閆拯，夏雪宜，楊嫡，徐海泓，崔勝楠，耿珠峰，何清，劉學(xué)鋒，劉彥暉，楊伊，劉皓秋，張成林，劉定震

（1.北京師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，生物多樣性與生態(tài)工程教育部重點實驗室，北京，100875；2.圈養(yǎng)野生動物技術(shù)北京市重點實驗室，北京，100044；3.北京動物園管理處，北京，100044；4.北京師范大學(xué)分析測試中心，北京，100875；5.天津大學(xué)化工學(xué)院，天津，300072）

代謝組學(xué)技術(shù)被廣泛應(yīng)用于人類和動物的疾病與健康狀況評估［1?3］。尿液代謝物水平分析可用于監(jiān)測動物的健康狀況、妊娠診斷、發(fā)情狀態(tài)和應(yīng)激水平。動物的尿液相比于其他生物樣品，具有代謝物種類含量多、組成物質(zhì)相對簡單且蛋白含量低等優(yōu)勢，是監(jiān)測其生理、發(fā)情狀態(tài)和福利狀況優(yōu)劣的常用樣本［4?5］。然而，因安全考慮以及在動物排泄的同時采集尿液的困難，目前研究人員多選擇動物離開或被轉(zhuǎn)移后采集遺留在圈舍地面的樣品，或者通過在動物圈舍鋪墊塑料布的方式收集尿液樣品［6?7］。采用這些方式獲得的尿液樣品都會因為沾染了土壤和動物的糞便等污染源，導(dǎo)致樣品的污染從而影響代謝組學(xué)的檢測結(jié)果［8］。疊氮鈉（疊氮化鈉，NaN3）作為防腐劑能夠有效抑制細(xì)菌代謝繁殖，曾被作為代謝組學(xué)用尿液樣品預(yù)處理的首選化合物［9］，疊氮鈉處理后的尿液中代謝物更加穩(wěn)定［10?11］。但疊氮鈉屬爆炸性、劇毒性的化學(xué)物質(zhì)，不便攜帶和保存［12］，因此亟需找到一種替代方案收集并處理動物的尿液樣品用于代謝組學(xué)分析。

大熊貓（Ailuropoda melanoleuca）作為生物多樣性保育的一個旗艦物種兼明星物種，深受全世界人民的喜愛，有關(guān)其遷地保護狀況以及福利情況也備受矚目，因此是開展本研究工作的一個理想研究對象。大熊貓尿液樣本中含有睪酮、雌二醇、孕酮和皮質(zhì)醇等豐富的化學(xué)物質(zhì)和代謝物質(zhì)，已被廣泛應(yīng)用于大熊貓的各項生理研究［13?14］，Zhu等［2］通過核磁共振氫譜（1H NMR）技術(shù)對健康大熊貓的糞便、尿液、血清和唾液進行代謝組學(xué)分析，共鑒定出107種代謝物。此外，大熊貓血清和尿液代謝物成分及其相對含量還受年齡和性別的影響［15?16］。然而，通過對尿液樣品的不同處理并借助微生物培養(yǎng)法和代謝組學(xué)分析比較法探討代謝組學(xué)用尿液樣品預(yù)處理方法研究，迄今尚未見報道。

為彌補該缺陷，本研究在北京動物園使用一次性過濾器預(yù)處理收集的大熊貓尿液樣品，并進行細(xì)菌培養(yǎng)和代謝組學(xué)檢測，以驗證一次性過濾器在大熊貓尿液預(yù)處理上應(yīng)用的可能性，為此后的尿液代謝組學(xué)分析研究提供高效除菌的尿液樣品。通過檢測健康大熊貓尿液中的代謝物種類和含量，完善圈養(yǎng)大熊貓代謝信息庫，為疾病診斷、健康狀況和發(fā)情監(jiān)測等研究提供參考數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集與處理

2021 年11 月16 日—12 月8 日在北京動物園采集8 只大熊貓（3♀，5）的27 份尿液樣，分為亞成年（1.5～5.5 歲）、成年（5.5～20.0 歲）和老年（20.0～27.0歲）組［17］（表1）。

表1 大熊貓基本信息Tab.1 Basic information of giant pandas

在大熊貓排尿30 min內(nèi)使用一次性注射器從地面抽取6～15 mL尿液于無菌離心管中，然后分為3份分別裝于離心管中，進行以下處理：第1 份不做任何處理（對照組）；第2 份使用0.22 μm Millex 過濾器（Merck KGaA，Darmstadt，Germany）過濾尿液（濾膜組）；第3份加入100 μL 0.5%疊氮鈉溶液混勻（疊氮鈉組）。將上述3種處理的樣品放入冰盒冷藏，2 h內(nèi)運回北京師范大學(xué)實驗室。將上述處理過的尿液樣品進行離心處理（4 ℃，15 000 r/min，10 min）除去樣本中的固體雜質(zhì)、顆粒懸浮物以及細(xì)胞碎片等物質(zhì)［9］。對照組和疊氮鈉處理組均有沉淀物產(chǎn)生，濾膜組離心后無沉淀物。分別取上清后在冰箱中?80 ℃保存待分析。

1.2 尿液微生物培養(yǎng)

為保證用于后續(xù)代謝組學(xué)檢測有足夠的樣本量，從3種處理的尿液樣品中，選擇容積大于6 mL 的9 組尿液樣品進行微生物培養(yǎng)。每組3 份共27 個尿液樣品分別抽取100 μL至胰酪大豆胨瓊脂（TSA）平板培養(yǎng)基，使用涂布器均勻涂至培養(yǎng)基表面，干燥，然后用封口膜密封，倒置于培養(yǎng)箱，37 ℃培養(yǎng) 24 h后取出，統(tǒng)計菌落個數(shù)。

1.3 核磁共振（NMR）檢測與分析

針對3種方法處理的27 組共81 個尿液樣本，首先進行NMR 檢測前的樣品制備，然后使用核磁共振波譜儀（型號AVANCE Ⅲ HD，布魯克公司，德國）進行NMR 分析，波譜儀配備5 mm 雙核z-梯度探頭（BBFO 探頭），設(shè)置實驗溫度為298.0 K。NMR 分析用尿液樣品制備以及檢測方法參考何清［18］。將大熊貓的尿液樣本解凍后低溫離心處理（4 ℃，8 000 r/min，5 min），取上清液450 μL 加入磷酸鹽緩沖液（PBS）250 μL、含3-三甲基硅-2，2，3，3-D4-1-丙酸鈉（TSP）的重水（D2O，氘代率99.9%）50 μL，混勻后轉(zhuǎn)移到核磁管內(nèi)，靜置10 min 后進樣分析。采用1D NOESY預(yù)飽和實驗測定氫譜，譜寬SW 設(shè)置為7 000 Hz，采樣點數(shù)32 k，弛豫延遲時間2 s，掃描次數(shù)128 次，在傅里葉變換之前設(shè)定FID的窗函數(shù)線寬因子為0.3 Hz，并充零到64 k。使用預(yù)飽和水峰壓制技術(shù)減少水峰對其他有效溶質(zhì)信號產(chǎn)生的影響。

利用MestReNova v12.0 軟件校正對譜圖相位和基線，將3-三甲基硅-2，2，3，3-D4-1-丙酸鈉（TSP）峰值處定為δH特征信號化學(xué)位移的零參考值。除去δH4.3～6.2 區(qū)域以避免殘存的水峰（δH4.8）以及尿素質(zhì)子信號（δH5.8）的影響，選擇δH0.5～10.0 區(qū)域的數(shù)據(jù)，按照每個積分間隔δH0.005 分段積分，得到123 201 個變量。將指紋譜分為3 段：A 段（δH0.5～2.8）、B 段（δH2.8～ 4.2）和C 段（δH5.3～9.5），對質(zhì)譜圖進行更加精確清晰的信號辨認(rèn)。在多變量統(tǒng)計分析之前，對樣本數(shù)據(jù)進行歸一化處理，消除尿液總體積帶來的差異［19?20］。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

使用SIMCA-P v14.1（Umetrics AB，Umea，Swe?den）對歸一化后的數(shù)據(jù)進行正交偏最小二乘判別分析（orthogonal partial least squares-discriminant analy?sis，OPLS-DA），采用自適換算（unit variance scaling）的數(shù)據(jù)標(biāo)度換算方式。隨機多次（n=100）改變分類變量Y的排列順序得到相應(yīng)不同的隨機Q2值，進行置換檢驗，對OPLS-DA 模型有效性做進一步的驗證。根據(jù)本課題組指紋譜δH特征信號的化學(xué)位移值分析結(jié)果［18］對代謝物進行推定。

根據(jù)質(zhì)譜圖推定出的代謝物成分及相對含量，使用R v4.1.2 軟件對不同處理方法、不同性別以及不同年齡組間大熊貓尿液中代謝物含量歸一化后的數(shù)據(jù)進行t檢驗分析。數(shù)據(jù)以箱形圖表示，統(tǒng)計分析皆為雙尾檢驗，檢驗水平α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌生長情況

在培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)24 h 后，濾膜過濾器處理過的尿液均未生長出可培養(yǎng)菌落；對照組有5 個樣品長出菌落，占55.6%；疊氮鈉處理組有4 個樣品長出菌落，占44.4%，每份尿液樣本在使用疊氮鈉處理后的菌落數(shù)均少于或等于對照處理（圖1）。

圖1 大熊貓尿液樣品微生物培養(yǎng)菌落生長情況（37 ℃，24 h）Fig.1 Growth of microbial colonies in urine samples of giant pandas（37 ℃，24 h）

2.2 代謝物檢測結(jié)果

2.2.1 大熊貓尿液1H NMR譜圖分析

根據(jù)大熊貓尿液1H NMR譜圖化學(xué)位移分析，共推定21種代謝物，其中肌酐、丙氨酸、乳酸、甜菜堿和肌酸在整體樣品中相對峰面積較大（表2）。

表2 大熊貓尿液樣本代謝物核磁數(shù)據(jù)Tab.2 NMR data of metabolites from urine samples of giant pandas

2.2.2 3種預(yù)處理方法差異分析

通過監(jiān)督性多維統(tǒng)計OPLS-DA 進行模型分析，濾膜處理、疊氮鈉處理和對照處理間均未明顯區(qū)分（圖2A-C）。對照組和疊氮鈉組累計解析率R2X=0.248，R2Y=0.413，Q2=?0.295；過濾組和疊氮鈉組R2X=0.248，R2Y=0.34，Q2=?0.547；對照組和過濾組R2X=0.247，R2Y=0.434，Q2=?0.61。推定的21種代謝物組間均未出現(xiàn)顯著性差異（t-test：p>0.05，圖3）。這表明，采用濾膜處理和添加疊氮鈉處理的大熊貓尿液樣品，未對其中代謝物的組分產(chǎn)生影響。

圖2 不同處理、不同性別間大熊貓尿液樣本NMR的OPLS-DA得分Fig.2 OPLS-DA score plots based on NMR spectra of urine metabolites among three treatments and between the different sexes

圖3 21種代謝物相對含量在對照組、過濾組和疊氮鈉組間的差異（組間數(shù)值表示顯著性，t-test）Fig.3 Comparison of 21 metabolites in three urine treatment groups（values between groups indicate significance，t-test）

2.2.3 不同性別的大熊貓尿液代謝組學(xué)的判別分析

對代謝物數(shù)據(jù)進一步分析的OPLS-DA 結(jié)果顯示，雌雄組間分離不明顯（圖2D），累計解析率R2X=0.258，R2Y=0.348，Q2=?0.144。

1H NMR 譜鑒定結(jié)合t檢驗結(jié)果顯示，在不同性別的大熊貓間共發(fā)現(xiàn)7種顯著性差異代謝物（圖4），其中肌酸、乳酸、α-酮戊二酸和乙酸含量在雌雄組間差異顯著（p<0.05），二甲基甘氨酸、琥珀酸和反式烏頭酸差異極顯著（p<0.01）。

圖4 7種代謝物相對含量在雌雄大熊貓間的差異（*p<0.05；**p<0.01；****p<0.000 1，t-test）Fig.4 Comparison of seven metabolites in relative content by peak area between two sexes（*p<0.05；**p<0.01；****p<0.000 1，t-test）

2.2.4 不同年齡的大熊貓尿液代謝組學(xué)判別分析

通過亞成年、成年和老年組數(shù)據(jù)構(gòu)建的OPLSDA（圖5）顯示，成年和老年組區(qū)分較明顯，累計解析率R2X=0.349，R2Y=0.817，Q2=0.387；亞成年和成年組間區(qū)分不明顯，累計解析率R2X=0.279，R2Y=0.495，Q2=0.294；亞成年和老年組區(qū)分較明顯，累計解析率R2X=0.358，R2Y=0.83，Q2=0.295。

圖5 不同年齡間大熊貓尿液樣本NMR的OPLS-DA得分Fig.5 OPLS-DA score plots based on the NMR spectra of urine metabolites among age groups

在亞成年和成年組間，二甲基甘氨酸、酪氨酸、檸檬酸和甜菜堿含量有顯著差異（p<0.05），琥珀酸和反式烏頭酸含量差異極顯著（p<0.01）；成年和老年組間，N-乙?；堑鞍住⒈彼岷吞鸩藟A含量有顯著差異（p<0.05）；亞成年和老年組間，N-乙?；堑鞍?、二甲基甘氨酸和琥珀酸含量有顯著差異（p<0.05），丙氨酸含量差異極其顯著（p<0.01）（圖6）。

圖6 8種代謝物相對含量在亞成年、成年和老年大熊貓間的差異（*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001，t-test）Fig.6 Comparison of eight metabolites among three age groups（*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001，t-test）

3 討論

通過濾膜過濾后尿液樣本在離心后無沉淀產(chǎn)生，說明過濾膜能夠阻隔雜質(zhì)顆粒和細(xì)胞，并且濾膜過濾后的大熊貓尿液經(jīng)細(xì)菌培養(yǎng)未發(fā)現(xiàn)菌群產(chǎn)生（圖1）。因此，濾膜過濾處理具有除菌、除雜質(zhì)的功能，操作簡便快捷，可減少樣品在常溫中暴露的時間，利于尿液樣品收集和保存。

采樣污染對代謝組學(xué)結(jié)果的影響主要來源于細(xì)菌的增值和代謝［21］，濾膜可以有效降低采樣過程中細(xì)菌的污染，而多變量分析OPLS-DA 結(jié)果以及代謝物組間比較結(jié)果顯示濾膜處理、疊氮鈉處理和對照處理組之間代謝物組成無明顯區(qū)別（圖2，圖3）。Eisinger等［8］研究表明，尿液樣本暴露于15 ℃以上 2 h 后污染性微生物大量繁殖，對代謝物產(chǎn)生較大影響。本次大熊貓尿液樣本采集于北京11—12 月的清晨，記錄的平均采樣環(huán)境溫度為（8.4±3.6）℃，最高環(huán)境溫度為15.0 ℃。組間未產(chǎn)生差異的因素可能是環(huán)境溫度低，微生物代謝物速率減慢［10］，并在采樣后2 h 內(nèi)置入?80 ℃冷藏。但微生物對尿液樣品的影響仍不容小覷，細(xì)菌的繁殖會消耗檸檬酸鹽、肌酐等物質(zhì)，產(chǎn)生三甲胺、甲酸、乳酸和肌酸等，使尿素分解，造成尿液pH 升高，尿液成分改變，影響代謝組學(xué)的檢測結(jié)果［10，21］。在適宜微生物生長代謝的環(huán)境

收集尿樣時，對尿液的處理很有必要，尤其是在溫度更高的夏天。此外，在低溫條件下采樣，3種方法處理后的代謝物分析結(jié)果也表明，濾膜處理、疊氮鈉處理沒有影響代謝物組成及豐度（圖2，圖3）。因此，濾膜過濾可以應(yīng)用于大熊貓尿液代謝組學(xué)檢測的尿液預(yù)處理工作。

不同性別間，大熊貓尿液代謝物在總體上沒有明顯的區(qū)分（圖2D）。在采集尿液樣品時，8 只大熊貓均處于非發(fā)情期，食譜相似，圈養(yǎng)條件一致，受到游客噪聲等環(huán)境因子的影響也相似，雌性和雄性大熊貓都處于健康和正常的狀態(tài)。不過，根據(jù)代謝物的相對含量，發(fā)現(xiàn)7種代謝物存在顯著差異（圖4），可能與竹子各部位膽堿的含量不同，二甲基甘氨酸含量的差異可能與雌雄喜食的竹子部位不同有關(guān)［2］。雄性大熊貓肌肉質(zhì)量大，肌酸含量多［20］。生物體的性別會極大地影響雌性和雄性的激素水平，而激素水平會引起生物體內(nèi)代謝通路的變化［3］。雌激素可以增加脂肪酸的利用率，同時降低糖異生作用［22］。

不同年齡間大熊貓代謝物組成存在差異（圖5，圖6），從亞成年發(fā)育到成年階段，食量增加引起代謝變化，因此與三羧酸循環(huán)（tricarboxylic acid cycle，TCA cycle）等生理代謝途徑相關(guān)的檸檬酸、琥珀酸等含量都有增加。酪氨酸由苯基丙氨酸合成，在酪氨酸酶催化和一系列氧化反應(yīng)下生成黑色素［23］，而檸檬酸、酪氨酸也被證明是雄性大熊貓自然交配成功與否的差異代謝物［24］。

本研究通過微生物培養(yǎng)和代謝組學(xué)手段相結(jié)合，檢驗了一次性過濾器在代謝組學(xué)尿液處理中的可行性，為大熊貓和其他動物尿液代謝組學(xué)預(yù)處理提供了簡便快捷的處理方法。通過指紋圖譜的指認(rèn)分析，共得到21種代謝物，多變量分析結(jié)果顯示，雌雄大熊貓在非繁殖期代謝物組成類似，無明顯區(qū)別；亞成年-成年組間代謝物組成沒有明顯的區(qū)別，亞成年-老年組間有一定的區(qū)別，成年-老年組間有明顯區(qū)別。本研究豐富了大熊貓的基本代謝組學(xué)庫，為大熊貓疾病監(jiān)測、繁殖期的判斷和應(yīng)激狀態(tài)內(nèi)在機制的研究提供了數(shù)據(jù)基礎(chǔ)，同時也為其他圈養(yǎng)哺乳動物應(yīng)用該技術(shù)開展尿液代謝組學(xué)及相關(guān)研究工作創(chuàng)造了條件。