李若雨 陳英翾 韓浩博 溫 凱 安澤勝** 李全順**

（1）吉林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院分子酶學(xué)工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，長(zhǎng)春 130012；2）吉林大學(xué)化學(xué)學(xué)院超分子結(jié)構(gòu)與材料國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，長(zhǎng)春 130012）

酶促聚合是指以酶為催化劑介導(dǎo)單體聚合構(gòu)建高分子材料的途徑［1］。與傳統(tǒng)的化學(xué)聚合相比，酶促聚合由于反應(yīng)條件溫和、環(huán)境友好及高度立體和區(qū)位選擇性等優(yōu)勢(shì)，已成為高分子材料合成領(lǐng)域中的研究熱點(diǎn)［2-3］。不僅如此，酶促聚合還具有如下優(yōu)勢(shì)：a. 底物的高度專一性，可以極大提高底物的轉(zhuǎn)化率，且沒有副產(chǎn)物的生成；b. 催化劑可以回收并重復(fù)利用，有利于降低合成成本；c. 酶促聚合可以在無溶劑、水相、有機(jī)相及多相界面進(jìn)行；d. 能夠有效催化金屬催化劑難于實(shí)現(xiàn)的大環(huán)內(nèi)酯類單體的開環(huán)聚合；e. 容易實(shí)現(xiàn)聚合物末端的結(jié)構(gòu)控制，達(dá)到對(duì)聚合物修飾和改性的目的。作為一種新興的聚合方法，酶促聚合為高分子材料的合成開辟了一條全新的、環(huán)境友好的途徑，是高效合成功能高分子材料的有效方法，對(duì)于促進(jìn)化學(xué)和材料工業(yè)向綠色和清潔化方向發(fā)展具有重要的意義。

自1984年首次報(bào)道酶促合成脂肪族聚酯以來，酶促聚合技術(shù)得到了快速發(fā)展，取得了許多重要的成果。目前，氧化還原酶、水解酶、轉(zhuǎn)移酶均成功應(yīng)用于聚合反應(yīng)，其中氧化還原酶被用來催化芳香族化合物的氧化聚合和烯烴的自由基聚合，轉(zhuǎn)移酶被用來催化合成多糖和聚酯，水解酶被用來催化制備多糖、聚碳酸酯和聚硫酯等。本文將著重介紹脂肪酶催化聚合、酶促可逆失活自由基聚合及酶促化學(xué)偶聯(lián)聚合方面的研究進(jìn)展，并討論了當(dāng)前研究的局限及未來發(fā)展方向。

1 脂肪酶催化聚合反應(yīng)研究

脂肪酶（lipase，EC 3.1.1.3），是一類水解由有機(jī)酸和醇形成的酯鍵或類酯鍵（羧酯鍵、硫酯鍵、酰胺鍵）的酶類，其主要生理功能包括參與脂質(zhì)代謝、信號(hào)傳導(dǎo)以及維持生物膜結(jié)構(gòu)的完整性。除了能夠催化甘油酯類的水解和合成外，還能夠用于催化酯交換反應(yīng)、表面活性劑及聚合物的合成等。脂肪酶催化的聚合反應(yīng)包括縮聚反應(yīng)（polycondensation）和開環(huán)聚合（ring-opening polymerization）兩大類［1］（圖1）。

Fig. 1 Two major routes of lipase-catalyzed polymersynthesis：ring-opening polymerization（a）and polycondensation（b）圖1 脂肪酶催化聚合物合成兩種途徑：開環(huán)聚合（a）及縮聚反應(yīng)（b）

1.1 酶促縮聚反應(yīng)

縮聚反應(yīng)是最常見的一種合成聚合物的方法，它可以方便地控制聚合物主鏈的結(jié)構(gòu)，達(dá)到對(duì)聚合物進(jìn)行改性的目的。與開環(huán)聚合相比，縮聚反應(yīng)在單體的合成及選擇范圍上具有明顯的優(yōu)勢(shì)。酶促縮聚反應(yīng)依據(jù)單體類型可以分為羥基酸/酯型（A-B型單體）的縮聚及二元酸/酯和二元醇（AA-BB 型單體）的縮聚［4］。

A-B型單體是指末尾兩端的基團(tuán)互不相同且可以互相反應(yīng)的單體。這類反應(yīng)的優(yōu)勢(shì)在于，無需像AA-BB 型縮聚反應(yīng)中控制單體比例為嚴(yán)格的1∶1否則難以獲得高分子質(zhì)量聚合產(chǎn)物。脂肪酶能夠有效催化多種不同鏈長(zhǎng)羥基酸/酯底物的縮聚反應(yīng)，如6-羥基己酸、10-羥基癸酸、16-羥基十六烷酸、18-羥基十八烷酸、3-羥基丙酸甲酯和環(huán)氧蓖麻油酸甲酯等［5］。AA-BB 型縮聚反應(yīng)根據(jù)單體及反應(yīng)類型的差異，可以分為酯化和轉(zhuǎn)酯縮聚兩類，前者反應(yīng)過程中有水分子的生成，必須采用減壓或者添加分子篩的策略才能獲得高的反應(yīng)轉(zhuǎn)化率和產(chǎn)物分子質(zhì)量。該類酶促聚合反應(yīng)所制備的材料，由于結(jié)構(gòu)與和性能的可調(diào)控性，成功應(yīng)用于藥物/基因的可控遞送與釋放，如碳酸二乙酯與1,8-辛二醇/三（羥甲基）乙烷［6］、癸二酰氯和N-甲基二乙醇胺［7］、L-谷氨酸二甲酯鹽酸鹽與2,2-（二羥甲基）丙基-三丁基溴化鏻/1,4-丁二醇等［8］。

1.2 酶促開環(huán)聚合

酶促開環(huán)聚合反應(yīng)由于不生成離去的副產(chǎn)物，因而容易獲得高分子質(zhì)量、分布均一的聚合物，同時(shí)開環(huán)聚合反應(yīng)可以通過對(duì)引發(fā)劑和終止劑的控制來制備末端官能化的聚合物以及進(jìn)行多種單體的共聚反應(yīng)來賦予聚合物多種特性，因此開環(huán)聚合反應(yīng)在酶促聚合研究與開發(fā)中備受重視。良好的生物可降解性及其單體的易得性，使得環(huán)狀內(nèi)酯在酶促開環(huán)聚合反應(yīng)中研究最為普遍，成為酶促開環(huán)聚合反應(yīng)的代表類型。

酶促開環(huán)聚合反應(yīng)中，β-丙內(nèi)酯、（±）-α-甲基-β-丙內(nèi)酯、β-丁內(nèi)酯、β-蘋果酸內(nèi)酯、δ-戊內(nèi)酯、ε-己內(nèi)酯、8-辛內(nèi)酯、十一內(nèi)酯、十二內(nèi)酯、十五內(nèi)酯、十六內(nèi)酯、1,4-二氧六環(huán)酮、1,3-二氧六環(huán)酮等單體的聚合均獲得了良好的效果［9］。同時(shí)，在化學(xué)催化劑無法聚合的γ-丁內(nèi)酯上也取得了一定的進(jìn)展，酶促聚合能夠獲得數(shù)均分子質(zhì)量（number-average molecular weight，Mn）為800 g/mol左右的寡聚物［10］。值得一提的是，傳統(tǒng)的金屬催化劑催化大環(huán)內(nèi)酯類單體的聚合僅能獲得寡聚物，而酶促聚合無論在催化速率還是在產(chǎn)物分子質(zhì)量上都遠(yuǎn)遠(yuǎn)優(yōu)于傳統(tǒng)金屬催化劑［11］。

多種來源的脂肪酶及酯酶成功應(yīng)用于酶促開環(huán)聚合反應(yīng)，如南極假絲酵母（Candida antarctica）、黑 曲 霉（Aspergillus niger）、褶皺假絲酵母（Candida rugosa）、熒光假單胞菌（Pseudomonas fluorescence）、洋蔥假單胞菌（Pseudomonas cepacia）、特異腐質(zhì)霉（Humicola insolens）等微生物來源的脂肪酶/酯酶以及豬胰脂肪酶等［12-13］。其中，應(yīng)用最為廣泛的為固定于聚丙烯酸樹脂的Candida antarctica脂肪酶B（Novozym 435）。然而，酶促聚合仍存在酶在有機(jī)介質(zhì)和高溫條件下催化活力及穩(wěn)定性差、難于實(shí)現(xiàn)與化學(xué)催化技術(shù)的一步偶聯(lián)等問題。因此，開發(fā)新型高催化活力和穩(wěn)定性的酶催化劑對(duì)于酶促聚合反應(yīng)是十分必要的。該團(tuán)隊(duì)從來源于極端環(huán)境中的嗜熱菌閃爍古生球菌（Archaeoglobus fulgidus）和多節(jié)閃爍桿菌（Fervidobacterium nodosum）中成功釣取了嗜熱酯酶基因AFEST和FNE，以ε-己內(nèi)酯的開環(huán)聚合為模型，實(shí)現(xiàn)了聚酯類材料的合成［14-15］（圖2）。該過程中，反應(yīng)單體轉(zhuǎn)化率接近100%，合成產(chǎn)物Mn低于2 500 g/mol，有望作為聚氨酯的軟段部分及藥物遞送載體；以單底物一級(jí)動(dòng)力學(xué)為模型，深入探討了酶促聚合反應(yīng)的Michaelis-Menten 動(dòng)力學(xué)，結(jié)果顯示，兩種嗜熱酯酶均對(duì)單體ε-己內(nèi)酯具有更強(qiáng)的結(jié)合能力（Km值分別為0.093和0.35 mol/L，遠(yuǎn)小于Novozym 435（Km=0.72 mol/L））；計(jì)算機(jī)輔助分子模擬技術(shù)證明，嗜熱酯酶與單體ε-己內(nèi)酯形成了更為穩(wěn)定的氫鍵網(wǎng)絡(luò)，二者具有更低的相互作用能。利用嗜熱酯酶FNE 在細(xì)胞膜上嵌合表達(dá)的特點(diǎn)，以嗜熱酯酶FNE 工程菌全細(xì)胞和細(xì)胞碎片自固定化酶為催化劑，同樣實(shí)現(xiàn)了聚合物材料的高效合成，上述催化劑較游離酶展示出更高的催化聚合活性、熱穩(wěn)定性、有機(jī)溶劑抗性及操作穩(wěn)定性等［16-17］。

Fig. 2 The 3D structure of AFEST（a）and FNE（b）used in polymer synthesis圖2 應(yīng)用于聚合物合成的嗜熱酯酶AFSET（a）及FNE（b）結(jié)構(gòu)

2 酶促可逆失活自由基聚合

自Staudinger 提出高分子線鏈學(xué)說以來，高分子學(xué)科在過去一個(gè)世紀(jì)蓬勃發(fā)展，聚合物材料幾乎被用于現(xiàn)代生活的各個(gè)領(lǐng)域。越來越多的研究表明，精確控制聚合物的分子質(zhì)量、分散度和拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)對(duì)提高材料的性能起著決定性的作用。烯烴的自由基聚合產(chǎn)物占工業(yè)聚合物的40%~50%，但傳統(tǒng)自由基聚合慢引發(fā)、速終止的缺陷，限制了對(duì)聚合物結(jié)構(gòu)參數(shù)的控制。與之相比，以可逆加成-斷裂鏈轉(zhuǎn)移聚合（reversible addition-fragmentation chain transfer polymerization，RAFT）和原子轉(zhuǎn)移自由基聚合（atom transfer radical polymerization，ATRP）為代表的可逆失活自由基聚合（reversible deactivation radical polymerization，RDRP）通過控制活性鏈和休眠鏈之間的平衡，使每條聚合物鏈幾乎同步增長(zhǎng)，同時(shí)通過降低自由基濃度來減弱雙基終止和不可逆的鏈轉(zhuǎn)移，解決了傳統(tǒng)自由基聚合的上述弊端［18-19］。

面對(duì)能源危機(jī)和環(huán)境污染兩大社會(huì)問題，綠色化學(xué)的概念應(yīng)運(yùn)而生。RDRP 的催化/引發(fā)方式也在發(fā)生變化，經(jīng)歷著從傳統(tǒng)的熱引發(fā)和金屬催化向以更綠色、環(huán)保的方式實(shí)施RDRP的轉(zhuǎn)變。其中酶促RDRP因其獨(dú)特的溫和、高效、耐氧等優(yōu)點(diǎn)引起了化學(xué)家和生物學(xué)家的極大興趣。相對(duì)于酶促開環(huán)聚合和縮聚反應(yīng)，酶促RDRP 的發(fā)展只有十余年，但這一領(lǐng)域已經(jīng)取得了令人興奮的進(jìn)展［20-21］。本部分將結(jié)合酶促RDRP相關(guān)研究報(bào)道，重點(diǎn)介紹酶促RAFT和ATRP的研究進(jìn)展。

2.1 酶促RAFT聚合

2.1.1酶催化除氧的RAFT聚合

與傳統(tǒng)自由基聚合一樣，RDRP也存在易被氧氣猝滅的弊端，在RDRP開始之前需要采用惰性氣體（如氮?dú)饣驓鍤猓┐祾呋蛘呃鋬鼋鈨霰醚h(huán)技術(shù)將氧氣去除［22-23］。繁瑣的物理除氧步驟限制了RDRP 研發(fā)的效率，增加了操作成本，不利于將RDRP“從實(shí)驗(yàn)室躍上生產(chǎn)線”，解決RDRP不耐氧的缺陷對(duì)推動(dòng)高分子科學(xué)的研究具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。很早之前生物學(xué)家就注意到氧化酶在氧化底物的同時(shí)，將氧氣還原為H2O2。他們利用葡萄糖氧化酶（GOx）在有氧條件下能專一性地催化β-D-葡萄糖生成葡萄糖酸和H2O2的特點(diǎn)，來消耗溶液中的氧氣，但是直到2014 年，酶催化除氧才被用在RDRP 領(lǐng) 域。Stevens 課 題 組［24］在進(jìn)行熱引 發(fā)RAFT聚合的過程中，通過添加GOx和葡萄糖來消耗溶解在溶液中的氧氣。他們發(fā)現(xiàn)GOx 具有出色的除氧能力，即使在敞口反應(yīng)瓶中，僅需加入0.1~ 0.25 μmol/L 的GOx 就能保證聚合順利進(jìn)行。此外，GOx還具有較高的溫度和有機(jī)溶劑耐受性，在添加80%的正丁醇或乙腈的PBS 中，在45℃下聚合150 min之后，酶的活性幾乎沒有降低。

由于GOx 的魯棒性和出色的除氧能力，成為酶促RDRP中最常用的除氧酶。在測(cè)試的復(fù)雜溶劑中，通過RAFT聚合所獲得的聚丙烯酸羥乙酯都具有較低的分散度（?≤1.2）和較高的端基保真度。當(dāng)使用GOx 在高溫下或毒性較大的溶劑（如N,N-二甲基甲酰胺（DMF））中進(jìn)行除氧時(shí)，可采用固定化酶的方法提高酶的溫度和有機(jī)溶劑耐受性。Yuan 等［25］使用金屬有機(jī)框架ZIF-8 將GOx 進(jìn)行封裝，測(cè)試發(fā)現(xiàn)在DMF與水（1∶1）的混合溶劑中，將溶液加熱到80℃后，相對(duì)于初始的游離酶，GOx的相對(duì)活性高達(dá)73.7%。GOx高的除氧效率使在更復(fù)雜、除氧更困難的反應(yīng)裝置中進(jìn)行RAFT聚合成為了可能。相較于瓶式反應(yīng)器，在多孔板中進(jìn)行RAFT聚合更加困難，這是因?yàn)榫酆先芤旱目諝饨佑|面積與溶液體積的比值更大，溶液體積更小，對(duì)氧氣更敏感。Stevens 課題組［26］使用GOx 除氧，實(shí)現(xiàn)了僅需40 μl 聚合溶液的低體積耐氧性高通量RAFT 聚合。Tan 等［27］將GOx 除氧的高通量聚合用于聚合誘導(dǎo)自組裝來制備具有不同形貌的聚合物膠體粒子，相較于Stevens 課題組采用的熱引發(fā)方式，該研究采取的引發(fā)方式是光引發(fā)。連續(xù)流聚合除氧更加繁瑣，往往需要先在反應(yīng)瓶中除氧，然后將聚合溶液轉(zhuǎn)移到進(jìn)樣針中，這降低了實(shí)驗(yàn)成功的概率。最近，Cai 等［28］將GOx 除氧的聚合誘導(dǎo)自組裝體系擴(kuò)展到連續(xù)流聚合中，用于大規(guī)模制備聚合物納米顆粒。

除了使用GOx 除氧之外，其他更有特色的酶催化除氧RAFT聚合體系也嶄露頭角。該研究團(tuán)隊(duì)先后將吡喃糖氧化酶（P2Ox） 和甲酸氧化酶（FOx）用于除去RAFT 聚合體系中的氧氣［29-30］。相較于GOx，P2Ox 具有更廣的底物范圍，對(duì)葡萄糖和氧氣的親和力更高。重要的是，其催化葡萄糖除氧生成的2-脫氫-D-葡萄糖具有更強(qiáng)的抗水解能力，不會(huì)降低溶液的pH值。FOx的底物甲酸僅有1個(gè)碳原子，更加具有原子經(jīng)濟(jì)性，F(xiàn)Ox催化甲酸氧化產(chǎn)生的CO2很容易從聚合體系中排出，不會(huì)造成廢料的積累［31］。隨著研究的深入和對(duì)酶催化機(jī)理的了解，越來越多的氧化酶將會(huì)被用于RAFT 聚合，針對(duì)不同的體系，選擇合適的酶進(jìn)行除氧是十分必要的。

2.1.2酶催化引發(fā)的RAFT聚合

在所有的RDRP 中，RAFT 聚合體系的組成最接近傳統(tǒng)自由基聚合，外源自由基的加入是必需的（光裂解RAFT試劑引發(fā)的聚合除外）。因此，對(duì)于酶催化除氧的RAFT聚合來說，往往需要與其他的引發(fā)方式（如熱引發(fā)、光引發(fā)）相結(jié)合。在這些聚合體系中，酶僅僅是用來除氧，不涉及到產(chǎn)生引發(fā)物種。對(duì)于利用氧化酶除氧產(chǎn)生的H2O2與其他化學(xué)反應(yīng)（如芬頓反應(yīng)、氧化還原反應(yīng)）級(jí)聯(lián)的體系，將其歸類為酶催化除氧的RAFT 聚合更加合適，這是因?yàn)檫@些體系沒有利用酶的催化功能產(chǎn)生引發(fā)物種［32］。目前酶催化引發(fā)的RAFT 聚合包括使用辣根過氧化物酶（HRP）催化的RAFT聚合和光酶催化RAFT聚合。

HRP 是一種含血紅素的金屬蛋白，其以H2O2或烷基過氧化物為氧化劑，催化酚、苯胺和β-二酮等化合物的氧化反應(yīng)［33］，如HRP催化H2O2對(duì)乙酰丙酮的氧化反應(yīng)，產(chǎn)生的乙酰丙酮自由基可以釋放到酶外，引發(fā)自由基聚合。雖然這一過程很早就被研究并用于傳統(tǒng)自由基聚合，但是直到2015 年，第一例酶催化引發(fā)的RAFT 聚合才被報(bào)道。Zhang等［34］使用HRP/H2O2/乙酰丙酮三元引發(fā)體系，在合適的鏈轉(zhuǎn)移劑存在下，首次實(shí)現(xiàn)了高效、可控的酶催化RAFT聚合。需要指出的是，這一催化體系不具有氧氣耐受性，聚合開始之前需要使用氮?dú)獯祾叩姆绞竭M(jìn)行除氧。此后，該研究團(tuán)隊(duì)巧妙地將酶除氧與酶催化引發(fā)結(jié)合，先后發(fā)展了GOx-HRP、P2Ox-HRP、FOx-HRP級(jí)聯(lián)催化體系［29-30］（圖3）。相較于外加引發(fā)劑的方式，酶催化可以連續(xù)穩(wěn)定的產(chǎn)生低濃度的自由基，這對(duì)多嵌段聚合物和超高分子質(zhì)量聚合物的獲取是至關(guān)重要的。利用P2Ox-HRP級(jí)聯(lián)催化體系，在開口反應(yīng)瓶中合成了十嵌段聚合物；在封閉反應(yīng)瓶中，無需事先除氧，獲得了控制良好的超高分子質(zhì)量聚合物（Mn=2 003 kg/mol，?=1.35）。利用FOx-HRP 級(jí)聯(lián)催化體系，以高通量的方式在多孔板中合成了不同結(jié)構(gòu)的超高分子質(zhì)量聚合物，最低溶液體積僅為50 μl。

Fig. 3 Enzymatic cascade catalysis for RAFT polymerization圖3 雙酶級(jí)聯(lián)催化RAFT聚合

原葉綠素氧化還原酶、DNA 光解酶和脂肪酸光脫羧酶是迄今為止發(fā)現(xiàn)的三種天然光酶（光依賴性酶）［35-37］。光酶催化兼具光催化和酶催化的雙重優(yōu)勢(shì)，激發(fā)了非天然光酶催化自由基有機(jī)合成和高分子合成的發(fā)展。該研究團(tuán)隊(duì)將常見的黃素蛋白（GOx 和P2Ox）轉(zhuǎn)化為光酶，合成了幾類目前RDRP領(lǐng)域具有挑戰(zhàn)的聚合物，如基于非共軛單體的超高分子質(zhì)量聚合物和星形聚合物［38-40］。光酶催化RAFT聚合的機(jī)理如下：在無氧狀態(tài)下，GOx或P2Ox 的輔因子FAD 被葡萄糖完全還原為FADH-，其被光激發(fā)后變?yōu)檫€原性更強(qiáng)的FADH-*，F(xiàn)ADH-*可以將電子轉(zhuǎn)移給RAFT 試劑/單體，從而引發(fā)RAFT聚合。即使聚合體系存在氧氣，GOx也可以通過其天然的除氧功能將其耗盡，使用氧氣探針測(cè)試發(fā)現(xiàn)，使用GOx 除氧可以使溶液中的氧氣降低為接近于用氮?dú)庵脫Q的水平。當(dāng)氧氣被完全消耗之后，過量的葡萄糖依舊可以還原FAD，因此該光酶催化體系具有氧氣耐受性。這種催化方法，不僅適用于溶液聚合，也適用于包括分散聚合和乳液聚合在內(nèi)的異相聚合。

目前適用于引發(fā)RAFT 聚合的酶的種類較少，僅有上述2 種引發(fā)方式。其他類型的酶催化反應(yīng)，若是能產(chǎn)生自由基引發(fā)物種，也有望被用于引發(fā)RAFT聚合。

2.2 酶促ATRP反應(yīng)

2.2.1酶催化除氧的ATRP反應(yīng)

ATRP 通過可逆失活建立活性鏈與休眠鏈之間的平衡，原則上適用于RAFT體系的氧化酶都可以被用來去除ATRP 體系的中的氧氣。需要注意的是，在ATRP體系中，氧化酶除氧產(chǎn)生的H2O2可以氧化CuI，通過類芬頓反應(yīng)產(chǎn)生羥基自由基引發(fā)新的鏈生成。例如，Enciso 等［41］在利用GOx 除氧時(shí)，發(fā)現(xiàn)所得聚合物的Mn是理論值的1/4左右。在加入丙酮酸鈉之后，所得聚合物的分子質(zhì)量與理論分子質(zhì)量接近，聚合得到了良好的控制。這是因?yàn)楸徕c與H2O2反應(yīng)，生成了水和CO2，避免了羥基自由基的產(chǎn)生，H2O2的濃度對(duì)ATRP的影響以及丙酮酸鈉清除H2O2的限度還有待進(jìn)一步研究。這種以丙酮酸鈉作為犧牲試劑的酶催化除氧的方式，不僅適用于引發(fā)劑持續(xù)再生催化劑（ICAR）的ATRP， 也適用于電化學(xué)介導(dǎo)的 ATRP（eATRP）［42］。借 助 于GOx催化除氧的ATRP，Navarro等［43］制備了一系列生物醫(yī)學(xué)相關(guān)的聚合物刷，并測(cè)試了它們對(duì)人血漿的防污性能，結(jié)果表明，在GOx 存在的情況下制備的涂層比不含GOx時(shí)制備的涂層會(huì)排斥更多的血漿蛋白。

除了采用化學(xué)的方法（添加丙酮酸鈉）去除酶催化除氧ATRP 體系中產(chǎn)生的H2O2，Enciso 等［44］還巧妙地將GOx 除氧與HRP 催化級(jí)聯(lián)起來。該體系中，利用HRP 催化H2O2氧化乙酰丙酮產(chǎn)生的乙酰丙酮自由基將CuII/L 還原為CuI/L，成功實(shí)現(xiàn)了酶級(jí)聯(lián)催化的ICAR ATRP（圖4a）。在這種情況下，氧氣成了不可或缺的“燃料”，只有體系中存在氧氣才能有效驅(qū)動(dòng)ICAR ATRP。當(dāng)體系中的氧氣被排凈之后，聚合就會(huì)停止；當(dāng)再次通入空氣之后，聚合可以重新啟動(dòng)。這種通過切換體系的氧氣濃度來從時(shí)間上操控聚合的現(xiàn)象是十分有趣的。

Fig. 4 Enzyme-engaged ATRP圖4 酶促ATRP反應(yīng)

目前用于ATRP體系的氧化酶僅限于GOx，其他在RAFT 領(lǐng)域已被應(yīng)用的氧化酶如P2Ox 和FOx尚未被用于ATRP?？梢灶A(yù)見的是，這些酶是適用于在ATRP 中進(jìn)行除氧的。但是，將這些酶用于ATRP 需要考慮其經(jīng)濟(jì)因素和現(xiàn)實(shí)意義，當(dāng)前需要解決的問題是氧化酶除氧產(chǎn)生的H2O2會(huì)與CuI發(fā)生反應(yīng)的問題。隨著更多的化學(xué)方法或者生物催化體系被引入到酶除氧的ATRP體系中，這一困境將會(huì)被打破。

2.2.2酶催化ATRP反應(yīng)

事實(shí)上酶催化在RDRP領(lǐng)域中最早的應(yīng)用就是利用金屬酶去催化ATRP［45］。傳統(tǒng)的ATRP 依賴于使用過渡金屬（如Cu 和Fe）絡(luò)合物作為催化劑來實(shí)現(xiàn)聚合物鏈-鹵化物的可逆失活。大多金屬蛋白也含有金屬的催化中心，這一共同特征表明金屬蛋白可被用于催化ATRP［20］（圖4b）。2011年，Bruns課題組［46］和di Lena 課題組［47］幾乎同時(shí)報(bào)道了使用金屬酶催化電子轉(zhuǎn)移活化再生催化劑（ARGET）的ATRP工作，實(shí)現(xiàn)了N-異丙基丙烯酰胺、聚乙二醇甲基丙烯酸酯和聚乙二醇丙烯酸酯等水溶性單體的可控聚合。

目前被用來催化ATRP反應(yīng)的酶包括HRP、血紅蛋白、漆酶、過氧化氫酶等。與傳統(tǒng)的過渡金屬配合物不同，這些酶的金屬催化中心緊密結(jié)合在酶內(nèi)，使金屬不易釋放到溶液中，從而最大限度地減少了重金屬污染聚合物的可能性。例如，N-乙烯基咪唑（NVIm）很難使用傳統(tǒng)的ATRP 方法進(jìn)行聚合，一方面是因?yàn)樵搯误w聚合的活性低，更主要是因?yàn)镹VIm 和聚合后生成的PNVIm 都容易與金屬離子結(jié)合，導(dǎo)致金屬從ATRP 催化劑中剝離［48］。Bruns 課題組［49］利用漆酶催化的ATRP 實(shí)現(xiàn)了NVIm的可控聚合，這是因?yàn)槠崦钢械你~離子與蛋白質(zhì)結(jié)合成銅蛋白的形式存在，避免了NVIm 和PNVIm 與其結(jié)合。聚合結(jié)束之后，漆酶可以通過簡(jiǎn)單的純化步驟從聚合物中定量去除，得到純凈的PNVIm。基于該仿生組裝的理念，Jiang等［50］實(shí)現(xiàn)了具有過氧化物酶活性的次鐵血紅素六肽（DhHP-6）在金屬有機(jī)框架材料中的組裝，該組裝體不僅具有良好的過氧化物酶活性，同時(shí)能夠高效催化ATRP反應(yīng)，合成產(chǎn)物Mn高達(dá)為45 900 g/mol，多分散性為1.27（圖5）。該催化體系不僅具有良好的操作穩(wěn)定性和循環(huán)使用能力，更重要的是，有效避免了ATRP 反應(yīng)中金屬催化劑的痕量殘留與潛在毒性，在生物醫(yī)用高分子材料領(lǐng)域中展示了較化學(xué)催化體系更為顯著的優(yōu)勢(shì)。此外，通過接枝反應(yīng)將血紅素接枝于金屬有機(jī)框架材料表面所構(gòu)建的人工酶分子，同樣展示出良好的ATRP催化活性，合成產(chǎn)物Mn高達(dá)33 200 g/mol，同時(shí)該人工酶分子自身所具有的過氧化物酶活性，能夠有效催化廢水中酚類污染物的降解，在生物環(huán)保領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景［51-52］。

酶催化ATRP 的研究已經(jīng)取得了初步的進(jìn)展，但是目前使用金屬酶催化ATRP所得聚合物的分子質(zhì)量較低（Mn<10 000 g/mol），分散度較大。這是因?yàn)樵诰酆线^程中，聚合物鏈需要進(jìn)入酶的催化中心，隨著聚合的進(jìn)行，聚合物鏈不斷增長(zhǎng)，導(dǎo)致其進(jìn)入酶催化中心的難度不斷增大，使聚合失去控制。隨著對(duì)聚合機(jī)理的不斷研究，以及對(duì)蛋白質(zhì)工程對(duì)酶催化性能的提升，酶催化ATRP將會(huì)更容易得到控制良好的聚合物。

Fig. 5 ATRP reaction using DhHP-6 nanobiocatalyst圖5 DhHP-6組裝體催化ATRP反應(yīng)

3 酶促化學(xué)偶聯(lián)構(gòu)建聚合物材料

3.1 酶促聚合與化學(xué)聚合反應(yīng)偶聯(lián)

隨著科學(xué)的發(fā)展及相關(guān)領(lǐng)域需求的不斷推進(jìn)，對(duì)聚合物結(jié)構(gòu)和功能的要求也在不斷提升，進(jìn)而對(duì)聚合物結(jié)構(gòu)和材料制備方法也提出了更高的要求，如今單一結(jié)構(gòu)與功能的均聚物材料已難以滿足生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域日益增長(zhǎng)的多樣化需求。并行串聯(lián)聚合是基于多種聚合反應(yīng)的一次性或同時(shí)一鍋法串聯(lián)的新型聚合方法，該方法常被用于制備復(fù)雜結(jié)構(gòu)和功能的聚合物，代表一種高效和經(jīng)濟(jì)的綠色合成策略。其中，ATRP與酶促聚合反應(yīng)的偶聯(lián)是被研究最為廣泛的串聯(lián)反應(yīng)之一［53］。酶促聚合與ATRP 反應(yīng)的偶聯(lián)得益于雙功能引發(fā)劑的加入，Br 原子引發(fā)ATRP 反應(yīng)，末端羥基則驅(qū)動(dòng)酶促聚合反應(yīng)的進(jìn)行，其可以通過級(jí)聯(lián)或者一鍋法模式進(jìn)行反應(yīng)，制備具有特殊結(jié)構(gòu)與性能的多嵌段聚合物（圖6）。Zhang等［54］以2,2,2-三氯乙醇作為引發(fā)劑，成功實(shí)現(xiàn)酶促ε-己內(nèi)酯開環(huán)聚合反應(yīng)和苯乙烯ATRP反應(yīng)的偶聯(lián)，制備了ABA2-型（Y 型）三嵌段共聚物。Wei 和Tao 研究團(tuán)隊(duì)［55-58］利用ATRP/光控聚合等技術(shù)構(gòu)建了多種多組分聚合體系，應(yīng)用于功能共聚物或光學(xué)活性聚合物的制備，包括點(diǎn)擊-化學(xué)酶法ATRP、化學(xué)-酶催化酯交換反應(yīng)與ATRP 或RAFT組合以及酶促手性拆分反應(yīng)與ATRP組合等。所有這些串聯(lián)聚合體系都可用于制備多官能度、組成和結(jié)構(gòu)復(fù)雜的聚合物，酶促聚合與化學(xué)聚合偶聯(lián)反應(yīng)將有助于改善復(fù)雜大分子制備過程從而拓寬聚合物的應(yīng)用范圍。

Fig. 6 Polymer synthesis through the combination of enzymatic ring-opening polymerization and ATRP圖6 酶促開環(huán)聚合與ATRP反應(yīng)偶聯(lián)合成聚合物

開環(huán)易位聚合 （ring-opening metathesis polymerization，ROMP）是合成烯烴聚合物的有效手段同時(shí)是烯烴易位反應(yīng)的重要組成部分。Xiang等［59］首次利用烯醇/烯酯作為ROMP鏈轉(zhuǎn)移劑，制備了具有端羥基/端酯基的功能化遙爪型聚合物，隨后將之作為大分子引發(fā)劑引發(fā)酶促開環(huán)聚合反應(yīng)制備嵌段共聚物。值得注意的是，酶促聚合反應(yīng)中通常以水、醇、胺等分子作為鏈引發(fā)劑，而該研究證明，高分子鏈端酯基同樣可以作為引發(fā)劑引發(fā)酶促開環(huán)聚合，避免了中間產(chǎn)物的分離與純化?；阪溎┒缩セ梢砸l(fā)酶促開環(huán)聚合反應(yīng)這一新發(fā)現(xiàn)，該研究團(tuán)隊(duì)建立了“一鍋法”偶聯(lián)酶促開環(huán)聚合與ROMP 構(gòu)建嵌段聚合物的策略［60］（圖7），為功能高分子材料的合成與改性提供了新的途徑。

除了與活性/可控聚合偶聯(lián)之外，酶促聚合反應(yīng)也被用來與其它化學(xué)反應(yīng)構(gòu)建結(jié)構(gòu)明確的聚合物，例如Ates等［61］通過酶促開環(huán)聚合制備了不飽和聚酯，接著通過硫醇-烯鍵點(diǎn)擊化學(xué)將該聚酯側(cè)鏈中雙鍵官能化，這種組合方法提供了一種簡(jiǎn)便的聚酯修飾策略方法。

Fig. 7 Synthesis of block copolymers through the combination of enzymatic ring-opening polymerization and ROMP in a cascade or one-pot manner圖7 級(jí)聯(lián)及一步模式組合酶促開環(huán)聚合與ROMP合成嵌段聚合物

3.2 酶促合成產(chǎn)物的生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用研究

由于酶促聚合反應(yīng)制備的生物醫(yī)用高分子材料不存在金屬催化劑的痕量殘留，細(xì)胞及動(dòng)物水平研究均表明，酶促聚合所制備的聚合物材料具有良好的相容性，體內(nèi)應(yīng)用時(shí)能夠避免引起炎癥反應(yīng)，同時(shí)材料的疏水特性又能夠顯著增強(qiáng)藥物及基因的遞送能力。因此，酶促合成高分子材料的生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用，是提高合成產(chǎn)物附加值、推動(dòng)產(chǎn)物合成產(chǎn)業(yè)化與臨床醫(yī)用的關(guān)鍵。

2011年，Zhou等［62］首次利用Novozym 435為催化劑，以內(nèi)酯、癸二酸二乙酯、N-甲基二乙醇胺為單體，通過開環(huán)聚合和縮聚反應(yīng)相偶聯(lián)的模式成功構(gòu)建了聚氨酯材料，該材料在體外基因轉(zhuǎn)染及體內(nèi)基因治療均取得了優(yōu)于商業(yè)化轉(zhuǎn)染試劑的作用效果。在此基礎(chǔ)上，多個(gè)研究團(tuán)隊(duì)通過單體衍生化及聚合物的修飾改性等策略，制備了多種修飾型聚氨基酯及其共聚物，并成功應(yīng)用于藥物遞送［63］、核酸分子［64-65］及mRNA 遞送［66］等。在此基礎(chǔ)上，該研究團(tuán)隊(duì)以N-甲基二乙醇胺、辛二酸二乙酯、ω-環(huán)十五內(nèi)酯為單體，通過酶促開環(huán)聚合與縮聚偶聯(lián)的策略構(gòu)建了陽離子聚酯材料，之后通過化學(xué)接枝的策略在該材料的側(cè)鏈上引入膽固醇分子，成功構(gòu)建了兩親性膽固醇-g-聚酯共聚物，以該聚合物材料為載體進(jìn)行miR-23b 及p53 基因的遞送，通過p53、miR-23b 的高效、穩(wěn)定、靶向傳輸，實(shí)現(xiàn)了對(duì)腫瘤增殖、遷移與浸潤(rùn)的高效抑制［67-69］，為基于具有抗腫瘤核酸分子遞送構(gòu)建腫瘤靶向基因傳輸體系奠定了良好的基礎(chǔ)（圖8）。

Fig. 8 Chemoenzymatic synthesis of cholesterol-g-poly（amine-co-ester）for miR-23b delivery圖8 酶促化學(xué)偶聯(lián)制備膽固醇-聚氨酯載體介導(dǎo)miR-23b遞送研究

4 總結(jié)與展望

伴隨著酶催化機(jī)制認(rèn)識(shí)的深入及新興研究手段的應(yīng)用，酶促聚合技術(shù)得到了長(zhǎng)足的發(fā)展，取得了許多重要的研究成果。然而，酶促聚合仍然存在酶制劑成本過高、活力和穩(wěn)定性不足、合成產(chǎn)物結(jié)構(gòu)單一及應(yīng)用范圍有限等弊端，目前該技術(shù)尚處于研究開發(fā)階段，距離大規(guī)模的工業(yè)化生產(chǎn)還有相當(dāng)大的距離。當(dāng)前酶促聚合技術(shù)存在的主要瓶頸如下：

a. 酶制劑催化活性和穩(wěn)定性不足，成本高昂。當(dāng)前酶促聚合研究中所采用的催化劑主要是來源于Candida antarctica脂肪酶的固定化形式Novozym 435，其在苛刻的聚合催化反應(yīng)中仍然面臨活性、穩(wěn)定性及重復(fù)利用能力方面的難題，同時(shí)合成過程中催化劑的用量很高（>5%wt）。因此，開發(fā)新型適用于聚合反應(yīng)的酶制劑，對(duì)于解決催化過程中活性、穩(wěn)定性、成本等關(guān)鍵制約因素具有重要的意義，同時(shí)也有助于打破發(fā)達(dá)國家的技術(shù)壟斷，切實(shí)解決綠色生物制造中的關(guān)鍵“卡脖子”難題。

b. 單體及合成產(chǎn)物結(jié)構(gòu)與性能單一。當(dāng)前酶促聚合技術(shù)的類型主要有開環(huán)聚合及縮聚兩類，單體范圍極其有限，導(dǎo)致合成產(chǎn)物結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，無法實(shí)現(xiàn)在生物醫(yī)用材料領(lǐng)域中的廣泛應(yīng)用。因此，將酶促聚合技術(shù)與特殊化學(xué)聚合技術(shù)（ATRP 反應(yīng)、ROMP反應(yīng)及RAFT聚合等）相偶聯(lián)，通過級(jí)聯(lián)催化及“一鍋法”的模式，能夠更好地實(shí)現(xiàn)對(duì)高分子材料的結(jié)構(gòu)修飾與改性，構(gòu)建具有特殊結(jié)構(gòu)與功能的聚合物材料。

c. 酶促聚合產(chǎn)物附加值偏低，應(yīng)用范圍窄。酶促聚合反應(yīng)成本高、產(chǎn)物結(jié)構(gòu)單一等瓶頸，造成了酶促合成高分子材料附加值低、應(yīng)用范圍窄等局限。因此，將合成產(chǎn)物應(yīng)用于高效、安全的重大疾病藥物與基因遞送體系，將有利于提高酶促合成產(chǎn)物的附加值與市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力，并推動(dòng)酶促聚合技術(shù)朝更加綠色、精細(xì)化方向發(fā)展。

酶促聚合是一個(gè)多學(xué)科交叉研究領(lǐng)域，為高分子化學(xué)與物理、生物化學(xué)與分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、藥劑學(xué)等學(xué)科間的溝通架起了橋梁。作為一種新興的聚合方法，酶促聚合為高分子材料的合成開辟了一條全新的、環(huán)境友好的途徑，是高效合成功能高分子材料的有效方法，在醫(yī)藥、環(huán)保乃至國防等方面都有著廣闊的應(yīng)用前景。相信隨著研究的深入，酶促聚合必將實(shí)現(xiàn)關(guān)鍵技術(shù)上的突破，成為未來高分子材料制備的重要策略。