張洪杰

（中國科學(xué)院生物物理研究所，蛋白質(zhì)科學(xué)技術(shù)平臺，北京 100101）

自20 世紀(jì)初被發(fā)現(xiàn)后，放射性現(xiàn)象在生物學(xué)和醫(yī)學(xué)研究中很快就得到了廣泛的應(yīng)用，并為學(xué)科的發(fā)展提供了重要的實驗方法。由于人們對放射性引起的環(huán)境污染和操作人員對（潛在）損傷的擔(dān)憂，目前除核醫(yī)學(xué)領(lǐng)域外，使用非放射性的替代方法已經(jīng)成為一種趨勢。面對新技術(shù)對放射性示蹤技術(shù)服務(wù)帶來的挑戰(zhàn)，加強示蹤技術(shù)共用平臺的建設(shè)就必須明確當(dāng)前放射示蹤技術(shù)的活躍應(yīng)用領(lǐng)域。放射自顯影技術(shù)是生物學(xué)中廣泛使用的放射示蹤技術(shù)之一，在放射標(biāo)記探針的定量以及與細(xì)胞、組織、生物體中探針作用靶點的分布等方面，已經(jīng)積累了豐富的研究資料。熒光或化學(xué)發(fā)光標(biāo)記探針［1-4］已經(jīng)廣泛替代了過去一定要使用放射性標(biāo)記的核酸測序、放射免疫分析、核酸的分子雜交檢測等領(lǐng)域。原位質(zhì)譜成像技術(shù)作為一種不需外源標(biāo)記的非放射性技術(shù)，已經(jīng)成為放射自顯影技術(shù)的競爭者［5-7］，用于研究目標(biāo)分子在組織切片中的分布。本文分析歸納了近年來放射自顯影技術(shù)應(yīng)用仍比較活躍領(lǐng)域中的工作進展，試圖梳理放射自顯影技術(shù)應(yīng)用的一些主流趨勢，提高共用技術(shù)平臺服務(wù)的針對性和有效性。

1 放射自顯影的基本方法

1.1 基于X光膠片的顯影技術(shù)

X光膠片乳膠內(nèi)含有細(xì)微的氯化銀微晶，受到一定能量以上的光（如電離輻射、日光等）照射，就會發(fā)生光化學(xué)還原反應(yīng)生成金屬銀顆粒。通過顯影和定影漂洗將未還原的氯化銀除去，從而在膠片上留下感光后生成金屬銀顆粒圖像。射線能量越高，能夠透達(dá)乳膠層的深度越深，強度越高生成的銀顆粒密度也越高。32P的β射線能量太高，成像的分辨率低，僅適合于在DNA或RNA等檢測中做定性、定量分析。而3H、14C、33P、35S 這類低能β 粒子，只能達(dá)到乳膠基質(zhì)層的一定深度，除用于定量外還能用來分辨放射性核素在動植物組織乃至亞細(xì)胞器中的分布定位。獲得理想的曝光結(jié)果通常需經(jīng)較長的曝光時間，例如要想獲得3H 標(biāo)記探針的高分辨組織切片圖像需要壓片10 周左右［8］。因而在實際應(yīng)用中縮短樣品的自顯影時間對提高科研效率有相當(dāng)大的吸引力。

在分子生物學(xué)應(yīng)用中，人們更關(guān)心如何快速獲取檢測樣品的信號強度。用含3H、14C、35S 探針的凝膠電泳法分析標(biāo)記蛋白質(zhì)或核酸的放射自顯影是實驗中經(jīng)常遇到的問題。以3H 為例，它在水中的射程約0.8 μm，在凝膠電泳膠中，可以近似認(rèn)為只有膠表面上的樣品具有放射成像的作用，采用0.75 mm厚度的薄膠容易制備成干膠，降低水介質(zhì)對電離輻射的衰減作用，同時抑制因曝光時間長導(dǎo)致的樣品條帶彌散的缺陷［9］，將電泳膠內(nèi)的放射標(biāo)記樣品條帶轉(zhuǎn)移到薄膜上也能有效降低凝膠介質(zhì)對弱β 輻射的衰減作用。試劑EN3HANCE 能夠改善弱β核素的放射自顯影效果，其原理是將溶有閃爍劑的二甲基亞砜（DMSO）溶液浸潤膠條后，再將膠條置于曝光盒中對樣品進行曝光，此時膠片曝光機制已發(fā)生改變，由處理前的電離射線直接導(dǎo)致氯化銀的光還原反應(yīng)轉(zhuǎn)化為電離射線激發(fā)閃爍劑產(chǎn)生的熒光引起氯化銀的光還原反應(yīng)。由于水、DMSO 等溶劑對液閃信號有一定程度的猝滅效應(yīng)，該試劑的信號增強效果有限。Long等［10］在檢測組蛋白甲基化酶對核小體蛋白的甲基化作用時，采用［3H］SAM作為甲基供體，并通過膠片放射自顯影展示目標(biāo)蛋白產(chǎn)物的分子質(zhì)量信息以及不同條件下甲基化產(chǎn)物的量的變化。為了提高樣品的顯影效率，利用電轉(zhuǎn)技術(shù)將標(biāo)記后的蛋白質(zhì)樣品條帶從SDS凝膠轉(zhuǎn)移到硝基纖維素薄膜上，再將2,5-二苯基噁唑/冰乙酸閃爍液噴涂到薄膜上，待冰醋酸揮發(fā)后，曝光盒中壓片1 d，經(jīng)顯影和定影處理可獲得很好的成像效果。與EN3HANCE 方法的不同之處是這種改進降低或消除了溶劑的猝滅作用。

1.2 基于磷屏的自顯影技術(shù)

20 世紀(jì)60 年代發(fā)現(xiàn)了某些磷光物質(zhì)在電離輻射處理后能夠在特定激光的激發(fā)下產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光現(xiàn)象（OSL）［11］，分子能帶理論認(rèn)為電離輻射（如X光）照射磷光物質(zhì)能夠產(chǎn)生初級自由電子和空穴載體對，這些空穴載體與物質(zhì)中的晶格撞擊產(chǎn)生二級電子和空穴對并伴隨著能量損失（熱損失），最終通過化學(xué)發(fā)光或電子俘獲而消失。如果引入一個外源激光激發(fā)就能啟動空穴載體俘獲自由電子的過程從而釋放能量，這部分能量以化學(xué)發(fā)光的形式釋放出來。晶格缺陷或摻入某種雜質(zhì)對磷光物質(zhì)進行改性能夠提高自由電子和空穴載體的穩(wěn)定性，減少體系的能量損失。

圖1顯示了電離輻射信息的寫入、記憶、讀取以及擦去的模式圖。在實際操作中，往往將這類具有OSL性質(zhì)的材料涂布到硬板或軟板材料的一面，制成商品化的磷屏。在放射自顯影時，將放射性樣品和具有OSL 性質(zhì)的材料涂層緊密壓在一起，并保存在樣品盒中，讓放射性探針照射磷屏一段時間（稱為寫入），然后移去放射性樣品，寫入磷屏的信息就得到了保存（稱為記憶），記憶了信息的磷屏經(jīng)激光掃描，磷屏中的信息就會以光的形式釋放并通過積分器記錄特定時間內(nèi)的光致化學(xué)發(fā)光信號強度（稱為讀取）。記憶在磷屏內(nèi)的信息可以反復(fù)讀取，但每讀取一次，記憶信息的信號強度就會有一定程度的降低。磷屏中記憶的信息量和輸入信息（電離輻射強度）在一定的范圍內(nèi)成線性關(guān)系。輸入信息高于其閾值會導(dǎo)致信號過飽和。同時記憶在磷屏中的信號是亞穩(wěn)定的，漏光/高溫會損失儲存的信息。使用磷屏的最后一步是對記憶信息的擦去。通常廠商會配備一定強度的日光燈箱，通過光照擦去原先記憶的信息。經(jīng)這一處理后，磷屏可進入下一輪的信息寫入、記憶、讀取過程。利用磷屏技術(shù)進行放射自顯影所需的時間較傳統(tǒng)膠片法顯著縮短，信號靈敏度也顯著提高，讀取電離輻射信號的線性區(qū)間廣，操作更快捷。系統(tǒng)研究表明，磷屏成像技術(shù)可以廣泛地應(yīng)用于各種放射自顯影的操作中，結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)品的使用，能夠獲得成像圖中不同區(qū)域的放射探針的定量結(jié)果［12-14］。

Fig. 1 An illustration of optically stimulated luminescence phenomenon圖1 磷屏的光致化學(xué)發(fā)光現(xiàn)象示意圖

磷屏技術(shù)應(yīng)用到放射自顯影中使得放射示蹤分子生物學(xué)研究方便了許多，除縮短32P 標(biāo)記樣品的曝光時間、提高對放射信號的檢測靈敏度外，對弱放射性核素成像操作的便利性更為顯著。14C和35S標(biāo)記物的SDS 凝膠電泳膠片、薄層色譜板等都可以直接壓屏［15］，并獲得良好的信號強度。為了保證磷屏不被污染，通常是將放射標(biāo)記樣品用塑料薄膜包起來。因為14C和35S的穿透能力比較弱，所用的塑料膜越薄越好，而且只包裹樣品。對于3H 標(biāo)記的放射性樣品，需要特殊型號磷屏（如美國富士生物醫(yī)療系統(tǒng)公司的BAS TR2040s，一種不含保護性涂層的產(chǎn)品型號），并且標(biāo)記樣品（如SDS凝膠電泳的電轉(zhuǎn)膜樣品）和磷屏的感應(yīng)面要緊壓在一起。使用磷屏做放射自顯影時要留心壓屏前的磷屏是沒有被污染的。

目前在學(xué)術(shù)研究領(lǐng)域，X光膠片放射自顯影法和磷屏放射自顯影法同時存在，選用哪一種方法主要取決于研究人員的個人偏好和操作設(shè)備的便利可及性。

2 放射自顯影技術(shù)的應(yīng)用

2.1 在分子生物學(xué)中的應(yīng)用

2.1.1酶活檢測

放射性示蹤因其信號的專一性、高靈敏性和檢測的便利性在分子生物學(xué)的定性鑒定和定量檢測方面得到廣泛的應(yīng)用，并成為諸多檢測方法的金標(biāo)準(zhǔn)。伴隨著放射性檢測發(fā)展的同時，也出現(xiàn)了多種非放射性替代技術(shù)，主要是熒光標(biāo)記檢測或化學(xué)發(fā)光檢測技術(shù)。目前熒光標(biāo)記法和放射自顯影法的檢測靈敏度大致相當(dāng)［16］。盡管放射自顯影技術(shù)的應(yīng)用空間受到一定的擠壓，放射性標(biāo)記不改變探針分子結(jié)構(gòu)的特征還是為該技術(shù)的應(yīng)用提供了頑強的生命力。在研究DNA聚合酶、RNA聚合酶等酶的功能方面，放射自顯影技術(shù)仍是主要手段。在分析這類反應(yīng)的產(chǎn)物時，放射性底物的量要遠(yuǎn)高于產(chǎn)物的量，未反應(yīng)底物的信號會嚴(yán)重影響低放射標(biāo)記的產(chǎn)物分析，磷屏顯影技術(shù)可以非常迅速地確定游離底物的前沿位置，通過切除后適當(dāng)延長曝光時間，往往容易獲得較好的產(chǎn)物條帶圖像［17-18］。對于小分子底物的酶促反應(yīng)，薄層層析法［19-20］的放射自顯影技術(shù)也是一個適當(dāng)?shù)倪x擇。Xu等［19］在研究環(huán)化GMP-AMP 合成酶的酶活時，以［α-32P］ATP 為放射性底物，采用HPTLC Silica gel 60 為分離介質(zhì)，使得ATP和產(chǎn)物cGAMP得到了非常好的分離，經(jīng)放射自顯影得到理想的酶活變化結(jié)果。另外，通過磷屏成像掃描，還可以定量測定酶促反應(yīng)的理化常數(shù)。Hao 等［21］在研究解旋酶的ATP 酶活性時，采用不同濃度［γ-32P］ATP 為底物反應(yīng)一定程度后，加入EDTA猝滅酶活；過去采用放射法測定ATP酶的活性時，常采用DEAE-纖維素作為分離介質(zhì)，但該產(chǎn)品已經(jīng)停產(chǎn)；Hao 等［21］采用Sigma 產(chǎn)陽離子改性薄層纖維素薄膜（一種被低聚乙二胺修飾的纖維素材料）對反應(yīng)物進行分離，經(jīng)磷屏成像，讀取放射性磷酸的掃描信號強度，對磷酸產(chǎn)物的生產(chǎn)速率和底物ATP 的濃度作圖，并用米氏方程進行數(shù)據(jù)分析獲得酶的米氏常數(shù)為6.4 μmol/L，最大反應(yīng)速度為2.4 μmol/L·min?？梢姴捎梅派渥燥@影技術(shù)測定時，不論是電泳分離法還是薄層層析分離都對設(shè)備要求不高，操作周期都比較短，分離條件的優(yōu)化也比較快捷，對多種酶而言，放射自顯影是一種適當(dāng)?shù)幕钚詼y定通用技術(shù)。

2.1.2磷酸化位點分析

蛋白質(zhì)磷酸化是細(xì)胞信號調(diào)控的重要現(xiàn)象，涉及到體內(nèi)信號調(diào)控的多個通路。蛋白質(zhì)的磷酸化是通過蛋白激酶將ATP中的磷酸基團轉(zhuǎn)移到蛋白質(zhì)、多肽底物上的絲氨酸、蘇氨酸或酪氨酸殘基上，直接影響底物蛋白的活性、功能或定位。底物蛋白上可以有一個或多個磷酸化修飾位點，不同位點的磷酸化狀態(tài)不同，蛋白質(zhì)的生物功能也會有所不同。因而，鑒定蛋白質(zhì)的磷酸化修飾位點，闡述其生物學(xué)意義是研究體內(nèi)信號通路的一個重要內(nèi)容。32P標(biāo)記在蛋白質(zhì)磷酸化位點分析方面有著廣泛的應(yīng)用，尤其是近幾年質(zhì)譜技術(shù)的發(fā)展，使得磷酸化位點的鑒定變得更為便捷。雖然制備磷酸化位點專一的磷酸化抗體可以鑒定特定蛋白質(zhì)的磷酸化位點［22］，但當(dāng)存在多個潛在的磷酸化位點需要逐一驗證時，如果每個磷酸化位點都要制備相應(yīng)的專一性抗體，則需要投入巨大的人力物力。這時32P 標(biāo)記技術(shù)的快速簡潔及結(jié)果明確的優(yōu)勢仍然是研究工作者的首選。Zhao 等［23］發(fā)現(xiàn)，水稻磷酸化酶PP2A 的B'κ 亞基可以使類受體激酶SIT1 中激酶活化環(huán)（activation loop）上的磷酸化氨基酸殘基去磷酸化，起到直接抑制鹽誘導(dǎo)的SIT1 磷酸化作用，同時類受體激酶通過對B'κ亞基的磷酸化提高該亞基的穩(wěn)定性，起到削弱26S蛋白酶體對其降解、增強水稻抗鹽性的作用。質(zhì)譜分析發(fā)現(xiàn)，B'κ 亞基的4 個肽段中含有4 個潛在的磷酸化位點（S330/S331，T476、T493 和S502/T508）。質(zhì)譜技術(shù)的出現(xiàn)極大縮小了潛在磷酸化位點的待驗證數(shù)目，但是還需要通過體外激酶活性實驗并結(jié)合放射自顯影技術(shù)做進一步驗證。以B'κ亞基的不同突變體為底物進行體外磷酸化SDS-Page 放射自顯影分析，發(fā)現(xiàn)只有B'κS502A、B'κT508A以及雙突變體B'κST502508AA的磷酸化產(chǎn)物被顯著抑制。進一步的功能分析驗證了正是B'κ亞基Ser502而不是Thr508的磷酸化在調(diào)控水稻的耐鹽中起著關(guān)鍵的調(diào)控作用。上述結(jié)果同時也暗示了單純的體外磷酸化研究和體內(nèi)的作用機制可能存在一定的差異。目前并不清楚在體內(nèi)環(huán)境下Thr508 是否發(fā)生了磷酸化。如果Thr508 不發(fā)生磷酸化，細(xì)胞內(nèi)又是通過怎樣的機制來保持Thr508的去磷酸化狀態(tài)的？如果發(fā)生了磷酸化，又會對水稻的生長、發(fā)育有何影響？因此，在許多情形下采用活細(xì)胞進行標(biāo)記研究分子修飾的反應(yīng)機制就顯得很有必要。

正磷酸的32P 探針標(biāo)記法為體內(nèi)磷信號表達(dá)、加工、活化過程的功能研究提供了便利條件［24-25］。Fam20C 蛋白家族是蛋白質(zhì)分泌途徑中的主要激酶，是分泌型磷酸化蛋白質(zhì)組的主要加工者，丟失功能的突變可導(dǎo)致致命的骨硬化性骨發(fā)育不良綜合癥［26-27］。Fam20C 是II 型跨膜蛋白，新生肽鏈在體內(nèi)合成后，被轉(zhuǎn)運到高爾基體，并在此經(jīng)膜蛋白site-1 蛋白水解酶（S1P）加工切去Fam20C 的前肽，激活Fam20C的激酶活性，調(diào)控下游靶蛋白的磷酸化狀態(tài)，進而調(diào)控細(xì)胞的生理功能［28］。Chen等［29］在研究S1P 剪切活化Fam20C 的激酶功能過程中，以HeLa細(xì)胞為宿主，在培養(yǎng)基中加入32P標(biāo)記的磷酸，作為磷酸化的磷供體，對激酶底物OPN 通過免疫共沉淀進行富集分離后，經(jīng)SDSPage 分離、電轉(zhuǎn)到硝基纖維素膜上，再通過放射自顯影分析磷酸化反應(yīng)的程度。共表達(dá)Fam20C和OPN，并在培養(yǎng)液中加入不同濃度的S1P酶抑制劑PF-429242可以發(fā)現(xiàn)OPN的磷酸化程度受到了顯著的抑制。通過RNA 干擾技術(shù)敲除S1P 標(biāo)簽基因的表達(dá)，經(jīng)類似的放射自顯影分析也驗證了S1P 對Fam20C 前肽的切除對該激酶的活性發(fā)揮起著重要的作用。

可見放射性探針在研究蛋白質(zhì)磷酸化位點的過程中不論是體外分析還是體內(nèi)鑒定都提供了高效、專一的實驗方法。

2.1.3蛋白質(zhì)-核酸相互作用

在蛋白質(zhì)-RNA 相互作用研究方面，確定存在著特定蛋白質(zhì)與RNA 相互作用的現(xiàn)象是解決問題的第一步。盡管在RNA 的發(fā)現(xiàn)方面已經(jīng)建立了一些非放射性技術(shù)，如基于微陣列的RNA 分析［30］、RNA的深度測序分析［31］以及熒光標(biāo)記的原位雜交分析技術(shù)［32］，但缺點是很難建立起RNA序列和蛋白質(zhì)之間的相互作用關(guān)系。32P 標(biāo)記法是確定目標(biāo)蛋白具有RNA 結(jié)合功能的重要手段，專一性強，也是指導(dǎo)鑒定RNA序列、分析蛋白質(zhì)-RNA復(fù)合物功能的銳利眼睛。Chen等［33］通過光交聯(lián)結(jié)合免疫沉淀測序技術(shù)（CLIP-seq）成功發(fā)現(xiàn)在活化B細(xì)胞中存在著蛋白質(zhì)分子ROD1 與RNA 之間的相互作用。具體操作中，首先將一定數(shù)量的B 細(xì)胞經(jīng)254 nm 紫外線輻照，制備蛋白質(zhì)-RNA 交聯(lián)復(fù)合物，細(xì)胞裂解后經(jīng)過免疫共沉淀富集產(chǎn)物，再經(jīng)核酸酶處理，并在5'端標(biāo)記32P。樣品經(jīng)SDS-Page 電泳后，電轉(zhuǎn)到硝酸纖維素膜上，并通過放射自顯影獲得ROD1 處的彌散條帶?；厥诊@影條帶處的RNA樣品，最終完成對結(jié)合RNA的序列分析，進而闡明了存在RNA 介導(dǎo)的蛋白質(zhì)分子ROD1 與AID 結(jié)合形成復(fù)合物，并組裝到特定的基因位點，誘導(dǎo)免疫過程中DNA重排的反應(yīng)機制。因為RNA容易降解，同時蛋白質(zhì)-RNA 交聯(lián)產(chǎn)物的豐度低，這類實驗要獲得好的結(jié)果往往需要反復(fù)的條件優(yōu)化探索。

上述分析表明，當(dāng)非放射性替代技術(shù)缺乏靈敏度高、標(biāo)記產(chǎn)率高、標(biāo)記條件溫和的標(biāo)記探針時，放射自顯影仍是解決研究中各種問題的高效方法。

2.2 在組織化學(xué)研究中的應(yīng)用

Pelc［34］通過給實驗大鼠皮下注射放射性131I后，甲狀腺組織經(jīng)乙醇固定、石蠟包埋制成5 μm厚的切片，然后和感光膠片接觸曝光，經(jīng)顯影、定影后獲得了放射性碘在甲狀腺組織中分布的清晰圖片，14C、33P、35S 等人工核素的成功制備及其標(biāo)記探針合成技術(shù)的進步開啟了利用放射性示蹤法研究標(biāo)記物在生物體組織分布，及在細(xì)胞內(nèi)亞細(xì)胞器定位的新紀(jì)元。按照加入放射性標(biāo)記探針到細(xì)胞、組織中的方式不同，放射自顯影操作可分為活體標(biāo)記的組織切片放射自顯影和體外標(biāo)記的組織切片放射自顯影兩大類。在活體標(biāo)記樣品制備模式中，放射性標(biāo)記探針直接輸入到活體生物體內(nèi)后，對生物體或某些器官組織進行包埋后冷凍切片，再經(jīng)感光膠片或磷屏進行成像分析。依據(jù)研究目標(biāo)又分為側(cè)重于研究探針在生物體內(nèi)各組織器官的分布變化的，稱之為整體放射自顯影 （whole-body autoradiography，WBA），以及側(cè)重于研究探針在組織細(xì)胞中分布及其與結(jié)合靶點相互作用信息的，稱之為顯微放射自顯影（microautoradiography，MARG）。

2.2.1整體放射自顯影

動物WBA 技 術(shù) 最初由Ullberg探索成功［35］。動物經(jīng)放射性喂食或注射標(biāo)記后，處死并用聚合物包埋，再在低溫冷凍條件下切成薄片，轉(zhuǎn)移到載玻片上進行自顯影操作。切片的厚度取決于切片機的性能，目前切片的厚度介于30~100 μm［36-37］。數(shù)字化成像屏替代X 光膠片使得操作變得更加便利［13-14，38-39］，成像所需時間也顯著縮短。對實驗動物的全切片圖像數(shù)據(jù)還可以進行數(shù)字化構(gòu)建，形成探針在實驗生物體內(nèi)的三維空間分布，成為定性與定量研究標(biāo)記藥物的劑量與給藥時間變化對藥物在體內(nèi)存留及分布變化的重要手段，為臨床前新藥的吸收、分布、代謝和排泄等藥理機制研究提供重要的量化參數(shù)［40-41］。小分子化合物AZD5248 曾是一個臨床前研究的口服二肽酶抑制劑，用于治療慢性阻塞性肺病。對實驗大鼠口服［14C］AZD5248 后的不同時間進行定量WBA 分析發(fā)現(xiàn)，給藥1 h 后［14C］AZD5248在體內(nèi)分布就達(dá)到高峰，且在各組織器官中廣泛分布，標(biāo)記藥物及其代謝物主要通過膽汁和尿液分泌排泄到體外，給藥21 d后仍能在主動脈觀察到顯著的放射性存留，而在其他組織中放射性存留已接近本底，電鏡觀察認(rèn)為放射標(biāo)記化合物結(jié)合在動脈的彈性組織中，結(jié)構(gòu)分析認(rèn)為AZD5248 中的伯氨基官能團與動脈血管中的彈性蛋白發(fā)生鉸鏈?zhǔn)茿ZD5248 滯留在動脈血管最有可能的原因。這一發(fā)現(xiàn)終結(jié)了AZD5248 進行后續(xù)臨床研究工作的可能性［42］。通過對AZD5248的結(jié)構(gòu)進行系統(tǒng)改造，將六元環(huán)上的伯氨基經(jīng)擴環(huán)變?yōu)橹侔被?，使原來的六元環(huán)擴展為七元環(huán)，同時對分子的其他部位也進行改造，最終得到了一個功能良好的新的二肽酶抑制劑AZD7986［43］。［14C］AZD7986合成成功后，再次采用定量WBA法對該化合物在大鼠體內(nèi)的存留分布進行研究，結(jié)果證實了AZD7986 沒有類似于AZD5248 的在動脈血管彈性組織存留的問題，隨后AZD7986 成功進入了臨床研究［44］。WBA技術(shù)不僅在動物研究中被廣泛使用，在植物的營養(yǎng)轉(zhuǎn)運、農(nóng)藥的代謝分布等方面也起著重要的作用［45-46］。Kubicki等［46］研究了［14C］甲霜靈在西紅柿植株中的轉(zhuǎn)運過程。將已長出3片葉子的西紅柿植株無土栽培到含0.2 ppm［14C］甲霜靈的培養(yǎng)罐中，生長10 d后，采集根、莖、葉進行分析，發(fā)現(xiàn)97%的［14C］甲霜靈已被吸收轉(zhuǎn)運到植株體內(nèi)，其中葉占70%，根占2%以下。對根和葉片的放射自顯影研究顯示，在根系部位放射性物質(zhì)更趨向集中分布在上部一側(cè)，在葉片中的分布情況是放射探針沿葉脈分布并終止在葉片邊緣，在嫩葉中的分布更顯著，且呈現(xiàn)出向頂性分布態(tài)勢。甲霜靈的這種分布反映出［14C］甲霜靈從根吸收后向新的生長區(qū)域快速運動的特性。

雖然WBA能夠提供比較豐富的放射性分布信息，但是它的不足也是很明顯的。首先，WBA 法獲得的只是某組織區(qū)域放射性總體信號或轉(zhuǎn)化為對應(yīng)探針的總濃度，至于探針分子是結(jié)合到作用靶分子上還是游離在組織細(xì)胞中，就不得而知了。其次，所得總信號中是否含有起始標(biāo)記探針的代謝物也不得而知（這方面可以利用HPLC-MS技術(shù)進行代謝物的結(jié)構(gòu)研究［46-47］）。再次，如果所研究的探針靶點在組織中的豐度比較低，那么針對低豐度靶點的放射自顯影信號就會很低，從而淹沒在WBA結(jié)果的信號本底中。

2.2.2顯微放射自顯影

MARG技術(shù)可以部分彌補WBA的不足，成為研究放射性探針在組織細(xì)胞中與靶分子相互作用的重要方法。然而不同文獻中的MARG 具體操作條件指代并不相同，某些情況下更像是一個壓縮版的WBA分析［48］。對于活體標(biāo)記的研究對象而言，要獲得放射探針在組織亞細(xì)胞器分布的清晰圖像，熟練掌握高分辨MARG 制備技術(shù)尤為關(guān)鍵，其中獲取足夠薄的切片（不超過4 μm，乃至1 μm）是降低/避免游離探針的噪音信號獲取成功的共同特征之一，Stumpf［49］稱這種制樣操作下研究受體分布的技術(shù)為受體顯微放射自顯影，利用此技術(shù)他們發(fā)現(xiàn)［50］，與大多數(shù)受體分布在細(xì)胞膜上不同，雌二醇受體分布在子宮細(xì)胞的細(xì)胞核上，近來又報道雌二醇受體在早期孕鼠的子宮內(nèi)膜基質(zhì)中已獲得表達(dá)［51］。此方法在維生素D 受體分布的研究中也取得了一系列的成果［52-53］。而體外放射探針標(biāo)記的MARG 操作在研究中使用的就更加廣泛，尤其是該操作還能夠以人源尸體組織為材料，研究放射探針的分布及與靶標(biāo)間的相互作用，因而能夠提供更加豐富的信息。與活體標(biāo)記的MARG 技術(shù)不同，體外標(biāo)記MARG 的優(yōu)勢之一就是能夠控制影響探針與作用靶點專一作用的操作因素，這包括通過預(yù)先處理樣品去除原本結(jié)合在靶分子中的內(nèi)源性配體達(dá)到靶分子預(yù)活化的目的，也包括預(yù)先封閉可能存在的非專一性結(jié)合位點以及調(diào)整探針標(biāo)記的pH、溫度、作用時間等實驗因素。在體外標(biāo)記樣品的制備過程中，通常都會在標(biāo)記之后對樣品進行清洗以去掉未結(jié)合的放射探針，避免活體標(biāo)記方法檢測樣品中游離探針或其代謝產(chǎn)物的影響。因而在高度選擇專一性的放射性標(biāo)記配體存在下，MARG 能夠展現(xiàn)靶分子蛋白質(zhì)豐度的組織分布，在受體的研究中得到了廣泛的應(yīng)用［54-56］。 Mitsukawa 和Kimura［57］采用3H 標(biāo)記的Orexin 2 受體選擇性拮抗劑EMPA為探針，通過定量顯微放射自顯影研究了Orexin 2受體在大鼠腦及外周組織中的分布。在定量研究的51個腦組織部位和10個外周組織中發(fā)現(xiàn)，Orexin 2受體在大鼠腦組織廣泛表達(dá)，而在外周組織幾乎不表達(dá)。除受體之外放射自顯影在阿尓茨海默?。ˋD）的病理研究以及臨床診斷技術(shù)開發(fā)中也發(fā)揮著重要作用。與淀粉樣纖維化Aβ類似，Tau蛋白的過度磷酸化所導(dǎo)致的神經(jīng)纖維纏結(jié)也是導(dǎo)致AD的原因之一，發(fā)展神經(jīng)纖維纏結(jié)的早期檢測技術(shù)對于AD的早期發(fā)現(xiàn)、早期治療具有重要的應(yīng)用價值［58-60］。THK5117［59］是一個對Tau 導(dǎo)致的神經(jīng)纖維纏結(jié)專一性結(jié)合的探針分子，采用死亡的AD患者腦組織的顳葉部分通過液閃方法測定發(fā)現(xiàn)，含有2個THK5117結(jié)合位點，解離常數(shù)分別為2.2 nmol/L和23.6 nmol/L，以［3H］THK5117 為探針，對死亡患者腦組織切片進行標(biāo)記后放射自顯影，結(jié)果顯示［3H］THK5117 集中分布在海馬區(qū)、顳皮質(zhì)以及額葉等部位，為采用［18F］THK5117 進行體內(nèi)的PET成像分析提供了研究基礎(chǔ)。

體外標(biāo)記顯微放射自顯影可以提供高精度的受體空間分布，為其他研究技術(shù)，包括正電子發(fā)射斷層成像（PET）技術(shù)提供有效的比較模型及空間參數(shù)。正電子成像是研究能發(fā)射正電子射線的核素立體空間分布的一種成像方法，因其使用的核素半衰期較短，射線的電離能量不是太高，小劑量輻射對人的健康影響不大，因而在臨床前以及臨床診斷方面有著廣泛的應(yīng)用。研究人員已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在某些條件下PET成像提供的放射性探針分布信息存在著一定的失真，例如腦干區(qū)域的放射性配體與受體結(jié)合的定量結(jié)果的可靠性就比較差，部分原因是由于成像過程中存在的局部容積效應(yīng)。采用低能量的3H 標(biāo)記探針放射自顯影技術(shù)定量研究放射性配體與靶向受體結(jié)合時，由于3H 的射線能量低，只有組織切片表層的探針能夠使膠片或磷屏曝光，避免了組織深層處的放射性探針對感光信號的影響，從而避免類似于PET中的局部容積效應(yīng)帶來的信號失真。同時對完整腦干組織的每張切片自顯影圖像數(shù)據(jù)按照切片的依次順序通過數(shù)據(jù)的三維構(gòu)建就能夠得到放射探針在腦干組織分布的三維立體圖像。這種方法得到的放射探針與靶受體結(jié)合的空間分辨率更高［61］。Veldman等［62］采用［3H］AZ10419369為探針，采用人源尸體的腦干為材料，構(gòu)建了5-HT1B受體的高分辨受體-配體分布模板，基于［11C］AZ10419369 探針的人腦干PET 數(shù)據(jù)按照該模板對觀測空間進行分析，獲得了一套放射探針空間分布的分析數(shù)據(jù)（標(biāo)記為ARG模板結(jié)果）；同時他們借助于磁共振成像（MRI）提供的觀測空間參數(shù)并嵌入到PET 數(shù)據(jù)中作為觀測空間模板，對PET 數(shù)據(jù)進行分析獲得了另一套的分析數(shù)據(jù)（標(biāo)記為PET模板結(jié)果），通過比較不同模型下放射性配體的分布結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在腦干的大部分區(qū)域，PET模板法獲得的歸一化的受體結(jié)合值較ARG 模板法獲得的歸一化的特異性結(jié)合值高，這種差異在背部的腦干部分觀測空間更加明顯；相反在腦干近尾部觀測空間的歸一化的受體結(jié)合值（PET模板法）較歸一化的專一性結(jié)合值（ARG 模板法）要低。他們認(rèn)為這種差異的存在是由于PET中局部容積效應(yīng)造成的，這種差異的出現(xiàn)值得關(guān)注。

體外標(biāo)記MARG 研究不僅能用來研究靶點分子的組織細(xì)胞內(nèi)定位分布，還可以定量研究探針與靶分子的結(jié)合能力。研究中多采用冷凍切片法，此時靶點蛋白仍處于活性構(gòu)象，通過改變標(biāo)記探針的濃度，檢測探針與靶分子的結(jié)合量就獲得了標(biāo)記探針濃度與靶分子結(jié)合之間的定量變化關(guān)系，通過計算就能定量表征探針與靶分子間的親和力常數(shù)以及靶分子結(jié)合探針分子的分子數(shù)等理化常數(shù)［63-64］。適度的解離常數(shù)是放射探針能夠成為體內(nèi)示蹤探針的首要條件之一。Mikkelsen等［65］利用放射自顯影技術(shù)定量表征了新合成的放射標(biāo)記配體［3H］JNJ-64413739 與靶向P2X7 受體相互作用的理化參數(shù)。P2X7 受體在藥物難治性癲癇患者的顳皮質(zhì)組織中表達(dá)增加，被認(rèn)為是PET成像臨床檢測神經(jīng)性炎癥的第二代放射性配體靶標(biāo)。實驗用的組織材料來自于對藥物難治性顳葉癲癇患者進行神經(jīng)手術(shù)治療時切除的顳皮質(zhì)組織。將載有該組織切片的載玻片在室溫用含有0.5% BSA 的緩沖液進行預(yù)孵育后轉(zhuǎn)移到含有不同濃度［3H］JNJ-64413739的孵育液中孵育2 h，然后晾干進行放射自顯影操作，再對放射自顯影信號強度與配體的濃度作圖，在扣除切片組織對疏水性放射探針的非特異吸附形成的本底后，探針的結(jié)合數(shù)據(jù)按照單點結(jié)合模式進行分析。在選定的條件下，［3H］JNJ-64413739 既能與蛋白質(zhì)中的P2X7 受體結(jié)合也能與灰質(zhì)中的P2X7受體結(jié)合，在飽和配體條件下兩者的解離常數(shù)相近，都是約7 nmol/L，但最大結(jié)合量方面白質(zhì)比灰質(zhì)高約40%。此前對［18F］JNJ-64413739的PET臨床研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)該探針適合于定量表征人腦中P2X7受體的表達(dá)［66-67］，Mikkelsen 等［65］的定量研究為［18F］JNJ-64413739探針的臨床應(yīng)用提供了理論基礎(chǔ)。

2.2.3正電子標(biāo)記探針的顯微放射自顯影

磷屏掃描成像技術(shù)大大縮短了組織切片的曝光時間，為短半衰期的核素（如11C、18F、90Y等）標(biāo)記探針的放射自顯影提供了可能。如同14C 在有機化合物藥物標(biāo)記中不改變藥物的分子結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)因而得到廣泛應(yīng)用一樣，11C、18F 標(biāo)記的放射探針在PET 成像中也獲得了廣泛的應(yīng)用，但在采用放射自顯影研究PET 成像探針的靶向?qū)Ｒ恍詴r，大多數(shù)研究人員仍采用14C或3H標(biāo)記的同一結(jié)構(gòu)化合物進行體外標(biāo)記的放射自顯影操作技術(shù)，這意味著需重新探索14C或3H標(biāo)記探針的合成，因而會大幅增加研究人員的工作量和研究成本。如果能夠直接采用正電子探針開始體外組織的放射自顯影研究將會有力推動PET示蹤劑的探索工作。5-HT1A受體廣泛分布在中樞神經(jīng)系統(tǒng)，海馬、中縫核以及大腦皮質(zhì)中分布更加密集，在多種神經(jīng)精神性疾病以及神經(jīng)退行性腦病的病理過程中起著重要的作用，因此開發(fā)高效專一，合成便利的靶向5-HT1A受體PET探針是當(dāng)下研發(fā)的一個熱點。Dahl等［68］合成了兩個11C 標(biāo)記的類似化合物［11C］ AZ11132132 和［11C］AZ11895530，其骨架結(jié)構(gòu)非常類似，不同點主要在叔氨基上的兩個取代基略有不同，在AZ11132132 中是兩個剛性非常大的環(huán)丁基，而在AZ11895530 中變?yōu)橐粋€環(huán)戊基和一個線狀的正丙基。為了鑒定這兩個標(biāo)記探針的靶向?qū)Ｒ恍?，以死后人源全腦組織經(jīng)冷凍包埋再切成100 μm 厚的切片為材料，采用體外放射標(biāo)記的方法處理組織后，使用磷屏成像獲得了清晰的放射自顯影圖像。結(jié)果顯示，［11C］AZ11895530在海馬區(qū)和大腦皮層有高密度的結(jié)合，高濃度的WAY1006359（10 μmol/L）通過競爭性結(jié)合抑制［11C］AZ11895530 對海馬區(qū)和大腦皮層組織中5-HT1A受體的結(jié)合，說明適當(dāng)增加叔氨取代基團的柔性有利于化合物與受體的結(jié)合，為進一步開展對［11C］AZ11895530 的PET 研究提供了作用機制方面的基礎(chǔ)。采用活體樣品制備方法對［11C］［69］以及［18F］［70］標(biāo)記探針的放射自顯影也取得良好的成像結(jié)果，這為放射性標(biāo)記探針在體內(nèi)的分布研究提供了多種方法互相參考驗證的途徑。

3 展 望

放射自顯影技術(shù)提供了從分子、組織以及整體層次認(rèn)識生物體的組織結(jié)構(gòu)和新陳代謝功能的多維度研究手段。同時在分子、組織、整體層次也都存在著多種非放射性實驗技術(shù)與放射自顯影技術(shù)形成補充。非放射性技術(shù)能夠部分取代放射自顯影，已經(jīng)成為常規(guī)實驗的首選，但在某些條件下，放射自顯影技術(shù)的檢測特異性、靈敏性和不改變探針分子結(jié)構(gòu)的特性使得該技術(shù)仍然是研究過程中離不開的實驗方法，這一點在某些酶的活性研究、蛋白質(zhì)翻譯后修飾位點鑒定、低豐度蛋白質(zhì)-核酸相互作用研究等應(yīng)用方面已經(jīng)得到充分體現(xiàn)。熒光標(biāo)記成像的最大障礙在于標(biāo)記結(jié)構(gòu)基團會或多或少地改變被標(biāo)記分子的性質(zhì)。只有熒光標(biāo)記生物大分子（如目標(biāo)蛋白與熒光蛋白融合表達(dá)）的方法，在研究目標(biāo)分子在體內(nèi)的加工、代謝以及與靶點作用等方面已經(jīng)得到了廣泛的應(yīng)用［71］，但研究熒光標(biāo)記的小分子行為時，熒光基團對小分子結(jié)構(gòu)和功能的影響就不能不考慮［72］，這也是熒光標(biāo)記小分子技術(shù)應(yīng)用受到一定限制的重要原因之一。原位質(zhì)譜成像技術(shù)是放射自顯影法研究組織分布的一個新的強有力競爭者。原位質(zhì)譜成像的一個主要特點就是不需要進行標(biāo)記，可進行單一分子的質(zhì)譜成像也可同時對多個內(nèi)源分子進行成像疊加，擴大研究目標(biāo)分子的范圍。質(zhì)譜成像可以在細(xì)胞及亞細(xì)胞器分布的分辨率水平對目標(biāo)分子的分布進行定性與定量分析［5-7］。應(yīng)當(dāng)注意到，質(zhì)譜技術(shù)測定分子結(jié)構(gòu)的底層核心假設(shè)是在一定的分子質(zhì)量精度下，按照分子式計算的精確分子質(zhì)量與測定分子質(zhì)量匹配的所有分子，包括同一分子的各種同分異構(gòu)體都是可能的檢測結(jié)構(gòu)。理論上通過提高分子質(zhì)量測定的精度可以提高命中目標(biāo)化合物的成功率，通過二級質(zhì)譜能夠進一步鑒定一級質(zhì)譜篩選出的哪個潛在化合物更符合目標(biāo)化合物的特征。在生物學(xué)研究中通過建立一個完善的僅在生物體系或某個亞體系存在的生物分子化合物庫，確定并縮小與精確分子質(zhì)量測定值相匹配的化合物個數(shù)是生物成像技術(shù)發(fā)展的重要方面之一。建立完善的生物分子數(shù)據(jù)庫，尤其是每一個物種的數(shù)據(jù)庫仍是一個艱巨的工作。另一方面待檢測分子一旦和生物大分子形成共價修飾，如AZD5248 對動脈血管彈性組織的共價修飾［42］，也會逃離質(zhì)譜檢測的能力范圍，因而也需要放射自顯影等技術(shù)的多方驗證。對于檢測低濃度的受體配體，質(zhì)譜成像仍有許多技術(shù)細(xì)節(jié)需要不斷完善［37］。因此生物質(zhì)譜成像技術(shù)是放射自顯影技術(shù)的有益補充。目前質(zhì)譜成像技術(shù)的使用成本仍高，專用的質(zhì)譜設(shè)備普及仍有一個過程。本文引用的靶分子在組織切片中分布的放射自顯影數(shù)據(jù)有一部分和PET工作相關(guān)，說明盡管PET 方法在臨床檢測中應(yīng)用廣泛，得到研究人員的廣泛重視，并成為發(fā)展基于新探針、新靶點的PET診斷技術(shù)工作的一個熱點，但組織切片的放射自顯影分析仍是開拓PET檢測方法的基石。而11C、18F 等正電子核素的磷屏成像分析為PET示蹤劑的篩選提供了快捷的體外組織化學(xué)方法，必將會促進PET示蹤劑合成與優(yōu)化的步伐。因此在組織水平的研究中，尤其是在低豐度探針的分布研究中，放射自顯影技術(shù)在相當(dāng)長的時間內(nèi)仍然是首選方法。

放射自顯影領(lǐng)域的應(yīng)用現(xiàn)狀說明，面對非放射性替代技術(shù)的挑戰(zhàn)，放射性示蹤的優(yōu)勢應(yīng)用領(lǐng)域發(fā)生了一定程度的轉(zhuǎn)移。這和在放射性的液閃檢測技術(shù)應(yīng)用［73］中觀察到的狀況是相似的。除了上述重點介紹的應(yīng)用領(lǐng)域外，放射自顯影技術(shù)在蛋白質(zhì)翻譯后修飾的其他領(lǐng)域，如甲基化［10］、糖基化及其受體［74-76］、軟骨中的二硫鍵［77］，以及動脈粥樣硬化［78］、內(nèi)源性大麻受體的活性［79］等方面的應(yīng)用依然十分活躍。因此，放射示蹤共用技術(shù)平臺的建設(shè)要面向優(yōu)勢領(lǐng)域和當(dāng)前核醫(yī)學(xué)的熱門領(lǐng)域提供配套的核素資源、配套的操作設(shè)施、檢測設(shè)備以及嚴(yán)格的輻射防護管理，通過多種途徑提升放射示蹤操作平臺的應(yīng)用效率。

在實際運行中還要加強對實驗操作人員的輻射安全防護知識和技能的培訓(xùn)。既要防止極少數(shù)操作人員認(rèn)為所用核素輻射能量低、使用劑量少、盲目蠻干的問題，更要關(guān)注大多數(shù)人員對射線的性質(zhì)了解不多，甚至一無所知，卻盲目夸大放射性核素的輻射損傷因素。嚴(yán)格按照放射操作規(guī)范進行相關(guān)工作是保證每一個放射從業(yè)人員安全的關(guān)鍵。我們遇到多個實例，因?qū)嶒炄藛T對放射性示蹤技術(shù)持排斥態(tài)度導(dǎo)致前期的大量非放射性替代操作結(jié)果被拒，或被要求補充相關(guān)的放射性研究結(jié)果因而耽誤了寶貴的時間，盡管這可能和某些審稿人的偏見有關(guān)。因此，根據(jù)實際工作需要適時恰當(dāng)?shù)夭捎梅派渥燥@影等實驗方法對于推動相關(guān)科研工作的進展將會起到重要的作用。