技有限公司）；RM2235 石蠟切片機(jī)（德國(guó)徠卡公司）；CO2培養(yǎng)箱（美國(guó)Thermal Fisher Scientific 公司）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 無(wú)細(xì)胞水痘-帶狀皰疹病毒（VZV）懸液的制備

當(dāng)鏡下觀察到Vero 細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)且形態(tài)正常，細(xì)胞密度達(dá)80% 時(shí)，加入VZV 標(biāo)本液，吸附2 h 后，加入含有2% FBS 的MEM 完全培養(yǎng)基，每日觀察Vero 的形態(tài)變化。當(dāng)80% 細(xì)胞出現(xiàn)致細(xì)胞病變效應(yīng)（Cytopathic effect，CPE）時(shí)，用細(xì)胞刮將細(xì)胞刮下，并用移液器進(jìn)行吹打，隨后分裝收集至凍存管中，置于-80 ℃冰箱中反復(fù)凍融3 次后收集培養(yǎng)液，在4 ℃下離心30 min（轉(zhuǎn)速3500 r/min），收集上清液即得無(wú)細(xì)胞病毒懸液。采用蝕斑法檢測(cè)VZV 滴度后，置于-80 ℃冰箱中貯藏、備用。

2.2 腎陽(yáng)虛P(yáng)HN 大鼠模型的構(gòu)建

首先參照文獻(xiàn)[1-2]中的方法，給予模型組大鼠甲巰咪唑混懸液10 mg/kg（溶液現(xiàn)用現(xiàn)配）灌胃，給藥體積為10 mL/kg；給予空白對(duì)照組大鼠同體積生理鹽水灌胃。連續(xù)灌胃15 d 后，評(píng)估并篩選出建立成功的腎陽(yáng)虛大鼠模型，同時(shí)參照文獻(xiàn)[3]中的方法構(gòu)建腎陽(yáng)虛P(yáng)HN 大鼠模型：運(yùn)用自制大鼠固定器固定好大鼠后，暴露大鼠右后足，用微量注射器于大鼠右足蹼底部皮下注射50 μL 病毒接種液，空白對(duì)照組大鼠右足蹼底部皮下注射50 μL 生理鹽水。

2.3 腎陽(yáng)虛P(yáng)HN 大鼠模型的評(píng)估

2.3.1 一般情況觀察及腎陽(yáng)虛動(dòng)物模型癥狀體征的評(píng)價(jià) 參照腎陽(yáng)虛動(dòng)物模型癥狀體征評(píng)估[4]標(biāo)準(zhǔn)，密切觀察兩組大鼠的一般情況，包括精神狀態(tài)、活動(dòng)情況、皮毛狀態(tài)、飲食飲水、二便等情況，并記錄。

2.3.2 大鼠體質(zhì)量及肛溫的測(cè)量 分別于腎陽(yáng)虛大鼠模型建立前及造模完成后，稱量并記錄兩組大鼠的體質(zhì)量，并采用電子肛溫儀對(duì)其肛溫進(jìn)行測(cè)量。

2.3.3 腎陽(yáng)虛動(dòng)物模型客觀指標(biāo)的檢測(cè) 末次灌胃結(jié)束且禁食12 h 后，經(jīng)腹腔注射10%水合氯醛（0.3 mL/100 g）麻醉，用一次性無(wú)菌采血針采集股靜脈血，靜置20 min 后于4 ℃下離心15 min（轉(zhuǎn)速3000 r/min），收集上清血漿，采用酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）法及配套的試劑盒檢測(cè)血漿中的cAMP、cGMP 水平，并計(jì)算cAMP/cGMP。

2.3.4 大鼠疼痛行為學(xué)檢測(cè) 分別于建模前及注射VZV 懸液后的第3、7、14、21、28 d，在觀察完各組大鼠的一般情況后，運(yùn)用Von Frey 電子測(cè)痛儀測(cè)量各組大鼠的機(jī)械縮爪閾值（PawWithdrawalThreshold，PWT）和熱撤回潛伏期（ThermalWithdrawalLatency，TWL；也叫熱痛縮足閾值）。

2.3.4.1 PWT 檢測(cè)（Von Frey 試驗(yàn)）參照Vivancos 等[5]的方法，將各組大鼠分批放入帶絲網(wǎng)層的塑料籠中，等待30 min 讓其安靜，然后使用Von Frey 電子測(cè)痛儀以“上、下”的方法，刺激大鼠的后爪內(nèi)側(cè)皮膚，力度為使大鼠腳爪輕度彎曲，持續(xù)1.5 s，當(dāng)大鼠出現(xiàn)嘶吼、舔足、甩尾及彈腿任一行為時(shí)即為陽(yáng)性疼痛反應(yīng)，記錄此時(shí)電子Von Frey 測(cè)痛儀的數(shù)值，該數(shù)值即為PWT。每只大鼠均重復(fù)測(cè)量3 次，中間間隔5 min，將3 次測(cè)量的平均值作為PWT。

2.3.4.2 TWL 檢測(cè)（熱痛敏試驗(yàn)）參照Hargreaves 等[6]的方法，測(cè)量各組大鼠的TWL。每次PWT 測(cè)量結(jié)束30 min 后，將各組大鼠分批置于智能冷熱板測(cè)痛儀上，溫度保持為（50±2）℃。當(dāng)大鼠出現(xiàn)后爪抬起、舔足及甩尾任一行為時(shí)，記錄此時(shí)大鼠在熱板上所用的時(shí)間，該時(shí)間即為TWL。每只大鼠均重復(fù)測(cè)試3 次，中間間隔10 min，取其平均值。

2.3.5 大鼠脊髓組織病理形態(tài)的觀察 在注射VZV 懸液3 d 后，每組隨機(jī)抽取5 只大鼠進(jìn)行脊髓組織的采集，并進(jìn)行HE 染色。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用SPSS 26.0 軟件及GraphpadPrism9 程序進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料用均值± 標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，P＜0.05 認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

4 結(jié)果

4.1 一般情況觀察

4.1.1 腎陽(yáng)虛動(dòng)物模型癥狀體征的評(píng)價(jià)結(jié)果 在實(shí)驗(yàn)過程中，空白對(duì)照組大鼠精神狀態(tài)良好，活動(dòng)機(jī)警靈敏，皮毛光亮柔順，飲食、飲水及二便均無(wú)異常表現(xiàn)。造模完成后，模型組大鼠與空白對(duì)照組大鼠比較，出現(xiàn)精神萎靡、毛色枯燥、喜扎堆蜷縮等表現(xiàn)。

4.1.2 兩組大鼠造模前后體質(zhì)量的比較 空白對(duì)照組、模型組大鼠造模前的體質(zhì)量比較（P＞0.05）。造模后，模型組大鼠的體質(zhì)量較空白對(duì)照組低，其體質(zhì)量總增長(zhǎng)量顯著小于空白對(duì)照組大鼠（P＜0.05）。詳見表1。

表1 兩組大鼠造模前后體質(zhì)量的比較（g，± s）

表1 兩組大鼠造模前后體質(zhì)量的比較（g，± s）

注：*與空白對(duì)照組比較，P ＜0.05。

組別 造模前體質(zhì)量 造模15 d 后體質(zhì)量 體質(zhì)量總增長(zhǎng)量空白對(duì)照組（n=15）332.60±9.95 486.20±29.46 153.60±20.47模型組（n=15）335.30±8.45 422.70±30.28* 95.00±13.57*

4.1.3 兩組大鼠造模前后肛溫的比較 造模前，兩組大鼠的肛溫比較（P＞0.05）。造模后，與空白對(duì)照組大鼠比較，模型組大鼠的肛溫顯著降低（P＜0.05）。詳見表2。

表2 兩組大鼠造模前后肛溫的比較（℃，± s）

表2 兩組大鼠造模前后肛溫的比較（℃，± s）

注：*與空白對(duì)照組比較，P ＜0.05。

組別 造模前肛溫 造模后肛溫空白對(duì)照組（n=15）37.40±0.10 37.41±0.11模型組（n=15）37.37±0.11 36.29±0.12*

4.2 兩組大鼠血漿中cAMP、cGMP 含量的比較

采用ELISA 法檢測(cè)兩組大鼠血漿中cAMP 和cGMP 的含量，結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組大鼠比較，模型組大鼠的血漿cAMP 含量、cAMP/cGMP 顯著降低，血漿cGMP 含量顯著升高（P＜0.05）。詳見表3。

表3 兩組大鼠血漿中cAMP、cGMP 含量的比較（± s）

表3 兩組大鼠血漿中cAMP、cGMP 含量的比較（± s）

注：*與空白對(duì)照組比較，P ＜0.05。

組別 cAMP（pmol/mL）cGMP（pmol/mL）cAMP/cGMP空白對(duì)照組（n=15）15.79±1.22 2.77±0.26 5.75±0.71模型組（n=15）9.48±2.42* 6.24±0.42* 1.52±0.36*

4.3 兩組大鼠PWT 的比較

注射VZV 之前（D0），兩組大鼠的PWT 比較（P＞0.05）。VZV 注射3 d 后，與空白對(duì)照組大鼠相比，模型組大鼠的 PWT 明顯降低（P＜0.05）。第7 ～14 d，模型組大鼠的PWT 下降最快（P＜0.05），至第21 d 時(shí)，模型組大鼠的PWT 降至最低（P＜0.05）。空白對(duì)照組大鼠的PWT 在觀察期內(nèi)無(wú)明顯變化（P＞0.05）。詳見圖1。

圖1 兩組大鼠PWT 的比較

4.4 兩組大鼠TWL 的比較

注射VZV 之前（D0），兩組大鼠的TWL 比較（P＞0.05）。VZV 注射3 d 后，與空白對(duì)照組大鼠相比，模型組大鼠的TWL 明顯降低（P＜0.05）。第7 ～14 d，模型組大鼠的TWL 下降最快（P＜0.05），至第21 d 時(shí)，模型組大鼠的TWL 降至最低（P＜0.05）?？瞻讓?duì)照組大鼠的TWL 在觀察期內(nèi)無(wú)明顯變化（P＞0.05）。詳見圖2。

圖2 兩組大鼠TWL 的比較

4.5 大鼠脊髓組織病理形態(tài)學(xué)的觀察

模型組：可見髓鞘變性腫脹，脂質(zhì)空泡形成，并可觀察到病毒感染神經(jīng)元的包涵體，呈嗜酸性、散在的、局部的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，小灶性出血；空白對(duì)照組：可見脊髓正常神經(jīng)細(xì)胞及膠質(zhì)細(xì)胞，血管出血并見少量散在的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。如圖3 所示。

圖3 大鼠的脊髓組織病理切片

5 討論

目前，構(gòu)建腎陽(yáng)虛大鼠模型的方法主要有中醫(yī)傳統(tǒng)病因法、藥物造模法、手術(shù)造模法和多因素聯(lián)合造模法[7-8]。其中，藥物造模和手術(shù)造模主要是通過藥物或手術(shù)手段使大鼠對(duì)應(yīng)的靶腺體功能紊亂[9]，從而達(dá)到造模的目的。與手術(shù)造模相比，藥物造模操作相對(duì)簡(jiǎn)單，且大鼠的傷亡率低，故應(yīng)用較為廣泛。在藥物造模方法中，常用的藥物包括糖皮質(zhì)激素、抗甲狀腺藥、性激素、羥基脲和腺嘌呤等[1]。本研究結(jié)合研究目的及藥物對(duì)PHN 的影響，選擇甲巰咪唑灌胃的方式建立腎陽(yáng)虛大鼠模型，并在此基礎(chǔ)上進(jìn)行PHN 大鼠模型的構(gòu)建。PHN 大鼠模型目前主要有VZV 模型、樹脂毒素（Reziniferatoxin，RTX）模型、Ⅰ型單純皰疹病毒（HSV-1）模型、氯仿皮膚痛敏模型及猴水痘病毒（Simian Varicella virus，SVV）模型，其中應(yīng)用較多的是VZV 模型、RTX 模型[10]。Fleetwood-Walker 等[11]在前人研究的基礎(chǔ)上，單次將高滴度VZV 接種到大鼠足墊中，發(fā)現(xiàn)大鼠出現(xiàn)了可測(cè)量和長(zhǎng)期存在的疼痛行為指標(biāo)，其中大鼠出現(xiàn)的長(zhǎng)期行為變化模擬了PHN 發(fā)生后機(jī)械性異常疼痛及熱痛覺過敏的特征，而這種造模方式現(xiàn)已被許多的研究小組成功復(fù)制。另外，在大鼠的胡須墊中接種VZV 也會(huì)出現(xiàn)可測(cè)量的疼痛指標(biāo)，但考慮到疼痛發(fā)生的部分及檢測(cè)方式受限，故本研究中不采用此種造模方式。將RTX 注入大鼠單側(cè)腹膜內(nèi)建立的神經(jīng)病理性疼痛動(dòng)物模型也可以緩慢形成機(jī)械痛覺過敏及異常疼痛，也具有熱痛覺閾值升高且不能用抗病毒藥物進(jìn)行拮抗的特點(diǎn)。似乎該模型更適合作為PHN 的理想動(dòng)物模型，但是其發(fā)病因素很難解釋PHN 的病因和誘發(fā)因素。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇參照Dalziel 等[3]的方法，在腎陽(yáng)虛大鼠模型的基礎(chǔ)上，于大鼠足蹼部位接種VZV，并觀到類似的結(jié)果，大鼠出現(xiàn)了持續(xù)性的痛覺過敏，且異常痛敏持續(xù)至第28 d 左右。

綜上所述，通過甲巰咪唑灌胃15 d 聯(lián)合大鼠足蹼部注射VZV 構(gòu)建腎陽(yáng)虛P(yáng)HN 大鼠模型是可行的。