李菲,段贊,王濤,卓靜,杜麗,詹世寧（江蘇省徐州市腫瘤醫(yī)院,江蘇 徐州 221000）

目前，在全球女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤中宮頸癌的發(fā)病率仍高居榜首，在我國(guó)，宮頸癌發(fā)病率依然呈上升趨勢(shì)。隨著人乳頭狀瘤病毒（HPV）疫苗的接種、宮頸癌篩查的普及以及醫(yī)療水平的發(fā)展，我國(guó)宮頸癌患者的5年生存率較之前有明顯的提升，但是不同地區(qū)之間依然存在較大的差異[1]。HPV檢測(cè)及子宮頸細(xì)胞學(xué)檢查是目前宮頸癌篩查的主要方法，然而這兩種方法聯(lián)合起來(lái)對(duì)患者進(jìn)行分流依然存在漏診，尤其是子宮頸高級(jí)別病變[2-3]。免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)（immunocytochemistry，ICC）在日常工作中已經(jīng)成為形態(tài)學(xué)診斷中一種重要的輔助方法[4]。p16基因又稱(chēng)MTS（multiple tumor suppressor 1）基因，屬于抑癌基因，在調(diào)節(jié)細(xì)胞周期G1-S期中起著關(guān)鍵作用，在HPV相關(guān)的宮頸上皮內(nèi)病變（cervical intraepithelial neoplasia，CIN）中，HPV的E7蛋白抑制Rb基因的活性，導(dǎo)致p16合成異常增加，高表達(dá)于細(xì)胞核及細(xì)胞漿中[5-6]。微小染色體維持蛋白2（Minichromosome maintenance protein 2，MCM2）是DNA復(fù)制中的啟動(dòng)子，參與細(xì)胞周期的調(diào)控，表達(dá)于高增殖活性的細(xì)胞核內(nèi)，表達(dá)過(guò)度被認(rèn)為是細(xì)胞周期失調(diào)的標(biāo)志[7-8]。有研究顯示，p16和MCM2高表達(dá)于宮頸上皮內(nèi)病變中，且病變程度越高其陽(yáng)性率越高，故此，p16和MCM2在宮頸上皮內(nèi)病變的篩查及鑒別診斷中具有較高的應(yīng)用價(jià)值[9]。筆者采用免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)對(duì)宮頸細(xì)胞學(xué)標(biāo)本進(jìn)行p16/MCM2雙項(xiàng)聯(lián)檢染色，經(jīng)過(guò)反復(fù)的探索與實(shí)踐，優(yōu)化了相關(guān)染色流程，取得了較好的效果，現(xiàn)就染色流程、染色結(jié)果判讀及相關(guān)經(jīng)驗(yàn)體會(huì)總結(jié)如下。

1 材料與方法

1.1材料 收集徐州市腫瘤醫(yī)院2022年7月-2022年11月宮頸液基細(xì)胞學(xué)標(biāo)本150例，年齡20-68歲，平均年齡44.5歲。

1.2方法

1.2.1主要試劑與儀器 宮頸脫落細(xì)胞保存液及p16/MCM2雙項(xiàng)聯(lián)檢ICC試劑盒均購(gòu)置于重慶沃康科技有限公司，全自動(dòng)免疫組化染色機(jī)（CWC-30）購(gòu)置于寧波察微生物科技有限公司，所采用的試劑與儀器均通過(guò)重慶沃康科技有限公司的驗(yàn)證。

1.2.2制片及染色主要流程 ①純化：于10ml離心管中加入4ml液基細(xì)胞分層液，套上過(guò)濾筒，再加入6ml細(xì)胞離散靜置后的中下層細(xì)胞懸液標(biāo)本，2000r/min，水平轉(zhuǎn)離心10min，去上清液，加細(xì)胞緩沖液至1-3ml，在漩渦振蕩器上震蕩1min，使細(xì)胞混勻打散，制成細(xì)胞懸液。②制片：在制片單元中加入細(xì)胞預(yù)處理后的細(xì)胞懸液1ml，室溫靜置10min，倒去殘液，取出玻片室溫晾干。③固定：將細(xì)胞制片放入無(wú)水乙醇中，室溫孵育30min，室溫充分晾干。④修復(fù)：使用高壓修復(fù)方法，將細(xì)胞制片放入裝有檸檬酸鈉抗原修復(fù)液（pH6.0）的染色缸中，將染色缸放置于加有1/3水位的高壓鍋中，待加壓閥放氣時(shí)開(kāi)始計(jì)時(shí)，修復(fù)時(shí)間15min，然后自然冷卻至室溫。⑤滅活和封閉：滴加內(nèi)源性過(guò)氧化物酶阻斷劑100ul/片，室溫濕盒孵育10min，PBST清洗3次，每次1min，適度甩干（不可干片），滴加封閉劑，室溫下濕盒孵育10min。⑥一抗孵育：將試劑盒中的抗體稀釋液和p16一抗?jié)饪s液混合后，加入到MCM2一抗?jié)饪s液中，配置成p16/MCM2一抗工作混合液，滴加于細(xì)胞制片上，室溫濕盒孵育60min，PBST清洗3次（每次3min）。⑦二抗孵育：將試劑盒中的羊抗鼠二抗工作液加入到羊抗兔二抗工作液中，配置成羊抗鼠/兔二抗工作混合液，滴加于細(xì)胞制片上，室溫濕盒孵育30min，PBST清洗3次（每次3min）。⑧DAB染色：根據(jù)標(biāo)本量，取適量的DAB染色底物和DAB染色劑緩沖液混勻制備成DAB工作液，滴加DAB工作液45-50ul/片，室溫濕盒孵育5-10min，蒸餾水沖洗3min。⑨red染色：根據(jù)標(biāo)本量，按AP-red色原液：AP-red顯色緩沖液=1∶75進(jìn)行AP-red工作混合液的配制。一抗和二抗孵育之后，細(xì)胞制片滴加AP-red工作混合液47ul/片，室溫濕盒孵育20min，蒸餾水沖洗3min。⑩復(fù)染：將細(xì)胞制片放入蘇木素染料中進(jìn)行復(fù)染，流水沖洗3min，吹干。

封片：滴加中性樹(shù)膠、加蓋玻片，干片后，光學(xué)顯微鏡下觀察。

2 結(jié)果

在高級(jí)別鱗狀上皮內(nèi)病變（high-grades quamous intraepithelial lesion，HSIL）（見(jiàn)圖1A）及非典型鱗狀細(xì)胞，不除外高級(jí)別鱗狀上皮內(nèi)病變（atypical squamous cells，cannot exclude HSIL，ACS-H）（見(jiàn)圖1B）中異常細(xì)胞的細(xì)胞核顯紅色或者紅棕色，細(xì)胞漿顯棕色。在低級(jí)別鱗狀上皮內(nèi)病變（low-grade squamous intraepithelial lesion，LSIL）（見(jiàn)圖1C）及非典型鱗狀上皮細(xì)胞中意義不明確（atypical squamous cells of undetermined significance，ASC-US）（見(jiàn)圖1D）中，單個(gè)異常細(xì)胞核呈紅色且細(xì)胞核形態(tài)、大小異常。無(wú)上皮內(nèi)病變或惡性病變（negative for intraepithelial lesion or malignancy，NILM）（見(jiàn)圖1E-F）的細(xì)胞核顯藍(lán)色/紅色（但細(xì)胞核形態(tài)正常）、細(xì)胞漿只有蘇木素襯染的淡藍(lán)色或者細(xì)胞核藍(lán)色/棕色、細(xì)胞漿棕色。

圖1 A：在HSIL中p16（+）/MCM2（+），異常細(xì)胞（細(xì)胞核顯紅色或者紅棕色，細(xì)胞漿顯棕色）≤5個(gè)。B：在ASC-H中p16（+）/MCM2（+），異常細(xì)胞（細(xì)胞核顯紅色或者紅棕色，細(xì)胞漿顯棕色）≥5個(gè)。C：在LSIL中p16（-）/MCM2（+），異常細(xì)胞（核呈紅色且細(xì)胞核形態(tài)、大小異常）≥3個(gè)。D：在ASC-US中p16（-）/MCM2（+），異常細(xì)胞（核呈紅色且細(xì)胞核形態(tài)、大小異常）≤3個(gè)。E-F：在NILM中p16（-）/MCM2（+），或p16（+）/MCM2（-），正常細(xì)胞（細(xì)胞核顯藍(lán)色/紅色，細(xì)胞核形態(tài)正常，細(xì)胞漿只有蘇木素襯染的淡藍(lán)色或者細(xì)胞核藍(lán)色/棕色、細(xì)胞漿棕色）

3 經(jīng)驗(yàn)體會(huì)

①不是所有的宮頸細(xì)胞保存液都適用免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)，曾嘗試使用多家公司生產(chǎn)的細(xì)胞保存液，有些保存液制作出的片子效果欠佳，尤其是細(xì)胞量及染色效果方面并不理想。推薦沃康、HOLOGIC和泰普等細(xì)胞保存液。使用非推薦品牌的宮頸細(xì)胞保存液進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，存在非特異結(jié)合較強(qiáng)、特異性染色較弱的問(wèn)題。②本科室曾將放置超過(guò)一周的陽(yáng)性對(duì)照片玻片進(jìn)行p16/MCM2雙項(xiàng)聯(lián)檢ICC染色，結(jié)果顯示陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于在2℃-8℃冰箱保存且不超過(guò)一周的標(biāo)本制作的陽(yáng)性對(duì)照玻片。所以制作好的玻片標(biāo)本不可長(zhǎng)時(shí)間在空氣中保存，應(yīng)存放于2℃-8℃冰箱中不超過(guò)一周時(shí)間，放置時(shí)間過(guò)久，細(xì)胞內(nèi)的抗原成分會(huì)丟失。③黏液過(guò)多的標(biāo)本易引起非特異性染色，故需在標(biāo)本中添加適量的黏液液化劑。④推薦采用間接高溫高壓抗原修復(fù)法，此種方法抗原修復(fù)液消耗量較少，抗原修復(fù)效果較好，尤其是細(xì)胞核抗原。⑤建議采用專(zhuān)用的檸檬酸鈉抗原修復(fù)液（pH6.0）。⑥蘇木素復(fù)染后，由于red染料原因，不可進(jìn)行分化、通透和脫水。⑦不同季節(jié)如果室溫不同，要適當(dāng)調(diào)整red染色時(shí)間。⑧由于標(biāo)本中含有黏液等成分，為避免標(biāo)本溢出，往離心管中加入標(biāo)本液時(shí)要傾斜離心管，沿管壁緩慢加入。⑨抗體濃度過(guò)高或者過(guò)低會(huì)引起非特異性染色或者定位不準(zhǔn)確，從而影響染色結(jié)果。⑩滴加試劑要均勻且足夠，以免邊緣細(xì)胞不著色。11PBS沖洗要徹底，染色全程不可出現(xiàn)干片現(xiàn)象，以防止背景著色。12血性標(biāo)本會(huì)引起非特異性染色及覆蓋鱗狀上皮細(xì)胞，對(duì)于血性標(biāo)本可以離心處理吸取中間層細(xì)胞制片。

4 討論

根據(jù)2022年2月國(guó)家癌癥中心發(fā)布的最新的全國(guó)癌癥統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，在我國(guó)，宮頸癌發(fā)病率和死亡率仍呈上升的趨勢(shì)。人乳頭狀瘤病毒（HPV）感染是引起宮頸癌的主要病因，高危型HPV持續(xù)性感染可引起宮頸上皮內(nèi)病變和宮頸癌，一些外陰及陰道上皮內(nèi)病變亦和HPV感染有關(guān)[10]。HPV檢測(cè)在臨床工作中現(xiàn)已被廣泛應(yīng)用，但一些被感染的患者在自身免疫系統(tǒng)作用下會(huì)自行消除病毒，僅少部分高危型HPV持續(xù)感染會(huì)進(jìn)展為宮頸癌，與病理組織學(xué)檢查結(jié)果存在一定的差異[11-12]。宮頸細(xì)胞學(xué)檢查是宮頸上皮內(nèi)病變篩查的主要方法之一，但由于操作流程的差異，染色結(jié)果也不盡相同，致使宮頸細(xì)胞病理學(xué)診斷的一致性較差，存在漏診和誤診，尤其對(duì)于高級(jí)別鱗狀上皮內(nèi)病變的漏診率較高，利用p16蛋白的檢測(cè)在一定程度上可以彌補(bǔ)TCT只觀察細(xì)胞形態(tài)的不足之處[13]。HPV的E7蛋白通過(guò)取代E2F轉(zhuǎn)錄因子而與Rb結(jié)合導(dǎo)致MCM2異常轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)和S期誘導(dǎo)異常，使得MCM2在宮頸癌和宮頸上皮內(nèi)病變中高表達(dá)。有研究顯示，HPV靈敏度高但特異度低，TCT特異度高但是靈敏度低[14]。鄭健[15]等人研究顯示MCM2免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)結(jié)果的靈感度和特異度均比HPV檢測(cè)結(jié)果高，普遍表達(dá)于宮頸上皮內(nèi)病變中，且宮頸上皮內(nèi)病變?cè)街仄潢?yáng)性表達(dá)率越高，在宮頸癌及宮頸癌前病變中有較好的篩查作用。免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)應(yīng)用于宮頸細(xì)胞學(xué)雙染中具有簡(jiǎn)單高效、結(jié)果準(zhǔn)確、可重復(fù)等優(yōu)點(diǎn)，能夠提高診斷率、減少漏診率，在一定程度上降低或避免了過(guò)度的陰道鏡檢查，可作為臨床宮頸癌篩查的一種方法[16-17]。研究顯示p16、MCM2在宮頸上皮內(nèi)病變中同時(shí)存在異常表達(dá)[18]，另有研究顯示p16、MCM2同時(shí)高表達(dá)與高危型HPV的致癌活性直接相關(guān)，且聯(lián)合檢測(cè)p16、MCM2在宮頸上皮內(nèi)病變的診斷中靈敏度高于宮頸細(xì)胞學(xué)的檢查，特異度高于HPV檢測(cè)[19]。

綜上所述，p16/MCM2雙項(xiàng)聯(lián)檢免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)從蛋白水平來(lái)標(biāo)記異常宮頸鱗狀上皮細(xì)胞，如果標(biāo)本中僅有幾個(gè)異常的鱗狀上皮也能被標(biāo)記出來(lái)，從而有效避免了漏診，并且對(duì)宮頸癌及癌前病變進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估、對(duì)癌篩人群的分流提供了有效的幫助。良好的染色流程與方法對(duì)于結(jié)果的準(zhǔn)確性至關(guān)重要。通過(guò)近期對(duì)染色流程的反復(fù)摸索與實(shí)踐，大大提高了p16/MCM2雙項(xiàng)聯(lián)檢免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)的穩(wěn)定性，為臨床醫(yī)師對(duì)患者病情的分析提供了極大的指導(dǎo)作用。